来源：Engineering Saccharomyces cerevisiae for ethanol production from glycerol, xylose, acetic acid, and glucose（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
全球生物乙醇年产量已超1100亿升，但酿酒酵母可发酵碳源范围有限，制约产业扩张。本研究在前期可发酵甘油与葡萄糖的工程菌株SK-FGG4基础上，通过CRISPR基因编辑整合木糖代谢模块、乙酰化乙醛脱氢酶及乙酸同化强化元件，构建出能同时高效共发酵甘油、木糖、乙酸和葡萄糖的多碳源菌株SK2-5。微好氧条件下，该菌株理论乙醇转化效率超过95%，为甘油整合生物精炼提供了灵活代谢平台。
研究背景
酿酒酵母是第一代生物乙醇生产的主力菌株，能高效发酵葡萄糖、果糖和半乳糖等己糖，但依赖粮食来源的底物限制了其规模化发展。木质纤维素生物质富含纤维素、半纤维素和木质素，是可再生的丰富替代资源，但其顽抗结构给经济高效的糖化和发酵带来挑战。木糖是木质纤维素中含量第二的糖，野生酿酒酵母无法天然发酵。基于毕赤酵母木糖还原酶（PsXR）、木糖醇脱氢酶（PsXDH）和天然木酮糖激酶（XK）的真菌途径虽可实现木糖-葡萄糖共发酵，但NAD(P)H依赖的PsXR与NAD⁺依赖的PsXDH之间的氧化还原不平衡常导致木糖醇积累。已有研究通过蛋白质工程和删除ALD6、PHO13等基因改善木糖利用和乙醇产量。甘油作为生物柴油生产的主要副产物，近年来被视为新兴综合生物精炼中既有前景的生物质预处理溶剂又可发酵的底物。然而，天然酿酒酵母无法高效发酵甘油、木糖或乙酸，此前也无一株工程菌能同时共发酵这些底物与葡萄糖。
研究方法
2.1 培养基配制
所有培养基成分均为高分析纯级。YPD培养基每升含10 g酵母提取物、20 g蛋白胨和20 g葡萄糖，用于酵母菌株的常规维持和生长。添加1.8%琼脂固化制备琼脂平板。YPD培养基添加遗传霉素（G418）后称为YPDG418，用作CRISPR系统的选择性培养基。无氨基酸酵母氮源基础培养基（YNB）按6.7 g/L配制，添加20 g/L葡萄糖和20 mg/L组氨酸，称为YNBD20H，用于LEU2位点成功整合的选择培养基。YNBD20（含20 g/L葡萄糖、无额外补充的YNB培养基）用于HIS3位点阳性重组子的筛选。发酵实验在YP培养基中添加50 g/L甘油、30 g/L葡萄糖、15 g/L木糖和5 g/L乙酸，用6 M NaOH调pH至5.6，称为YPGly50Glu30X15A5。最终实验中乙酸浓度提高至8 g/L，得到YPGly50Glu30X15A8。为测试单一碳源发酵，用YNB替代YP，使用YNBGly50Glu30X15A5。所有液体培养基均经膜过滤灭菌（TPP真空过滤装置，'rapid-Filtermax'，0.2 µm PES，瑞士），以避免高压灭菌过程中葡萄糖和木糖降解产生抑制性产物。大肠杆菌使用Luria-Bertani（LB）培养基培养，含1%胰蛋白胨、1%氯化钠（NaCl）和0.5%酵母提取物。LB培养基中添加150 µg/mL氨苄青霉素筛选携带氨苄青霉素抗性质粒的大肠杆菌，添加75 µg/mL卡那霉素筛选和培养携带pCas9多元件质粒的大肠杆菌。
