来源：Sequential acclimatization of Bacillus subtilis and Candida rugosa for sustainable bioremediation of wastewater containing cadmium, chromium, and synthetic dyes（Next Bioengineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
工业废水中的重金属与合成染料因毒性强、难降解而严重威胁水生态与公共健康。本研究从德里Najafgarh排水渠采集真实废水，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）与皱褶假丝酵母（Candida rugosa）为双菌体系，通过33小时五阶段序贯驯化策略，逐步提升污染物浓度至重金属100 mg·L⁻¹、染料10 mg·L⁻¹。结果显示，驯化后两菌株最大比生长速率由0.326 h⁻¹升至0.768 h⁻¹，重金属去除率持续高于96%，染料脱色率达80%以上，并伴随超氧化物歧化酶与漆酶活性的显著上调，揭示了从细胞增殖向单细胞解毒代谢转变的关键机制。
研究背景
工业发展与快速城市化加剧了水环境污染，重金属与合成染料是工业废水中最具持久性与危险性的组分，来源涵盖纺织、制革、电镀、电池制造及采矿等行业。镉（Cd²⁺）与铬（Cr³⁺）因在自然界中高度抗生物降解而尤为令人担忧，可通过食物链营养级转移，长期低剂量暴露会导致肾损伤、骨密度下降、癌症及神经系统疾病。与此同时，合成偶氮染料与三苯甲烷染料的大量排放使问题进一步恶化——偶氮染料成本低廉、亲和力高，但对光、热、氧化及生物降解均表现出高度抗性。基于此，开发绿色、可扩展且适应性强的废水综合生物修复工艺已成为迫切需求。
研究方法
2.1 微生物菌株及其维护
实验所用微生物菌株为枯草芽孢杆菌与皱褶假丝酵母，二者在重金属与合成染料的生物吸附和生物降解方面具有已验证的功效。枯草芽孢杆菌（MTCC12）购自印度新德里IIT Delhi；皱褶假丝酵母（NCIM 3591）购自印度浦那国家化学微生物研究所（NCIM）。枯草芽孢杆菌与皱褶假丝酵母的培养物分别初始培养于Luria琼脂和酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂平板上，并于4 °C冷藏保存。每十五天进行传代培养以确保活力并避免衰老。使用Olympus CX-21i光学显微镜（Evident Scientific，日本）在40×放大倍数下观察培养物的纯度和形态。枯草芽孢杆菌培养物通过革兰氏染色技术确认其杆状形态和革兰氏阳性特征，皱褶假丝酵母培养物则通过亚甲蓝染色确认其具有卵形形态的芽殖酵母细胞。培养物的生长行为通过光密度测定和干细胞重量测定来评估。预实验中两种培养物的相似生长模式及其对污染物的耐受性确保了它们适合进一步用于生物吸附和生物降解实验。预培养物通过从新鲜制备的琼脂平板上挑取单菌落培养获得。
【数据】菌株：Bacillus subtilis MTCC12、Candida rugosa NCIM 3591；保存温度：4°C；传代周期：15天；显微镜放大倍数：40×；染色方法：革兰氏染色（细菌）、亚甲蓝染色（酵母）
2.2 发酵培养基及其配方
