来源：Development and optimization of an engineered E. coli platform for nitrotryptophan biosynthesis（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
硝基色氨酸及其衍生物是合成生物活性化合物和功能材料的重要砌块。本研究在大肠杆菌中构建了一条全新的生物催化途径，利用来自链霉菌的自供氧P450酶TB14直接催化L-色氨酸芳香环硝化，并结合一氧化氮合成酶（BsNOS）或化学供体硝普钠（SNP）提供NO源，辅以葡萄糖脱氢酶（GDH）实现NADPH再生。通过途径平衡、发酵条件优化及竞争代谢通路消除，最终在48小时内将硝基色氨酸产量提升至209.9 mg/L，为微生物合成硝基芳香化合物建立了稳健平台。
研究背景
硝基化合物（–NO₂），特别是硝基芳香族和杂环衍生物，在工业中具有重要价值，广泛应用于食品防腐剂、农用化学品、杀虫剂、除草剂、塑料、炸药和染料等领域。尽管存在毒性问题，–NO₂基团在多种药物组成中扮演关键角色，这些药物常用于治疗帕金森病、心脏病、癌症和感染性疾病。在化学合成领域，L-色氨酸（L-Trp）的4位硝化通常依赖硫酸和硝酸的混合酸反应，通过亲电取代实现。然而，硝酸作为硝化剂存在选择性差、污染严重和安全风险等长期问题。近年来，生物催化的进展使其被视为传统化学合成路线的有益补充，全细胞生物催化为实现区域选择性硝化提供了新的可能性。
研究方法
2.1 通用化学品、DNA亚克隆与菌株
本研究旨在考察编码细胞色素P450 TxtE（GenBank CBG70284.1）、还原酶BM3R（GenBank WP_013307940.1）和trpE（GenBank NP_415780.1）的基因。研究初期对trpR（GenBank NP_418810.1）和aroG（GenBank WP_001109196.1）进行了针对大肠杆菌表达的密码子优化。引物购自Takara公司。其他化学品和溶剂通过Fisher Scientific和Sigma-Aldrich等成熟供应商采购。本研究中，分子生物学操作使用大肠杆菌DH5α菌株，全细胞硝化构建和蛋白表达使用大肠杆菌BL21-GOLD（DE3）（Agilent）菌株。大肠杆菌菌种使用TB培养基培养。DNA序列分析由Sangon Biotech完成。
【数据】菌株：E. coli DH5α、E. coli BL21-GOLD (DE3)；培养基：TB；引物来源：Takara
2.2 硝基色氨酸生物合成途径的构建
编码TB14、BsNOS和GDH的基因经合成后，分别使用表S1中详述的引物进行扩增。PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，并使用GeneJET凝胶提取试剂盒（Vazyme Biotech Co.）进行提取。随后，纯化的PCR产物（命名为pETDuet-1和pET28a）经限制性内切酶消化、纯化和连接，以构建表达质粒。本研究对所有构建体中的插入片段进行测序，以排除PCR和基因操作可能引入的错误。
【数据】试剂盒：GeneJET Gel Extraction Kit；载体：pETDuet-1、pET28a
2.3 全细胞生物转化过程
为构建设计途径，将大肠杆菌BL21-GOLD（DE3）分别转化设计途径I-III。在LB琼脂平板上筛选大肠杆菌I-III阳性克隆，琼脂中添加100 mg/L氨苄青霉素或50 mg/L卡那霉素。实验下一阶段，每个菌株的单克隆在含相应抗生素的LB中培养，条件为37°C、200 rpm旋转速度，培养24小时。种子培养物随后用于接种100 mL含适当抗生素的TB培养基，培养条件维持37°C、200 rpm。测定OD600值，要求达到0.6–0.8。随后，以0.5 mM IPTG在20°C、200 rpm条件下诱导蛋白合成20小时。