来源：Enhancing MK-7 production in a Bacillus subtilis mutant strain via a two-stage leakage fermentation strategy and revealing metabolic mechanisms（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
维生素K2亚型——甲萘醌-7（MK-7）因多种健康功效而市场需求旺盛，但传统发酵模式产量低、周期长。本研究以枯草芽孢杆菌高产突变株BS02为对象，提出" submerged发酵+渗漏发酵"两阶段策略，总产量达163.56 mg/L，较传统生物膜发酵提升85.48%，胞外产量激增269.65%。借助扫描电镜、流式细胞术、GC-IMS与非靶向代谢组学，揭示了Brij-58增透膜通透性、两阶段碳代谢重编程等深层机制。
研究背景
MK-7由2-甲基-1,4-萘醌环和七个异戊二烯单元构成，在骨质疏松、心血管疾病、癌症、阿尔茨海默病和糖尿病等常见疾病的防治中具有重要生理功能。全球老龄化加速推动其医疗健康领域需求急剧攀升。微生物发酵是当前MK-7生产的主要途径，枯草芽孢杆菌作为公认安全（GRAS）菌株备受关注，但现有发酵体系普遍受限于低产量和长周期。 submerged发酵虽利于细胞生长和下游提取，却面临产量低、周期长的瓶颈。因此，探索高效发酵策略以提升MK-7产量成为亟待解决的关键问题。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
起始菌株为枯草芽孢杆菌BS02（MK-7高产突变株），由本实验室构建的工程菌株Bacillus subtilis 168-ΔsinR（Wu et al., 2021）经常压室温等离子体（ARTP）诱变结合适应性实验室进化（ALE）筛选获得。首先将BS02菌株接种于LB液体培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L氯化钠），在37°C、200 rpm条件下培养12–14 h。随后以2%（v/v）接种量将种子培养物转接至SYG发酵培养基（50 g/L大豆蛋白胨、20 g/L酵母提取物、50 g/L甘油、3.86 g/L K₂HPO₄、1.62 g/L KH₂PO₄），于37°C培养144 h进行相应发酵模式。 submerged发酵在200 rpm下进行相应时长；生物膜发酵在静置条件下维持相应时长；渗漏发酵以生物膜发酵为基础并添加表面活性剂。在24、48、72、96、120和144 h取样监测细胞生长、生物膜形成和MK-7产量。表面活性剂筛选通过在发酵初始阶段添加五种不同表面活性剂（CTAB、SDS、甜菜碱、Tween-80和Brij-58），终浓度均为0.3%（w/v）。随后对Brij-58在0至1.1%（w/v）浓度范围内进一步评估。继而采用两阶段渗漏发酵策略：培养物先进行不同时长（0、6、12、18、24或30 h）的 submerged发酵，然后添加0.5%（w/v）Brij-58，再进行渗漏发酵直至总发酵时间达144 h。GC-IMS和非靶向代谢组学分析的样品采集于0 h（发酵启动时）、12 h（submerged发酵结束时）和60 h（渗漏发酵生物膜完全形成时），这些时间点对应两阶段渗漏发酵的主要阶段。
【数据】菌株：Bacillus subtilis BS02；LB培养基：10 g/L胰蛋白胨+5 g/L酵母提取物+10 g/L NaCl；种子培养：37°C、200 rpm、12–14 h；SYG培养基：50 g/L大豆蛋白胨+20 g/L酵母提取物+50 g/L甘油+3.86 g/L K₂HPO₄+1.62 g/L KH₂PO₄；接种量：2%（v/v）；发酵温度：37°C；总发酵时间：144 h；表面活性剂终浓度：0.3%（w/v）；Brij-58浓度梯度：0–1.1%（w/v）；两阶段切换点：0/6/12/18/24/30 h；Brij-58添加量：0.5%（w/v）；代谢组学取样点：0、12、60 h