合成培养基作为发酵培养基的基础，枯草芽孢杆菌与皱褶假丝酵母在其中生长培养，用于生物吸附和生物降解实验。培养基配方由三种不同的储备液组成。盐储备液：75 g (NH₄)₂SO₄溶于500 mL H₂O，28.1 g KH₂PO₄溶于200 mL H₂O，9.3 g MgSO₄·7H₂O溶于100 mL H₂O。维生素储备液：总体积500 mL蒸馏水，含100 mg对氨基苯甲酸（PABA）、12.5 g肌醇、各500 mg烟酸、Ca-泛酸钙、吡哆醇HCl和硫胺素HCl。另将25 mg d-生物素先溶于10 mL 0.1 M NaOH中，再进一步稀释至400 mL蒸馏水。微量金属储备液：制备于200 mL蒸馏水中，含0.6 g EDTA、0.18 g CaCl₂·2H₂O、0.18 g ZnSO₄·7H₂O、0.12 g FeSO₄·7H₂O、40 mg H₃BO₃、31.1 mg MnCl₂·2H₂O、16 mg Na₂MnO₄·2H₂O、12 mg CoCl₂·2H₂O、12 mg CuSO₄·6H₂O和4 mg KI。将确定浓度的额外污染物（Cd²⁺、Cr³⁺、甲基橙、结晶紫或商业染料混合物）添加到该合成培养基中，连同排水渠废水一起制备生物修复研究用培养基。废水（pH 6.0 ± 0.1）采集自新德里Dwarka Sec-16C GGSIPU附近的Najafgarh排水渠（28°36′22″ N；77°00′38″ E；海拔233 m）。废水水样同时检测了重金属和残留硝酸盐，发现Cd²⁺和Cu²⁺浓度各≤0.01 mg·L⁻¹，残留硝酸盐≤0.01 g·L⁻¹。发酵过程中使用的玻璃器皿和培养基在121 °C、15 psi条件下灭菌20 min。为避免污染物受热分解，污染物补充液（重金属和染料）通过0.22 μm无菌针头过滤器单独灭菌，并在冷却后（低于45 °C）无菌添加到已灭菌培养基中。
【数据】盐储备液：(NH₄)₂SO₄ 75 g/500 mL、KH₂PO₄ 28.1 g/200 mL、MgSO₄·7H₂O 9.3 g/100 mL；维生素储备液：PABA 100 mg、肌醇12.5 g、烟酸/泛酸钙/吡哆醇/硫胺素各500 mg、生物素25 mg；微量金属：EDTA 0.6 g、CaCl₂·2H₂O 0.18 g、ZnSO₄·7H₂O 0.18 g、FeSO₄·7H₂O 0.12 g、H₃BO₃ 40 mg、MnCl₂·2H₂O 31.1 mg、Na₂MnO₄·2H₂O 16 mg、CoCl₂·2H₂O 12 mg、CuSO₄·6H₂O 12 mg、KI 4 mg；废水pH：6.0 ± 0.1；灭菌条件：121°C、15 psi、20 min；过滤灭菌：0.22 μm
#### 2.2.1 接种与发酵条件
将处于活跃生长期的枯草芽孢杆菌与皱褶假丝酵母菌株以10%（v·v⁻¹）的比例接种到发酵培养基中。发酵以批次模式在250 mL锥形瓶中进行，工作体积100 mL。培养物在37 °C、轨道摇床150 rpm条件下孵育48 h，或直至生长曲线达到平台期。这些条件提供了混合、通气以及细胞与污染物的充分接触，促进了细胞对污染物的生物吸附和生物降解。在整个发酵过程中定期监测发酵培养培养基中的pH值、生物量和污染物浓度。所开发的好氧葡萄糖限制培养基（1 L）为微生物的生命活动及对污染物的响应提供了有利条件，从而能够正确评估生物修复效率。培养基包含50 mL (NH₄)₂SO₄溶液、25 mL KH₂PO₄溶液、8 mL MgSO₄·7H₂O溶液、10 mL微量金属溶液和1 mL维生素溶液，并含5 g·L⁻¹葡萄糖。选择合成培养基是因为它能有效支持细菌和酵母的生长、制备简单、成本效益高，且适用于生物吸附和生物降解研究。该培养基不含任何可能干扰下游处理阶段重金属离子和染料浓度定量的复杂组分。培养基中缓冲液和稳定营养物质的存在确保了微生物对污染物产生的胁迫具有抗性，使其可用于有效的生物修复过程。每批运行结束后，收集发酵培养基用于进一步评估，同时将10%（v·v⁻¹）的发酵培养基作为下一批运行的接种物。所有添加污染物的培养基在接种前均先检查其澄清度和一致性。此外，还测定了添加污染物后的pH稳定性，因为重金属离子和染料都可能引起缓冲效应或pH偏移。