蛋白表达随后进行评估——细胞样品在5000 g、4°C离心10分钟后收集，重悬于适当体积的溶菌酶缓冲液中，细胞提取物体积维持在缓冲液总体积的三分之一。可溶性蛋白经超声处理和20,000 g、4°C离心过滤20分钟后获得。取澄清上清液（20 μL）与染料混合，进行SDS-PAGE分析。TB环境中的全细胞生物转化全过程经严格分析——TB中的细菌细胞经离心分离（2000 g、4°C、10分钟）后重悬于新鲜测试培养基中。发酵在不同温度、恒定200 rpm旋转速度下进行。在指定时间间隔，精确收集0.1 mL发酵样品。全细胞生物转化通过加入0.2毫升甲醇终止。随后以14,000 rpm离心30分钟，取上清液进行高效液相色谱（HPLC）分析。
【数据】抗生素：氨苄青霉素100 mg/L、卡那霉素50 mg/L；培养温度：37°C；转速：200 rpm；时间：24h；OD600：0.6–0.8；IPTG浓度：0.5 mM；诱导温度：20°C；诱导时间：20h；离心条件：5000 g/10 min/4°C、20000 g/20 min/4°C、2000 g/10 min/4°C；样品量：0.1 mL；甲醇量：0.2 mL；离心：14000 rpm/30 min
2.4 基因组操作
trpR失活过程按照CRISPR-Cas9方法进行[25,26]。用于基因敲除的基因特异性引物列于表S1。为将aroG序列的野生型启动子替换为更强的trc启动子，需使用特异性引物aroG-Ptrc-F和aroG-Ptrc-R（见表S1）扩增线性化DNA片段。含有trc启动子的pUC57质粒作为模板DNA。纯化的PCR产物经凝胶层析后，电穿孔转入大肠杆菌BL21-Gold（DE3），目的是将天然启动子替换为适合后续CRISPR-Cas9技术使用的启动子，遵循标准基因敲除方案。使用指定测试引物通过PCR验证aroG基因天然启动子修饰的正确性。trpEfbr基因通过定点突变技术引入突变。简言之，野生型大肠杆菌的trpE基因使用适当引物对trpE-BglⅡ-F和trpE-XholⅠ-R从基因组DNA（CP081489）扩增，插入pETDuet-1载体。后续PCR反应的引物（trpE-D-F和trpE-D-R）按上述方案设计，用于构建含所需核苷酸突变的突变序列。PCR产物随后使用设计好的互补引物扩增，经DpnI消化1小时，转化至感受态大肠杆菌DH5α。阳性克隆通过聚合酶链反应（PCR）验证。质粒DNA提取和测序后确认突变。
【数据】敲除基因：trpR；启动子替换：aroG天然启动子→trc启动子；模板质粒：pUC57；DpnI消化时间：1h；基因组DNA编号：CP081489
2.5 HPLC和LC-MS方法
HPLC分析使用Shimadzu HPLC系统（京都，日本），配备WondaSil C18-WR（4.6×250 mm，5 µm）色谱柱和PDA检测器。HPLC检测中，C18柱维持在28°C，初始以5%溶液B（乙腈，含0.1%甲酸）洗脱2分钟，随后以5–15%溶液B线性梯度洗脱5分钟，再以15–95%溶液B第二线性梯度洗脱10分钟。随后色谱柱进行额外清洗循环，含95%溶剂B持续3分钟，之后进行再平衡步骤——加入5%溶剂B持续5分钟。溶剂A为含0.1%甲酸的水溶液。流速设定为1 mL/min，产物在211 nm波长下使用PDA检测器鉴定。样品中硝基色氨酸和L-Trp的定量根据HPLC分析结果确定，使用两种标准品的标准曲线。液质联用分析按先前确立的方案执行[27]。
【数据】色谱柱：WondaSil C18-WR (4.6×250 mm, 5 µm)；柱温：28°C；流速：1 mL/min；检测波长：211 nm；流动相A：0.1%甲酸水；流动相B：乙腈+0.1%甲酸
2.6 统计分析
所有实验均进行三次重复，数据以平均值±标准差（SD）表示。统计分析使用GraphPad Prism 10软件进行。