【数据】YPD：酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L；琼脂：1.8%；G418：原文未详述；YNB：6.7 g/L；YNBD20H：葡萄糖20 g/L、组氨酸20 mg/L；YPGly50Glu30X15A5：甘油50 g/L、葡萄糖30 g/L、木糖15 g/L、乙酸5 g/L，pH 5.6（6 M NaOH调）；YPGly50Glu30X15A8：乙酸8 g/L；滤膜：0.2 µm PES；LB：1%胰蛋白胨、1% NaCl、0.5%酵母提取物；氨苄青霉素：150 µg/mL；卡那霉素：75 µg/mL
2.2 木糖代谢模块的设计与克隆
木糖代谢途径构建为包含三个基因盒的单一模块：PsXR、PsXDH和XK。PsXDH基因盒由TDH3启动子和突变的DIT1终止子（称为DIT1td22）组成。使用高保真KOD-plus neo聚合酶（Toyobo，大阪，日本）和Astec热循环仪（GeneAtlas，日本）从天然酵母菌株D452-2的基因组DNA扩增TDH3p。基因组DNA提取采用简易方法：用牙签从琼脂平板菌落取样活性细胞，在30 mM NaOH中裂解，95°C加热10 min。引物根据酿酒酵母基因组数据库（S288C）信息设计。为支持CRISPR诱导双链断裂过程中的同源重组，使用长合成引物在TDH3p的ALD6起始密码子上游添加约50 bp序列，以XhoI位点开始，以NotI位点结束。天然PsXDH基因通过PCR从含PsXDH的pPGK质粒获取，起始密码子前添加NotI位点，终止密码子后添加BamHI位点。DIT1td22来自先前构建的M1质粒，以BamHI位点开始，以FAB1p侧翼区域结束。所有片段经各自限制性内切酶切割后，PsXDH基因盒片段连接并经PCR扩增。此外，该基因盒在TDH3上游添加SalI位点、DIT1td22下游添加XhoI位点，构建pXDH-HIS3质粒。含上游DIT1td22侧翼区域的FBA1p从基因组DNA经PCR获取，下游末端修饰添加NotI位点。PsXR基因获取方式与PsXDH基因类似。DIT1td22制备方式相似，但侧翼区域替换为XhoI位点。基因盒组件组装后，片段经酶切、连接并作为PCR模板生成PsXR基因盒。PsXR和PsXDH基因盒随后经PCR结合，再用XhoI切割克隆到pXK-HIS3质粒的碱性磷酸酶处理SalI位点，形成pXDH-XR-XK-HIS3质粒。pXK-HIS3质粒通过克隆XK基因盒构建，该基因盒通过从天然菌株基因组DNA扩增PGKp和XK基因并在SalI和BamHI位点酶切获得。BamHI-RPL41B终止子从基因组DNA扩增，含ALD6终止密码子下游54 bp侧翼区域，以XhoI位点结束。随后与PGKp-PsXR连接形成SalI/XhoI-XK基因盒。该基因盒随后克隆到截短HIS3质粒中，形成pXK-HIS3质粒。质粒通过热激法转化至大肠杆菌NEB 10-beta，按New England Biolabs（东京，日本）提供的方案进行回收、保存和使用。使用QIAprep Spin miniprep试剂盒（QIAGEN，希尔登，德国）从过夜培养物中提取质粒。木糖代谢模块完整序列经测序确认。
【数据】裂解：30 mM NaOH；加热：95°C、10 min；同源臂：约50 bp；酶切位点：XhoI、NotI、BamHI、SalI；侧翼区域：54 bp；聚合酶：KOD-plus neo；热循环仪：Astec GeneAtlas
2.3 乙酰化乙醛脱氢酶质粒的构建
合成密码子优化的SeEutE基因（先前克隆到EutE-YEpM4质粒中）作为PCR模板，使用长引物添加GPP1、NDE1和NDE2基因的侧翼区域。为将基因盒及其侧翼区域克隆到HIS3质粒中，使用各自引物引入SalI和XhoI位点。由此构建了pEutE-GPP1-HIS3、pEutE-NDE1-HIS3和pEutE-NDE2-HIS3质粒。