【数据】接种量：10%（v·v⁻¹）；工作体积：100 mL/250 mL锥形瓶；温度：37°C；转速：150 rpm；时间：48 h或至平台期；葡萄糖：5 g·L⁻¹；培养基组成：50 mL (NH₄)₂SO₄溶液、25 mL KH₂PO₄溶液、8 mL MgSO₄·7H₂O溶液、10 mL微量金属溶液、1 mL维生素溶液
#### 2.2.2 重金属补充
发酵培养基中添加特定浓度的污染物以模拟合成废水。实验中，镉离子（Cd²⁺）以CdCl₂形式引入培养基，铬离子（Cr³⁺）以CrCl₃·6H₂O形式引入。盐类在制备过程中先进行酸化以避免其在水溶液中氧化。实验中使用的两种盐均为分析纯（购自印度新德里Central Drug House），盐溶液使用蒸馏水配制。设置不同批次，每个批次均在锥形瓶中含有合成废水培养基，Cd²⁺和Cr³⁺浓度分别为20 mg·L⁻¹、40 mg·L⁻¹、60 mg·L⁻¹、80 mg·L⁻¹和100 mg·L⁻¹。采用20 mg·L⁻¹的递增梯度，使培养物逐步适应不断升高的重金属水平，避免引起急性细胞毒性、严重氧化应激和细胞死亡。实验中的重金属浓度设计为反映实际工业废水排放 effluent 中观察到的浓度，从而模拟重金属水平升高的真实场景。
【数据】Cd²⁺来源：CdCl₂；Cr³⁺来源：CrCl₃·6H₂O；浓度梯度：20、40、60、80、100 mg·L⁻¹；递增幅度：20 mg·L⁻¹
#### 2.2.3 合成染料补充
研究中使用了四种染料。第一种是甲基橙（由德国Sigma-Aldrich® Solutions供应）（参见图1(a)），一种带有磺酸基团的偶氮染料，具有优异的水溶性和发色团化学稳定性。第二种是结晶紫（由德国Sigma-Aldrich® Solutions供应）（参见图1(b)），一种三苯甲烷染料，常用于生物染色，已知具有抗降解性和致突变性。另外两种为市场和商业染料，即两种不同颜色（浅色和深色）的纺织染料，直接收集自工业排放口（新德里附近当地纺织市场），成分未知，用于模拟真实世界废水的复杂性。不同批次在单独的锥形瓶中含有合成废水培养基，染料浓度如下：2 mg·L⁻¹、4 mg·L⁻¹、6 mg·L⁻¹、8 mg·L⁻¹和10 mg·L⁻¹，采用2 mg·L⁻¹的逐步递增浓度使培养物逐渐适应更高的染料浓度。
【数据】染料种类：甲基橙（偶氮染料，含磺酸基）、结晶紫（三苯甲烷染料）、浅色/深色商业纺织染料（成分未知）；浓度梯度：2、4、6、8、10 mg·L⁻¹；递增幅度：2 mg·L⁻¹
2.3 分析方法
以下部分详细介绍了所用技术。
研究结果
所用酵母和细菌菌株表现出高生物吸附和生物累积亲和力、更高的生物量浓度以及重金属和染料浓度的大幅降低。对照瓶中均未观察到这种现象，从而证明了生物过程在生物修复中的重要性。
3.1 重金属胁迫对发酵性能和生物修复能力的影响
基于33小时、五个连续实验批次过程中葡萄糖和硝酸盐消耗及生物量形成情况，分析了枯草芽孢杆菌和皱褶假丝酵母在含不同重金属浓度的合成废水培养基中的生物修复能力，如图2所示。