2.2 化学试剂
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）、甜菜碱、聚山梨酯80（Tween-80）和聚氧乙烯（20）十六烷基醚（Brij-58）均为分析纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司（中国上海）。甲醇、二氯甲烷、异丙醇和正己烷均为高效液相色谱级，购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）。
【数据】试剂来源：上海阿拉丁生化科技股份有限公司、上海麦克林生化科技有限公司；试剂级别：分析纯（表面活性剂）、HPLC级（有机溶剂）
2.3 细胞生物量、残留甘油和MK-7产量的测定
submerged发酵中的细胞经收集并适当稀释后，测定600 nm处光密度值（OD600）以评估细胞生物量（Jin et al., 2022）。生物膜发酵和渗漏发酵中的细胞经收集、梯度稀释后涂布于LB琼脂平板，选取含30–300个菌落形成单位（CFU）的平板测定细胞浓度（Yi et al., 2024）。发酵液中残留甘油采用高碘酸氧化法测定（Pott et al., 2013）。MK-7的提取和检测按照先前报道的方法进行（Zhou et al., 2023）。
【数据】生物量测定：OD600；CFU计数：30–300 CFU/平板；残留甘油：高碘酸氧化法；MK-7检测：Zhou et al.（2023）方法
2.4 细胞形态观察
收集不同发酵模式下培养60 h的发酵液样品。样品用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）在4°C下离心洗涤两次以去除残留培养基。洗涤后的细胞用2.5%（v/v）戊二醛溶液在4°C固定12–20 h，随后用PBS洗涤两次。固定样品依次用30%、50%、70%、80%、95%和100%（v/v）乙醇进行梯度脱水（每个浓度在4°C处理20 min）。脱水样品经真空冷冻干燥后立即贴附于导电胶上，喷金镀膜50 s。最后使用扫描电子显微镜（日立公司，日本）观察细胞形态。
【数据】固定液：2.5%（v/v）戊二醛；固定条件：4°C、12–20 h；乙醇梯度：30%/50%/70%/80%/95%/100%（v/v）；脱水时间：每浓度20 min、4°C；喷金时间：50 s；仪器：扫描电子显微镜（Hitachi，日本）
2.5 细胞膜通透性测定
收集不同发酵模式下培养60 h的发酵液样品。细胞经离心并用PBS洗涤两次制备细菌悬液（菌密度为10⁷–10⁸ CFU/mL）。向悬液中分别加入荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI），终浓度分别为3 μg/mL和5 μg/mL，室温避光孵育15 min。随后细胞经离心并用PBS洗涤两次以去除未结合的染料。细胞重悬后分别置于载玻片和流式管中。最后使用荧光显微镜（奥林巴斯公司，日本）和流式细胞仪（贝克曼库尔特公司，美国）评估细胞膜通透性。
【数据】菌悬液密度：10⁷–10⁸ CFU/mL；FDA终浓度：3 μg/mL；PI终浓度：5 μg/mL；孵育条件：室温避光15 min；仪器：荧光显微镜（Olympus，日本）、流式细胞仪（Beckman Coulter，美国）
2.6 GC-IMS分析
