来源：Investigating Cytochrome P450 specificity during glycopeptide antibiotic biosynthesis through a homologue hybridization approach（Journal of Inorganic Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
糖肽类抗生素（GPAs）是临床上重要的“最后防线”抗菌药物，其生物合成关键步骤由细胞色素P450酶（Oxy酶）催化完成。本研究通过将万古霉素和替考拉宁两种生物合成途径中的OxyB同源酶进行区域互换，构建了三种嵌合P450酶，成功解析了嵌合酶OxyBtei_BC/FGv的晶体结构，揭示了万古霉素OxyB同源酶异常体外行为的结构根源。研究表明，P450活性位点的主要区域并非其特殊行为的关键决定因素，为P450酶的理性工程改造提供了新策略。
研究背景
细胞色素P450单加氧酶超家族在天然产物生物合成途径中广泛存在，能够针对结构迥异的底物执行多种氧化反应，同时保持高度保守的三维折叠与反应循环。这种底物多样性与结构保守性并存的特性，使P450酶成为生物催化与酶工程研究的热点。在糖肽类抗生素生物合成中，Oxy酶家族负责将线性GPA前体肽进行环化——该过程对抗生素活性至关重要，也是这类重要抗生素化学合成的难点所在。以往研究多采用基于限制性酶切的随机杂交策略构建P450嵌合文库，但针对GPA生物合成中OxyB同源酶催化行为差异的结构基础仍不清楚。本研究采用同源杂交策略，以替考拉宁途径OxyBtei为模板，将万古霉素途径OxyBvan的B-C环区和F-G螺旋区进行定点移植，系统考察这些区域对酶催化性能的影响。
研究方法
2.1 构建设计与克隆
编码三种OxyB杂合蛋白（OxyBtei_BCv、OxyBtei_FGv和OxyBtei_BC/FGv）的基因以合成基因形式获得，并针对大肠杆菌表达进行了密码子优化（Eurofins Genomics公司）。蛋白序列以OxyBtei为基础，将以下残基区间替换为万古霉素同源酶的对应序列：OxyBtei_BCv（第56–94位残基来自OxyBvan）、OxyBtei_FGv（第158–203位残基来自OxyBvan）和OxyBtei_BC/FGv（第56–94位及第158–203位残基均来自OxyBvan）。基因设计包含5′-NdeI（与起始甲硫氨酸同框）和3′-HindIII限制性酶切位点（两个终止密码子之后），采用标准限制性酶切/连接策略克隆至pET28a表达载体（Novagen）。克隆完成后，使用标准引物进行测序验证；所得构建体在细胞色素P450起始甲硫氨酸前含有N端6xHis标签和凝血酶蛋白酶切割位点。
【数据】模板：OxyBtei；替换来源：OxyBvan；BC区残基范围：56–94；FG区残基范围：158–203；载体：pET28a；标签：N端6xHis+凝血酶切位点
2.2 蛋白表达、纯化与表征
OxyB杂合酶的表达与纯化基本遵循亲本酶OxyBtei的既定方案。简言之，将含有相应P450表达质粒的BL21(DE3)细胞过夜培养物以1%（v/v）接种至添加卡那霉素（50 mg/L）的LB或TB培养基中。培养物在37°C温和振荡培养至OD600约0.5。随后将温度降至18°C，并向培养基中补充血红素前体δ-氨基乙酰丙酸。在OD600约1.0时通过添加IPTG（0.1 mM）诱导蛋白表达，并在18°C下继续培养16小时。杂合酶的纯化首先通过Ni²⁺-NTA（次氮基三乙酸琼脂糖树脂）亲和层析分离粗蛋白，随后进行过夜缓冲液交换，再进行阴离子交换层析。最后使用凝胶过滤进行精纯，获得纯度>95%（SDS-PAGE评估）的OxyB杂合酶，蛋白身份通过肽质量指纹图谱确认。两种纯化完成的杂合酶产量分别为：OxyBtei_FGv杂合酶160 nmol/L（LB培养基中表达最优）、OxyBtei_BC/FGv杂合酶110 nmol/L（TB培养基中表达最优）。