#### 3.1.1 枯草芽孢杆菌的重金属生物修复潜力
枯草芽孢杆菌发酵的生物修复能力如图2(a)所示。在20 mg·L⁻¹重金属条件下，葡萄糖和硝酸盐在14 h内耗尽，生物量浓度在29 h内达到3.05 ± 0.03 g·L⁻¹。33 h批次结束后观察到重金属完全消除，表明存在最佳解毒水平。在40 mg·L⁻¹重金属条件下，葡萄糖和硝酸盐的利用比上一批次略晚（分别在后17 h和14 h），生物量浓度在26 h后达到2.35 ± 0.02 g·L⁻¹。Cr³⁺去除率保持100%，而Cd²⁺去除率因重金属诱导的胁迫略微下降至99.75%。在60 mg·L⁻¹重金属条件下，葡萄糖和硝酸盐摄取加快（14 h内），生物量浓度在28 h后达到1.86 ± 0.01 g·L⁻¹，但Cr³⁺去除率降至99.33%，Cd²⁺去除率降至96.83%，表明在中等胁迫下维持了解毒和生长能力。在80 mg·L⁻¹重金属条件下，葡萄糖和硝酸盐的利用分别在17 h和14 h后完成，最大生物量浓度1.54 ± 0.01 g·L⁻¹在23 h时达到，表明生长持续受到抑制，但重金属去除效率仍保持在96%以上。100 mg·L⁻¹重金属条件下，营养物质在17 h内被利用完毕，最大生物量浓度最低，为1.43 ± 0.01 g·L⁻¹（26 h时），表现出最大代谢抑制，但重金属去除效率仍观察到96%。在所有连续批次中，营养物质的快速利用表明代谢活跃，而生物量浓度随重金属负荷增加而降低则表明抑制效应。生物量浓度的降低并未影响重金属去除效率，每批处理33 h内去除率始终保持在96%以上。重金属浓度与生长之间的反比关系凸显了在放大过程中平衡微生物性能和解毒效率的必要性。
【数据】20 mg·L⁻¹ HMs：葡萄糖/硝酸盐耗尽14 h，生物量3.05 ± 0.03 g·L⁻¹（29 h），HMs去除100%；40 mg·L⁻¹ HMs：葡萄糖17 h/硝酸盐14 h耗尽，生物量2.35 ± 0.02 g·L⁻¹（26 h），Cr³⁺去除100%、Cd²⁺去除99.75%；60 mg·L⁻¹ HMs：葡萄糖/硝酸盐14 h耗尽，生物量1.86 ± 0.01 g·L⁻¹（28 h），Cr³⁺去除99.33%、Cd²⁺去除96.83%；80 mg·L⁻¹ HMs：葡萄糖17 h/硝酸盐14 h耗尽，生物量1.54 ± 0.01 g·L⁻¹（23 h），去除率>96%；100 mg·L⁻¹ HMs：营养物17 h耗尽，生物量1.43 ± 0.01 g·L⁻¹（26 h），去除率96%
#### 3.1.2 皱褶假丝酵母的重金属生物修复潜力
皱褶假丝酵母在合成废水中表现出与枯草芽孢杆菌相当的生物修复行为，如图2(b)所示。在20 mg·L⁻¹重金属浓度下观察到营养物质的快速消耗，生物量浓度在29 h内达到3.14 ± 0.03 g·L⁻¹，表明生长旺盛。33 h内重金属完全去除，显示出良好的耐受性和性能。在40 mg·L⁻¹重金属浓度下，营养消耗模式与上一批次相似。最大生物量浓度在26 h后达到，数值为2.44 g·L⁻¹。然而，尽管重金属去除率很高（>99%），重金属胁迫的存在仍然明显。在60 mg·L⁻¹重金属浓度下，葡萄糖和硝酸盐利用没有差异，但最大生物量浓度在28 h内急剧下降至2.02 ± 0.02 g·L⁻¹，表明代谢抑制。生物修复仍然有效，Cd²⁺去除率为99.83%，Cr³⁺去除率>98%，表明驯化成功。在80 mg·L⁻¹重金属浓度下，葡萄糖消耗速率出现轻微延迟（14 h内），最大生物量浓度在23 h时急剧下降至1.68 ± 0.01 g·L⁻¹。在高重金属胁迫条件下，代谢过程和生长受到显著损害，但Cd²⁺去除率仍>98%，Cr³⁺去除率降至>97%。在100 mg·L⁻¹重金属条件下，葡萄糖和硝酸盐的消耗速率重新变得活跃（13 h内完成），而最大生物量浓度在26 h时降至1.60 ± 0.01 g·L⁻¹，这是所有重金属驯化批次中的最低值，去除率>96%。对照批次中未观察到非生物损失。在严重重金属胁迫情况下，代谢过程和生长受到抑制，但皱褶假丝酵母凭借其强大的适应性和成功的驯化仍成功去除了重金属。