GC-IMS分析使用FlavourSpec® GC-IMS仪器（G.A.S.，多特蒙德，德国），参照Xu et al.（2023）的方法并稍作修改。取1 mL发酵上清液置于20 mL顶空瓶中，在60°C孵育20 min。进样针温度设为85°C，进样体积500 μL。高纯氮气（>99.999%）同时用作载气和漂移气。样品经MXT-5毛细管柱（15 m × 0.53 mm，1 μm）分离，柱温设为60°C。载气流速程序如下：0–2 min为2 mL/min；2–10 min线性升至10 mL/min；10–20 min线性升至100 mL/min；20–30 min线性升至150 mL/min；30–40 min维持150 mL/min。IMS温度设为45°C，漂移气流速75 mL/min。
【数据】样品量：1 mL；顶空瓶：20 mL；孵育：60°C、20 min；进样针温度：85°C；进样量：500 μL；载气/漂移气：高纯氮气（>99.999%）；色谱柱：MXT-5（15 m × 0.53 mm，1 μm）；柱温：60°C；载气程序：2→10→100→150 mL/min梯度；IMS温度：45°C；漂移气流速：75 mL/min
2.7 非靶向代谢组学分析
非靶向代谢组学分析使用Vanquish超高效液相色谱系统（Thermo Fisher，德国）联用Q Exactive™ HF/Q Exactive™ HF-X质谱仪（Thermo Fisher，德国）。发酵上清液样品经Hypersil Gold色谱柱（100 × 2.1 mm，1.9 μm；Thermo Fisher，美国）分离，流速0.2 mL/min，线性梯度洗脱总时长12 min。流动相A为含0.1%甲酸的水，流动相B为甲醇。梯度洗脱程序如下：0–1.5 min为2% B；1.5–3 min由2%升至85% B；3–10 min由85%升至100% B；10–10.1 min由100%降至2% B；10.1–12 min维持2% B。质谱仪在正离子和负离子两种模式下运行，扫描范围m/z 100–1500。电喷雾离子源参数设置如下：喷雾电压3.5 kV；鞘气流速35 psi；辅助气流速10 L/min；毛细管温度320°C；S-lens RF电平60；辅助气加热温度350°C。
【数据】色谱柱：Hypersil Gold（100 × 2.1 mm，1.9 μm）；流速：0.2 mL/min；总梯度时间：12 min；流动相A：0.1%甲酸水；流动相B：甲醇；梯度：2% B（0–1.5 min）→2–85% B（1.5–3 min）→85–100% B（3–10 min）→100–2% B（10–10.1 min）→2% B（10.1–12 min）；扫描范围：m/z 100–1500；喷雾电压：3.5 kV；鞘气流速：35 psi；辅助气流速：10 L/min；毛细管温度：320°C；辅助气加热温度：350°C
2.8 数据处理与统计分析
GC-IMS数据使用仪器配套的VOCal分析软件处理。内置Reporter插件用于比较样品间的谱图差异，Gallery Plot插件用于生成挥发性化合物的指纹图谱，Dynamic PCA插件用于主成分分析（PCA）以评估样品间的聚类关系。非靶向代谢组学数据方面，采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）构建分类模型并计算各代谢物的变量投影重要性（VIP）值。采用Student's t检验确定组间差异的统计学显著性（P值），并计算差异倍数（FC）。差异代谢物的筛选标准为VIP > 1且P < 0.05。鉴定到的差异代谢物通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）进行代谢通路注释和富集分析。
【数据】GC-IMS软件：VOCal；差异代谢物筛选：VIP > 1且P < 0.05；统计分析：Student's t检验；通路注释：KEGG数据库
研究结果
3.1 表面活性剂的筛选与优化