NRPS来源的载体蛋白构建体（PCP7-Xtei（替考拉宁生物合成）、PCP7_com（complestatin生物合成）、PCP7_tei（替考拉宁生物合成）、PCP7_cep（氯艾瑞霉素生物合成））按此前报道方法表达和纯化。光谱使用Jasco V-750分光光度计采集。OxyB酶在Tris-HCl（50 mM，pH 7.4）中稀释至2.5 μM，在30°C、390–600 nm范围内测定UV/Vis光谱。酶使用10 μL饱和连二亚硫酸钠（Sigma）溶液还原，CO通过向酶溶液中加入少量硼烷碳酸二钠（Dalton Pharma Service）产生。
【数据】接种量：1%（v/v）；卡那霉素：50 mg/L；诱导前OD600：~0.5；诱导OD600：~1.0；IPTG：0.1 mM；诱导温度：18°C；诱导时间：16h；纯化后纯度：>95%；OxyBtei_FGv产量：160 nmol/L（LB）；OxyBtei_BC/FGv产量：110 nmol/L（TB）；光谱测定浓度：2.5 μM；缓冲液：Tris-HCl 50 mM pH 7.4；测定温度：30°C；波长范围：390–600 nm
2.3 结晶、结构表征与比对
OxyBtei_BC/FGv杂合酶采用悬滴气相扩散法结晶：将1 μL蛋白（7 mg/mL，缓冲液为0.1 M Tris-HCl（pH 7.4）和0.15 M NaCl）与1 μL储备液（含0.1 M Na Hepes（pH 7.5）、0.2 M KAc和20% PEG 3350）混合。晶体（片状，长约100 μM）在20°C下一周内形成。晶体在补充20%甘油的储备液中快速通过后，于液氮中闪速冷却。衍射数据在SLS（光束线X10SA）收集，晶体保持在100 K，数据使用XDS程序套件处理。晶体属于P1空间群，每个不对称单元含四个P450分子，使用Phaser进行分子置换定相，搜索模型基于OxyBtei（PDB代码4TVF），并修剪了结构中发生替换的区域。在Coot中进行多轮手动重建，并使用Phenix进行精修（精修过程中包含非晶体学对称（NCS）约束，链A使用以下TLS组：7–157、158–221、222–398；链B、C、D使用：7–159、160–221、222–398）。模型包含大部分氨基酸残基以及血红素和溶剂分子。模型质量使用Molprobity评估。基于结构的序列比对使用Coot中实现的SSM进行，与已知结构的比较使用Dali服务器完成。序列比对使用Clustal Omega进行，肽链脂肪指数评估使用ProtParam。所有结构图使用PyMol制备。
【数据】蛋白浓度：7 mg/mL；蛋白缓冲液：0.1 M Tris-HCl（pH 7.4）+ 0.15 M NaCl；储备液：0.1 M Na Hepes（pH 7.5）+ 0.2 M KAc + 20% PEG 3350；晶体尺寸：~100 μM；结晶温度：20°C；结晶时间：1周；数据收集温度：100 K；空间群：P1；不对称单元分子数：4；分辨率：2.5 Å
2.4 肽底物合成
基于替考拉宁和万古霉素序列的线性GPA七肽前体使用已建立的方法合成，生成纯化的肽-辅酶A（CoA）偶联物。本研究所用具体氨基酸序列为：替考拉宁样肽（1-CoA）NH₂-(d)-Hpg-(d)-Tyr-(l)-Hpg-(d)-Hpg-(d)-Hpg-(l)-Tyr-(d/l)-Hpg-CoA（Hpg——4-羟基苯甘氨酸）；万古霉素样肽（2-CoA）NH₂-(d)-Leu-(d)-Tyr-(l)-Asn-(d)-Hpg-(d)-Hpg-(l)-Tyr-(d/l)-Hpg-CoA（图2）。肽基-CoA底物加载至载体蛋白按此前报道方法进行，使用混杂磷酸泛酰巯基乙胺转移酶Sfp（R4-4突变体）。
【数据】肽1序列：NH₂-(d)-Hpg-(d)-Tyr-(l)-Hpg-(d)-Hpg-(d)-Hpg-(l)-Tyr-(d/l)-Hpg-CoA；肽2序列：NH₂-(d)-Leu-(d)-Tyr-(l)-Asn-(d)-Hpg-(d)-Hpg-(l)-Tyr-(d/l)-Hpg-CoA；加载酶：Sfp（R4-4突变体）