【数据】20 mg·L⁻¹ HMs：生物量3.14 ± 0.03 g·L⁻¹（29 h），33 h完全去除；40 mg·L⁻¹ HMs：生物量2.44 g·L⁻¹（26 h），去除率>99%；60 mg·L⁻¹ HMs：生物量2.02 ± 0.02 g·L⁻¹（28 h），Cd²⁺去除99.83%、Cr³⁺去除>98%；80 mg·L⁻¹ HMs：生物量1.68 ± 0.01 g·L⁻¹（23 h），Cd²⁺去除>98%、Cr³⁺去除>97%；100 mg·L⁻¹ HMs：营养物13 h耗尽，生物量1.60 ± 0.01 g·L⁻¹（26 h），去除率>96%
#### 3.1.3 重金属生物修复与驯化过程中的比生长速率和比去除速率
对不断升高的Cd²⁺和Cr³⁺浓度的驯化效果反映在枯草芽孢杆菌和皱褶假丝酵母五个连续驯化批次中最大比生长速率（μmax）值的增加上。枯草芽孢杆菌的μmax从0.326 h⁻¹（第1批）增加到0.768 h⁻¹（第5批），表明重金属诱导的氧化应激或蛋白质和膜损伤的抑制效应较低。尽管生物量浓度较低，但所有驯化批次中μmax值持续正向增加表明其具有强大的恢复力和高强度废水利用能力。与此相印证，Cd²⁺和Cr³⁺的比去除速率也随重金属浓度增加而提高，在100 mg·L⁻¹时分别达到2.04 mg·g⁻¹·h⁻¹和2.05 mg·g⁻¹·h⁻¹。这种增强反映了解毒机制的激活，包括生物吸附、细胞内隔离和酶促转化。皱褶假丝酵母的比生长速率在各批次间从0.324 h⁻¹（第1批）增加到0.768 h⁻¹（第5批），表现出高重金属耐受性。Cd²⁺和Cr³⁺的比去除速率也呈现相同趋势，从20 mg·L⁻¹重金属时的0.19 mg·g⁻¹·h⁻¹（两种金属相同）稳步增加到100 mg·L⁻¹重金属时的1.83 mg·g⁻¹·h⁻¹和1.85 mg·g⁻¹·h⁻¹，表明通过生物吸附、细胞壁结合和细胞内区室化作用增强了隔离能力。与枯草芽孢杆菌一样，皱褶假丝酵母在高重金属负荷下经历轻微生长抑制，而去除性能有所提高。μmax与比去除速率之间的关系表明了从生物量生产向解毒的代谢转变，枯草芽孢杆菌和皱褶假丝酵母在驯化后即使在高重金属胁迫下也能保持高去除效率。
【数据】枯草芽孢杆菌μmax：0.326 h⁻¹（第1批）→0.768 h⁻¹（第5批）；Cd²⁺比去除速率峰值：2.04 mg·g⁻¹·h⁻¹；Cr³⁺比去除速率峰值：2.05 mg·g⁻¹·h⁻¹（均于100 mg·L⁻¹）；皱褶假丝酵母μmax：0.324 h⁻¹（第1批）→0.768 h⁻¹（第5批）；Cd²⁺比去除速率：0.19→1.83 mg·g⁻¹·h⁻¹；Cr³⁺比去除速率：0.19→1.85 mg·g⁻¹·h⁻¹