在发酵初始阶段添加不同类型表面活性剂以评估其对MK-7产量的影响。如图1A所示，阳离子表面活性剂CTAB和阴离子表面活性剂SDS对细胞表现出强烈的细胞毒性。当添加0.3% CTAB或SDS时，细胞丧失活力，发酵液中未检测到MK-7。相比之下，非离子表面活性剂Brij-58显著提高了MK-7产量。添加0.3% Brij-58时，MK-7总产量达到113.87 mg/L，较对照组提高29.13%，其中胞外MK-7产量达71.41 mg/L，较对照组提高172.97%。这些结果表明，表面活性剂对代谢物分泌的促进作用具有明显的菌株和产物特异性。尽管CTAB和SDS在本研究中不利于MK-7分泌，但已有报道称它们可促进酿酒酵母胞内谷胱甘肽的分泌（Wei et al., 2003）。因此，筛选合适的表面活性剂对提高目标代谢物产量至关重要。
鉴于Brij-58对胞内MK-7分泌表现出显著的促进作用，进一步进行了浓度梯度优化。在0.5% Brij-58添加条件下，MK-7总产量达到129.95 mg/L，较对照提高47.37%，其中胞外MK-7产量达82.63 mg/L，较对照提高215.86%（图1B）。综合考虑MK-7产量的整体提升效果，确定0.5% Brij-58为最佳添加浓度。
同时，生物膜形态观察显示不同发酵模式下生物膜形成速率存在显著差异（图1E）。生物膜发酵组（未添加Brij-58）在48 h时形成致密成熟的生物膜，而渗漏发酵组（添加0.5% Brij-58）的生物膜形成受到明显抑制，直至96 h才完全形成。这一现象可能归因于Brij-58对细胞膜结构的损伤作用，抑制了早期细胞生长繁殖（导致生物量积累缓慢），最终延迟了生物膜形成（Huang et al., 2019）。这种生长抑制作用在不同Brij-58浓度下的细胞生长趋势中得到进一步佐证。在较高Brij-58浓度下，菌株生长初期受到抑制，但72 h后逐渐恢复（图S1），144 h时的生物量与对照组相当。两种发酵模式下的CFU计数表明（图1C），渗漏发酵组的生长速率显著低于生物膜发酵组；尤其在48 h时，总菌落数仅为生物膜发酵组的38.46%。此外，由于细胞生长受到抑制，渗漏发酵组在48 h时MK-7产量积累缓慢（图1D），直至96 h才恢复正常水平。这些结果表明，虽然Brij-58的添加促进了MK-7分泌，但显著延长了整个发酵周期。因此，受先前研究中两阶段发酵策略的启发，本研究提出两阶段渗漏发酵策略，以在有限发酵周期内最大化MK-7产量。
【数据】0.3% CTAB/SDS：细胞失活、无MK-7检出；0.3% Brij-58：总产量113.87 mg/L（+29.13%）、胞外71.41 mg/L（+172.97%）；0.5% Brij-58：总产量129.95 mg/L（+47.37%）、胞外82.63 mg/L（+215.86%）；生物膜形成时间：生物膜发酵组48 h vs 渗漏发酵组96 h；48 h菌落数：渗漏组为生物膜组的38.46%
3.2 两阶段渗漏发酵策略
两阶段渗漏发酵策略如图2A所示。基于细胞生长曲线（图2B），选取submerged发酵的六个代表性生长阶段（0、6、12、18、24和30 h）进行后续渗漏发酵。结果（图2D）显示，两阶段渗漏发酵下的生物膜形成速率与submerged发酵时长密切相关。未经submerged发酵的细胞（0 h）直至96 h才完全形成生物膜；而随着submerged发酵时间的延长，生物膜形成速率显著加快。当submerged发酵时间从6 h逐步延长至30 h时，完全形成生物膜所需时间相应地从66 h缩短至24 h。推测这一现象可能由两个关键机制协同驱动。第一，submerged发酵期间达到的高细胞密度激活了密度依赖的群体感应系统，从而启动生物膜相关基因的表达（Wang, Bian, & Wang, 2022）。第二，随着submerged发酵的进行，培养基中营养物质的持续消耗导致营养缺乏，这种环境应激信号显著增强了细胞的表面黏附倾向，加速了生物膜形成（Wang et al., 2022）。