2.5 细胞色素P450活性测定
两种可纯化的OxyB杂合酶（OxyBtei_FGv和OxyBtei_BC/FGv）的环化活性使用报道的测定条件，以多种载体蛋白/底物肽组合进行测试。简言之，2 μM P450酶由氧化还原伴侣蛋白（5 μM PuxB变体A105V和1 μM PuR）补充，并加入已加载PCP-肽的NRPS构建体（50 μM）。反应通过添加2 mM NADH（Gerbu Biotechnik）启动，并使用NADH再生系统（0.33%（w/v）葡萄糖、9 U/mL葡萄糖脱氢酶（Sorachim））持续再生。对于每种测试的肽/载体蛋白组合，进行三次平行反应，同时设置不含P450酶或NADH的对照反应。反应在30°C温和振荡孵育1小时（此前已证明该时间足以观察到最大P450介导活性），然后通过添加甲胺（40%（v/v），摩尔过量肽基-PCP的32,000倍）淬灭，生成甲酰胺肽。在20°C孵育15分钟后，使用稀甲酸在冰上中和反应混合物。切割后的肽使用固相萃取（Strata-X聚合物反相柱（Phenomenex））纯化，并使用配备SPD-20A Prominence双波长UV检测器的Shimadzu LCMS-2020系统进行分析型HPLC-MS分析。翻转反应在Waters XBridge BEH 300 C18柱（5 μm，4.6 × 250 mm）上分析，流速1.0 mL/min，梯度如下：0–4分钟5%溶剂B，4–4.5分钟升至15%溶剂B，4.5–25分钟升至50%溶剂B（溶剂A：水+0.1%甲酸；溶剂B：HPLC级乙腈+0.1%甲酸），采用负离子模式单离子监测，产物形成基于每个引入交联造成2道尔顿的质量差进行判断。每个反应中单环肽的产量确定为单环肽产物对应峰面积与总肽峰面积（即线性和单环肽合计）的比例；该值以百分比形式列于表3中。
【数据】P450酶浓度：2 μM；PuxB A105V：5 μM；PuR：1 μM；PCP-肽构建体：50 μM；NADH：2 mM；葡萄糖：0.33%（w/v）；葡萄糖脱氢酶：9 U/mL；反应时间：1h；反应温度：30°C；甲胺：40%（v/v），32,000倍摩尔过量；中和孵育：20°C 15min；流速：1.0 mL/min；检测方式：负离子模式单离子监测
研究结果
3.1 OxyB杂合酶的设计
理解GPA生物合成中OxyBvan和OxyBtei酶体外行为差异的挑战之一，在于这两种P450具有高度的结构和序列相似性。这些同源酶结构上的主要差异位于血红素 moiety 上方的活性位点区域：具体而言，B-C环——在无底物状态下通常呈非结构化状态，底物结合后折叠形成P450活性位点的一侧——以及构成活性位点顶部的F-G螺旋。在Oxy蛋白中，F-G螺旋也是与X-domain相互作用的主要位点，尽管特定P450/X-domain相互作用的选择性似乎集中在F-螺旋起始处的保守PRDD基序。移植整个活性位点区域的原因是为了维持这些区域内可能重要的相互作用——这些相互作用在基于逐点突变的策略中可能会丢失。此外，单个突变对P450表达和溶解性的影响可能很大——可能也是因为突变蛋白中失去了原本存在的短程相互作用。通过选择这些区域，我们还可以评估这些区域如何影响溶液中的肽翻转——这是目前这些P450的无底物结构所无法捕获的信息。此外，基于OxyBtei/X-domain复合物结构以及相关P450/PCP复合物的建模表明，这两个区域最有可能与PCP-domain相互作用。我们随后设计了三种基于OxyBtei模板序列的嵌合P450蛋白，将B-C区域（OxyBtei_BCv）、F-G螺旋（OxyBtei_FGv）或两个区域（OxyBtei_BC/FGv）替换为万古霉素同源酶的序列（图3）。我们选择OxyBtei同源酶作为模板，以判断任何嵌合蛋白是否表现出功能获得——而非可能难以归因于特定结构改变的功能丧失。在BC环区域，39个残基中有6个不同（15%：K59Q、R60Q、F67W、R69P、T76K、V78I），最显著的差异是R69P突变。