【数据】重复次数：3；统计软件：GraphPad Prism 10
研究结果
3.1 大肠杆菌中硝基色氨酸生物合成途径的设计
提高生产产量的常用代谢工程策略是应用基因操作技术，通过过表达瓶颈酶并同时失活负调控因子来实现。该组合措施已被证明可增强目标产物的代谢通量[28,29]。本研究提出假设：存在一条硝基色氨酸生物合成途径，包含用于L-Trp硝化的融合蛋白TxtE-BM3R（TB14）和细菌一氧化氮合酶（NOS），后者可被外源硝普钠（SNP）替代作为NO来源（图1）。已确定TB14和NOS的催化活性均依赖NADPH作为还原剂。在大肠杆菌中，NADH是主要还原当量，而戊糖磷酸途径是生成NADPH的主要路线。这些条件可能导致硝基色氨酸产量受限。为解决此问题，将来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶（GDH）纳入工程途径——GDH负责从NADP⁺再生NADPH，该过程通过将葡萄糖转化为葡糖酸-1,5-内酯中间体催化完成，后者可进入戊糖磷酸途径[30]。
大肠杆菌中L-Trp生物合成过程受多种调控机制影响，包括但不限于转录抑制和反馈抑制。作为L-Trp生物合成和转运途径中的调控元件，TrpR（由trpR编码）已被证明对L-Trp途径发挥负调控作用[31,32]。trpR基因在大肠杆菌基因组中被破坏，产生BL21-ΔtrpR变体。此外，芳香族氨基酸生物合成途径中关键酶的反馈抑制常由芳香族氨基酸产物引发。大量研究证明消除这些反馈抑制可显著提高芳香族氨基酸及其衍生物的生产水平，包括L-Trp[21,23]。本研究聚焦增强L-Trp方向的代谢物流入，以识别促进该过程的关键酶。研究中考察了瓶颈酶，包括通过芳香族氨基酸途径合成3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP）以及通过L-Trp分支途径合成邻氨基苯甲酸合成酶。已确定DAHP合酶约80%的催化效率归因于其AroG组分[9]。因此，表达抗反馈抑制的AroG可显著逆转DAHP合酶的反馈抑制现象。邻氨基苯甲酸合酶（由trpE编码）被确定为另一个限速酶，该酶受L-Trp反馈机制抑制。已有文献记载，TrpE突变体具有缓解L-Trp诱导的反馈抑制的能力。
【数据】DAHP合酶催化效率中AroG占比：约80%；敲除基因：trpR；突变基因：trpE
3.2 大肠杆菌代谢工程用于生产硝化色氨酸
尝试在大肠杆菌中表达TB14、BsNOS和GDH基因以合成硝基色氨酸（见图1A）。TB14和GDH基因片段成功克隆至pET28a载体的多克隆位点，每个基因元件均配有T7启动子/lac操纵子。pET28a表达质粒带有卡那霉素抗性标记（Kan）。BsNOS编码序列在pETDuet-1构建体中表达，该载体含T7启动子和氨苄青霉素抗性标记（Ap）。构建体随后转化至大肠杆菌BL21-GOLD（DE3），经卡那霉素和氨苄青霉素双重筛选后，阳性克隆在TB培养基中用0.5 mM IPTG诱导20小时进行蛋白表达。
SDS-PAGE分析显示TB14（110 kDa，大肠杆菌I-III）、GDH（28 kDa，大肠杆菌II、III）和BsNOS（42 kDa，大肠杆菌III）的有效表达。TB14中融合P450还原酶结构域的活性通过细胞色素c还原试验确认——该试验中，还原酶催化的NADPH到细胞色素c的电子传递通过550 nm处吸光度增加来监测。纯化的TB14融合蛋白表现出41.5 U/mg的比活性，证明还原酶结构域正确折叠并对NADPH的电子传递完全功能化。P450血红素-硫醇盐中心的正確折叠通过一氧化碳（CO）差光谱验证——这是区分功能性P450与变性P420形式的经典方法。经连二亚硫酸钠还原并暴露于CO后，纯化的TB14蛋白在450 nm处显示特征吸收峰，这是正确折叠P450酶的特征信号（图2C）。相反，阴性对照牛血清白蛋白（BSA）未产生此峰。P450-CO复合物的确认有力证明TB14蛋白结构完整且具有催化能力。