鉴于营养缺乏可能加速生物膜形成，进一步测定了不同生长阶段发酵液中的残留甘油含量（图2B）。结果显示，甘油消耗与submerged发酵时长呈正相关。甘油不仅是培养基中唯一碳源，也是MK-7合成途径碳流的起始底物（Yang et al., 2018），因此其利用效率可能同时影响生物膜形成和MK-7合成。如图2C所示，两阶段渗漏发酵下MK-7最高产量达到163.56 mg/L，较传统生物膜发酵（88.18 mg/L）提高85.48%。同时，胞外MK-7产量显著提高269.65%，证实了该策略的有效性。
值得注意的是，随着submerged发酵时间的延长，生物膜形成速率持续加快，但MK-7产量并未同步增长，而是在12 h切换时达到峰值后逐渐下降。这表明两种发酵模式间的最佳切换时间并非仅由生物膜形成速率决定，还与细胞生长、营养状况和产物合成能力密切相关。具体而言，6 h切换时细胞处于生长早期，生物量积累不足，导致后续生物膜形成较慢，难以支持高效的MK-7合成。相反，18、24和30 h切换时，虽然生物膜形成速率较快，但残留甘油含量降低可能限制了MK-7的持续合成。而在12 h切换点，细胞生物量已积累到较高水平，培养基中仍保留大量可利用甘油，因此该条件更有利于快速生物膜形成以及MK-7的合成与分泌。
【数据】生物膜完全形成时间：0 h切换组96 h、6 h切换组66 h、30 h切换组24 h；最大MK-7产量：163.56 mg/L（12 h切换）；较生物膜发酵（88.18 mg/L）+85.48%；胞外MK-7：+269.65%
3.3 细胞形态和膜通透性的变化
以往研究表明，表面活性剂可通过增加膜通透性促进胞内代谢物的分泌。然而，在本研究建立的两阶段渗漏发酵中，关于表面活性剂对细胞形态和膜通透性具体影响的直接显微证据仍然缺乏。因此，采用扫描电子显微镜、荧光显微镜和流式细胞术观察两阶段渗漏发酵下细胞形态和膜通透性的变化，以阐明这些变化与MK-7产量提升之间的关联。
如图3A所示，生物膜发酵下的细胞呈现典型的长杆状形态，表面光滑、结构完整，无明显缺陷。相比之下，两阶段渗漏发酵下的细胞（图3B）表面出现明显的褶皱和凹陷，部分细胞表面可见孔洞或裂痕，表明Brij-58处理确实对细胞膜结构造成了损伤。荧光显微镜观察结果（图3C和3D）进一步证实了这一发现。在生物膜发酵组中，FDA染色阳性（绿色荧光）的活细胞占绝对优势，PI染色（红色荧光）的细胞极少；而在两阶段渗漏发酵组中，PI阳性细胞比例显著增加，表明细胞膜完整性受损、通透性增大。流式细胞术的定量结果与荧光显微镜观察一致，两阶段渗漏发酵组的PI阳性细胞比例显著高于生物膜发酵组。
【数据】细胞形态：生物膜发酵组长杆状、表面光滑完整；两阶段渗漏发酵组表面褶皱凹陷、可见孔洞裂痕；PI阳性细胞比例：两阶段渗漏发酵组显著高于生物膜发酵组（原文未给出具体数值）
3.4 GC-IMS挥发性代谢物分析
采用GC-IMS技术分析发酵过程中（0 h、12 h和60 h）挥发性化合物的动态变化。二维谱图（图4A）显示，不同发酵时间点的挥发性化合物谱存在明显差异。二维差谱（图4B）进一步突出了不同时间点之间的谱图差异。指纹图谱（图4C）展示了挥发性化合物的种类和含量变化，结果显示随着发酵的进行，多种挥发性化合物的种类和含量均发生显著变化。PCA得分图（图4D）显示，三个时间点的样品在得分图上形成明显分离的聚类，表明不同发酵阶段的挥发性代谢特征存在显著差异。
【数据】GC-IMS分析时间点：0 h、12 h、60 h；PCA显示三个时间点样品明显分离（原文未给出具体主成分贡献率数值）
3.5 非靶向代谢组学分析
采用非靶向代谢组学分析发酵过程中（0 h、12 h和60 h）非挥发性代谢物的动态变化。PCA得分图（图5A）和PLS-DA得分图（图5B）均显示三个时间点的代谢谱存在明显分离，表明发酵过程中代谢物组成发生显著变化。差异代谢物分析（12 h vs 0 h）的火山图（图5C）和KEGG通路富集气泡图（图5D）显示，在第一阶段（submerged发酵，0–12 h），差异代谢物显著富集于中心碳代谢相关通路，包括糖酵解、三羧酸循环和芳香族氨基酸生物合成等通路。这些通路的激活表明第一阶段中心碳代谢高度活跃，为细胞生长和MK-7前体积累奠定了物质基础。