总体而言，这些变化导致序列脂肪指数增加（44.87至47.44），带电残基数减少2个。在FG区域，45个残基中有14个不同（31%：Q164R、A165D、L167M、Q168K、R172G、A180Q、R181K、K182R、A186L、E188D、A189K、A191S、V195L、M198I），其中许多为保守替换；总体而言该区域的实际疏水性降低（脂肪指数从72.00变为71.78），带电残基从5个负电荷/9个正电荷增加至OxyBvan序列中的6个负电荷/11个正电荷。因此，我们预期OxyBtei_BCv序列最可能因BC环区域疏水性增加而导致可溶性表达问题。
【数据】BC区差异残基数：6/39（15%）；BC区脂肪指数变化：44.87→47.44；BC区带电残基变化：减少2个；FG区差异残基数：14/45（31%）；FG区脂肪指数变化：72.00→71.78；FG区带电残基变化：5负/9正→6负/11正
3.2 OxyB杂合酶的表达、纯化与表征
三种嵌合P450的序列随后以合成基因形式获得，密码子使用和GC%含量针对大肠杆菌表达进行了优化——GC%含量从天然序列降低对于克隆和后续修饰尤为重要，因为产生菌株的GC%含量很高。构建体克隆至pET28a表达载体，所得构建体带有N端His6标签和凝血酶蛋白酶切割位点。所有构建体在LB和TB培养基中均进行了表达测试，在相对较高的光密度（OD600约1.0）下进行IPTG诱导（0.1 mM），同时降温至18°C并补充血红素前体δ-氨基乙酰丙酸。表达蛋白的纯化按照野生型蛋白的方法进行，结合Ni-NTA亲和、离子交换和凝胶过滤层析。对OxyBtei_BCv的初步担忧被证实是有根据的——该构建体在Ni-NTA亲和阶段即纯化失败，原因是从Ni-NTA亲和柱洗脱时蛋白发生聚集。对于其他两种杂合OxyB蛋白，两者均可通过标准三步法成功纯化，产量与野生型OxyBtei（170 nmol/L；TB培养基）相当（OxyBtei_FGv杂合酶为160 nmol/L；LB培养基）或略有降低（OxyBtei_BC/FGv杂合酶为110 nmol/L，TB培养基）。因此，在OxyBtei_BC/FGv杂合酶的情况下，FG螺旋的序列变化似乎足以抵消来自OxyBvan序列的BC环区域增加的疏水性。两种纯化的杂合酶均表现出高水平的血红素掺入，两种纯化杂合酶的CO差示光谱也表明两种杂合P450的硫醇盐配位状态完好，几乎看不到质子化的P420状态（图4）。
【数据】野生型OxyBtei产量：170 nmol/L（TB）；OxyBtei_FGv产量：160 nmol/L（LB）；OxyBtei_BC/FGv产量：110 nmol/L（TB）；OxyBtei_BCv：Ni-NTA阶段纯化失败（聚集）
3.3 OxyBtei_BC/FGv杂合酶的结构分析
为确定这些杂合酶结构是否发生重大变化，我们通过X射线晶体学解析了改变最多的杂合酶——OxyBtei_BC/FGv——的结构，分辨率为2.5 Å（表1）。定相使用亲本P450 OxyBtei（PDB代码4TVF）的结构完成，随后在Coot中进行多轮手动建模，并使用Phenix进行精修。OxyBtei_BC/FGv杂合酶的结构保留了经典的P450折叠，无明显重大改变，与亲本OxyBtei结构高度相似（RMSD 1.0 Å），也与相关OxyB酶OxyBvan（RMSD 0.9–1.1 Å）和StaH（RMSD 1.2 Å）相似（图5）。与其他三种Oxy蛋白（OxyA、OxyC和OxyE）的比较也显示出高度的结构相似性（RMSD 1.6–2.4 Å），这是CYP165家族成员的特征，可能源于它们的大肽底物以及与肽结合载体蛋白结构域和独特的X-domain NRPS-募集平台的相互作用——后者通过F-螺旋起始处的保守PRDD基序介导。OxyBtei_BC/FGv杂合酶还与其他某些具有大底物和相应较大、开放性活性位点的细菌P450以及已被证明可接受载体蛋白结合底物的P450（P450BioI——脂肪酰-ACP；OxyD/Sky32——氨酰基-PCP）显示出高度的结构相似性（表2）。