为验证工程化NO供给模块的催化周转，测定了纯化BsNOS蛋白的活性，使用总一氧化氮合酶（T-NOS）检测试剂盒定量。纯化的BsNOS蛋白显示13.5 U/mg的比活性，直接证实工程酶能够催化L-精氨酸转化为一氧化氮。使用大肠杆菌III通过转化TB无机培养基中存在的细胞L-Trp和L-Arg实现硝基色氨酸的生化合成——该培养基是全细胞转化领域最常用的培养基。培养24小时后，通过HPLC定量硝基色氨酸产量（图S1）。为验证产物身份，收集对应硝基色氨酸的色谱峰并进行LC-MS/MS分析（图S2）。分析显示质荷比（m/z）为250.0828，与硝基色氨酸的理论质量完美匹配。该值与SM Barry等人[33]报道的4-硝基-L-色氨酸标准品质量（m/z 250.0818）高度一致。共表达TB14、GDH和一氧化氮合酶（NOS）用于原位NO生成的大肠杆菌III菌株在24小时后产生108.7 mg/L的硝基色氨酸滴度（图2D）。在平行实验中，使用硝普钠（SNP）向仅表达P450模块的菌株外源供给NO。共表达TB14和葡萄糖脱氢酶（GDH）以增强NADPH再生的大肠杆菌II菌株达到133.2 mg/L的最终滴度，显著高于大肠杆菌I菌株的滴度，也超过内源NOS系统（菌株III）的产量。有趣的是，结果表明直接补充化学NO供体目前比原位生物合成方法更有效。推测NOS基系统性能欠佳源于几个关键限制：首先，NOS酶的过表达和功能发挥对宿主施加显著代谢负担。
【数据】TB14分子量：110 kDa；GDH分子量：28 kDa；BsNOS分子量：42 kDa；TB14比活性：41.5 U/mg；BsNOS比活性：13.5 U/mg；检测波长：550 nm（细胞色素c还原）、450 nm（CO差光谱）；菌株III产量：108.7 mg/L（24h）；菌株II产量：133.2 mg/L；m/z：250.0828（硝基色氨酸）
讨论与解读
本研究开发并系统优化了大肠杆菌全细胞生物催化系统用于硝基色氨酸生产。在已有酶学组件基础上，通过多层工程策略提升这一复杂多酶途径的整体生产力。研究建立了功能性生产平台，整合了P450硝化酶（TB14）与原位NADPH再生模块（GDH）。研究的关键部分是对不同一氧化氮供给策略（内源BsNOS与外源SNP）的系统比较，揭示了系统瓶颈——代谢负担和辅因子竞争。此外，成功实施宿主菌株的靶向代谢工程——删除竞争途径关键基因并增强瓶颈酶表达，有效引导更多代谢通量流向L-色氨酸前体生物合成。该策略被证明高效，显著加速了生产速率并贡献于最终高滴度。通过将这些策略与发酵条件优化协同结合，最终在48小时内将产物滴度提升至209.9 mg/L。尽管属于增量改进，该滴度目前是微生物生物合成领域报道的最高水平。
编译者解读：该研究展示了合成生物学中"酶工程+辅因子再生+宿主代谢重编程"三位一体的经典范式。值得关注的是，化学NO供体（SNP）效果优于内源NOS系统这一反直觉发现——这提示在复杂多酶途径中，代谢负担有时比底物供给更具限制性。P450酶的直接芳香硝化能力为制备硝基化合物提供了避开强酸条件的绿色替代路线。后续优化空间在于：NOS系统的代谢负担削减、TB14的定向进化提升催化效率、以及发酵工艺的规模化验证。该平台策略可延伸至其他硝基芳香族化合物的生物合成。
参考来源
Lin H. Development and optimization of an engineered E. coli platform for nitrotryptophan biosynthesis. Enzyme and Microbial Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2025.110785
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2025.110785