第二阶段（60 h vs 12 h）的差异代谢物火山图（图5E）和KEGG通路富集气泡图（图5F）显示，在渗漏发酵阶段，碳流可能被分流至次级代谢通路。同时，与氧化应激相关的代谢物和通路在第二阶段显著富集，提示Brij-58可能诱导了氧化应激反应。
【数据】代谢组学时间点：0 h、12 h、60 h；差异代谢物筛选：VIP > 1且P < 0.05；第一阶段富集通路：中心碳代谢（糖酵解、TCA循环）、芳香族氨基酸生物合成；第二阶段富集通路：次级代谢、氧化应激相关通路
3.6 MK-7生物合成通路及关键代谢物变化分析
图6展示了MK-7生物合成通路及两阶段渗漏发酵中关键代谢物的变化。不同颜色的箭头代表不同的代谢途径，代谢物下方的色块表示基于Log2FC值的相对含量变化（左侧：12 h vs 0 h；右侧：60 h vs 12 h）。在第一阶段（0–12 h），糖酵解途径的中间代谢物和芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）含量显著上调，表明中心碳代谢活跃，为MK-7前体（如异戊烯焦磷酸IPP和二甲基烯丙基焦磷酸DMAPP）的合成提供了充足碳源和能量。在第二阶段（12–60 h），部分中心碳代谢中间物含量下降，而次级代谢相关代谢物含量上升，提示碳流发生了重定向。同时，与氧化应激相关的代谢物（如谷胱甘肽代谢相关物质）含量显著变化，支持Brij-58诱导氧化应激的假说。
【数据】第一阶段（12 h vs 0 h）：糖酵解中间物和芳香族氨基酸含量上调（基于Log2FC值）；第二阶段（60 h vs 12 h）：中心碳代谢中间物下降、次级代谢物上升、氧化应激相关代谢物变化（原文未给出具体Log2FC数值）
讨论与解读
本研究成功建立并验证了以枯草芽孢杆菌突变株BS02为起始菌株的两阶段渗漏发酵策略。submerged发酵12 h后添加0.5% Brij-58进行渗漏发酵，MK-7总产量达163.56 mg/L，较传统生物膜发酵提高85.48%，胞外产量显著增加269.65%。扫描电镜、荧光显微镜和流式细胞术结果证实，Brij-58诱导的膜通透性增加是MK-7产量提升的关键因素之一。GC-IMS和非靶向代谢组学分析揭示，第一阶段（submerged发酵）中溢流代谢物的检出和芳香族氨基酸代谢通路的富集反映了高度活跃的中心碳代谢，为细胞生长和MK-7前体积累奠定了物质基础；第二阶段（渗漏发酵）中碳流可能被分流至次级代谢通路。同时发现，膜通透性的增加可能归因于Brij-58诱导的氧化应激，从而促进胞内代谢物外排，有效缓解了胞内MK-7过度积累造成的产物反馈抑制。
【编译者解读】该研究最值得借鉴之处在于将"表面活性剂促分泌"这一经典策略与两阶段发酵设计巧妙结合——先用 submerged发酵快速积累生物量，再用渗漏发酵强化产物外排，从时间和空间两个维度解耦了"生长"与"生产"的矛盾。代谢组学与膜生理表征的多维度证据链也为同类微生物产物的产量瓶颈突破提供了可复用的分析范式。不足之处在于氧化应激与膜通透性之间的因果关系仍以推测为主，后续若能引入抗氧化剂回补实验或膜脂组学分析，机制闭环将更加完整。
参考来源
Tao, W. (2026). Enhancing MK-7 production in a Bacillus subtilis mutant strain via a two-stage leakage fermentation strategy and revealing metabolic mechanisms. Food Bioscience. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109215
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109215