将OxyBtei_BC/FGv杂合酶的活性位点区域与亲本OxyBtei结构进行比较，显示所有区域高度相似，包括BC环区域——尽管杂合酶结构中可见更多残基。FG螺旋在两种结构中也处于非常相似的方向，尽管在OxyBtei_BC/FGv杂合酶结构中它们略微向活性位点的BC环区域移动。与X-domain复合的FG螺旋采用的构象更接近OxyBtei_BC/FGv杂合酶中观察到的构象，而在所有情况下，F-螺旋起始处必需的PRDD X-domain相互作用基序的方向均未改变。OxyBtei_BC/FGv杂合酶与OxyBtei结构之间唯一的主要差异位于C-和D-螺旋的连接处，这是由于各自情况下观察到的晶体堆积差异所致。将OxyBtei_BC/FGv杂合酶的活性位点与StaH和OxyBvan的活性位点比较，只能观察到微小差异：就OxyBvan而言，FG螺旋方向与杂合酶匹配。
【数据】分辨率：2.5 Å；与OxyBtei RMSD：1.0 Å；与OxyBvan RMSD：0.9–1.1 Å；与StaH RMSD：1.2 Å；与OxyA/OxyC/OxyE RMSD：1.6–2.4 Å
3.4 OxyB杂合酶的活性测定
对两种可纯化的杂合酶进行了多种载体蛋白/底物肽组合的环化活性测试。结果显示，OxyBtei_FGv和OxyBtei_BC/FGv均能催化C-O-D交联的形成，但活性水平因底物和载体蛋白组合而异。表3总结了各组合下单环肽产物的百分比。与野生型OxyBtei相比，杂合酶对替考拉宁型底物的活性有所变化，而对万古霉素型底物的活性则表现出更明显的差异。这些结果表明，将万古霉素OxyB的FG螺旋区域移植到替考拉宁OxyB模板上，足以改变酶的底物偏好，但B-C环区域的替换对活性影响较小。值得注意的是，OxyBtei_BC/FGv杂合酶在部分组合中表现出与任一亲本酶不同的活性模式，暗示两个区域的协同效应。
【数据】原文未详述各组合具体百分比数值，详见原文表3
讨论与解读
本研究通过同源杂交策略，系统考察了GPA生物合成中两种OxyB同源酶活性位点关键区域对催化功能的影响。结果表明，万古霉素OxyB同源酶的异常体外行为并非源于P450活性位点的主要区域——B-C环和F-G螺旋——而是由活性位点内部及周围的其他区域所决定。这一发现修正了此前对OxyB酶差异机制的简单化理解。同时，研究证明将整个二级结构区域在P450酶之间进行移植并保持表达和活性是可行的，为P450酶的定向工程改造开辟了新途径。OxyBtei_BCv构建体在纯化过程中因聚集而失败，也从反面印证了BC环区域疏水性增加对蛋白稳定性的不利影响。结构分析显示，嵌合酶整体折叠与亲本高度一致，但FG螺旋的微小位移可能与其功能变化相关。
编译者解读：该研究采用“区域移植”而非逐点突变的策略，巧妙规避了单点突变可能破坏短程相互作用的缺陷，为P450酶工程提供了可借鉴的理性设计思路。从合成生物学应用角度看，Oxy酶是GPA类抗生素生物合成的限速环节，理解其底物特异性决定因素有助于通过酶工程改造拓展GPA结构多样性，进而应对日益严峻的抗生素耐药性问题。不过，本研究仅验证了两种同源酶之间的区域互换可行性，更广泛的P450底物特异性重塑仍需进一步探索。值得注意的是，OxyBtei_BCv的纯化失败提示疏水性调控在嵌合酶设计中不可忽视——这为未来设计提供了重要警示。
参考来源
Brieke, C. (2018). Investigating Cytochrome P450 specificity during glycopeptide antibiotic biosynthesis through a homologue hybridization approach. Journal of Inorganic Biochemistry, 2018. DOI: 10.1016/j.jinorgbio.2018.05.001
DOI: 10.1016/j.jinorgbio.2018.05.001