#### 3.1.4 SOD活性作为重金属胁迫的指标
在20 mg·L⁻¹至100 mg·L⁻¹的不同初始重金属浓度下，测定了皱褶假丝酵母和枯草芽孢杆菌的SOD活性和比SOD活性。皱褶假丝酵母和枯草芽孢杆菌均在20 mg·L⁻¹时表现出最大的重金属去除率和最大的生物量产量。当重金属浓度增加时，体积SOD活性（U·mL⁻¹）下降，反映了毒性导致的生物量减少。而比SOD活性（U·mg⁻¹）增加，表明细胞内氧化应激反应增强。因此，较高的重金属负荷施加更多的氧化应激并导致更低的细胞密度，而增加的应激意味着细胞内有更多的抗氧化防御。在皱褶假丝酵母的连续批次中，SOD活性从11,921 ± 11 U·mL⁻¹（20 mg·L⁻¹时）下降到7658 ± 7 U·mL⁻¹（100 mg·L⁻¹时），而比SOD活性从3796 U·mg⁻¹增加到4797 U·mg⁻¹。对于枯草芽孢杆菌，SOD活性从13,421 ± 13 U·mL⁻¹下降到8289 ± 8 U·mL⁻¹，而比SOD活性增加更为显著。
【数据】皱褶假丝酵母SOD活性：11,921 ± 11 U·mL⁻¹（20 mg·L⁻¹）→7658 ± 7 U·mL⁻¹（100 mg·L⁻¹）；比SOD活性：3796→4797 U·mg⁻¹；枯草芽孢杆菌SOD活性：13,421 ± 13 U·mL⁻¹→8289 ± 8 U·mL⁻¹；比SOD活性：增加（原文未详述具体数值）
讨论与解读
本研究通过序贯驯化枯草芽孢杆菌和皱褶假丝酵母，在真实废水基质（Najafgarh排水渠）中实现了对高毒性重金属（Cd²⁺和Cr³⁺）和顽固合成染料（结晶紫、甲基橙及当地市场染料）的协同生物修复。通过渐进式33小时五阶段驯化策略，两种微生物分离株均表现出深刻的生理适应性，在污染物诱导胁迫不断升级的情况下仍保持强劲的最大比生长速率（μmax从0.326 h⁻¹升至0.768 h⁻¹）。驯化后的生物工艺达到了出色的解毒阈值，即使在极端胁迫负荷下（20 mg·L⁻¹至100 mg·L⁻¹），Cd²⁺和Cr³⁺的去除效率仍持续高于96%。染料修复同样高效，尽管浓度不断升高（2 mg·L⁻¹至10 mg·L⁻¹），脱色效率仍达80.1%（甲基橙）至>98%（浅色市场染料）。本研究的一个关键机制发现是胁迫诱导的从细胞增殖向单细胞强化解毒的代谢转变。虽然最大生物量浓度随污染物负荷升高而反向下降，但比去除动力学激增，重金属峰值达2.05 mg·g⁻¹·h⁻¹。这种代谢重定向通过酶学生物标志物谱得到明显证实——体积酶活性因生物量受抑制而下降，而比酶活性显著上升。
编译者解读
本研究以"驯化"为核心策略，巧妙地将污染物浓度梯度上升与微生物适应性进化相结合，使双菌体系在真实废水基质中同时应对重金属与多种染料复合胁迫，贴近工业实际。方法上，选择细菌（生物吸附为主）与酵母（氧化降解见长）的互补组合，配合SOD与漆酶活性追踪，从酶学层面揭示了"增殖转向解毒"的代谢重编程机制。值得注意的是，比去除速率与比酶活性的同步上升为生物修复工艺的定向强化提供了可量化指标。局限在于：商业染料成分未知，机制解析难以深入；研究仍处于批次水平，连续流反应器中的驯化稳定性与微生物群落动态尚待验证。该工艺对联合国可持续发展目标6、9、12、13的直接贡献使其具备明确的工程转化潜力。
参考来源
Kumari S. Sequential acclimatization of Bacillus subtilis and Candida rugosa for sustainable bioremediation of wastewater containing cadmium, chromium, and synthetic dyes. Next Bioengineering, 2026. DOI: 10.1016/j.nxbio.2026.100042
DOI: 10.1016/j.nxbio.2026.100042