【数据】模板：SeEutE-YEpM4；酶切位点：SalI、XhoI；质粒：pEutE-GPP1-HIS3、pEutE-NDE1-HIS3、pEutE-NDE2-HIS3
2.4 含JEN1基因和突变ACS1 L707P基因的YEpM4质粒构建
首先，使用所列引物通过PCR从D452-2菌株基因组DNA扩增JEN1。JEN1片段随后用NotI和BamHI切割，通过限制性酶切替换先前构建的SeEutE-YEpM4质粒中的SeEutE基因，得到JEN1-YEpM4质粒。ACS1的定点突变在从基因组DNA扩增ACS1过程中用所列引物完成，导致707位亮氨酸替换为脯氨酸（ACS1 L707P）。突变位点基于AlphaFold2比对的Acs1与先前突变的SeACS1L641P选择，该突变通过赖氨酸乙酰化防止葡萄糖翻译后抑制，并保留乙酰辅酶A合成酶活性。这一修饰有利于从乙酸持续产生胞质乙酰辅酶A，尤其在线粒体乙酰辅酶A供应受限的微好氧条件下。ACS1 L707P随后用NotI和SacII切割，连接到TDH3p和DIT1td22之间。连接产物作为PCR模板扩增ACS1 L641P基因盒，随后用SalI/XhoI切割，克隆到先前经SalI位点切割和碱性磷酸酶处理的JEN1-YEpM4质粒中，构建ACS1L707P-JEN1-YEpM4质粒。质粒从大肠杆菌提取后确认突变和全序列。
【数据】酶切位点：NotI、BamHI、SacII、SalI/XhoI；突变：ACS1 L707P（亮氨酸→脯氨酸）；参考突变：SeACS1L641P
2.5 pCas9多元件质粒组装
靶向甘油-3-磷酸磷酸酶（GPP1）的pCas9多元件质粒组装遵循p……（原文此段截断）
研究结果
3.1 甘油-木糖-乙酸与葡萄糖的有氧发酵追踪
在工程化酿酒酵母用于第二代生物乙醇生产方面已取得重要进展，特别是木糖-葡萄糖和葡萄糖-乙酸共发酵。也有研究探索了甘油-葡萄糖共利用或甘油与木糖的共培养。然而，尚无单一菌株被报道能发酵甘油、木糖、乙酸和葡萄糖。为解决这一问题，我们工程化了一株能发酵全部四种底物的菌株。作为基线，亲本菌株D452-2在YPGly50Glu30X15A5培养基中测试。葡萄糖被快速消耗，但木糖摄取缓慢。甘油水平增加1.3 g/L，乙酸在葡萄糖消耗期间从4.5 g/L升至5.1 g/L。葡萄糖耗尽后，乙醇被重新同化，乙酸下降约1 g/L。木糖醇和2,3-丁二醇（2,3-BDO）分别积累至3.1 g/L和0.8 g/L，乙醇峰值达11.9 g/L，OD600达15。这些结果反映该菌株木糖利用有限，木糖醇积累可能反映天然醛糖还原酶（如GRE3）的活性——将木糖转化为木糖醇，而缺乏利用甘油或乙酸的能力与其他报道一致。
相比之下，工程菌株SK-FGG4在29 h内共消耗29.4 g/L葡萄糖、4.2 g/L木糖、41.4 g/L甘油和0.6 g/L乙酸，产生30.5 g/L乙醇，木糖醇和2,3-BDO分别为4.0 g/L和3.9 g/L。这对应79.6%的理论乙醇得率和94%的总转化效率，与先前报道一致。XI途径虽具有氧化还原中性和减少木糖醇积累的优点，但通常需要适应性进化才能达到高稳健性。相比之下，XR/XDH系统支持更高的木糖摄取速率和增加的胞内NADH生成，这对乙酸转化为乙醇至关重要——每摩尔乙醇需要两摩尔NADH。在我们的设计中，选择PsXR/PsXDH为共利用乙酸提供额外NADH并改善木糖发酵。为进一步优化碳通量，ALD6被删除并替换为PsXR–PsXDH–XK模块。这种重排既消除了无效的乙酸循环，又通过氧化性戊糖磷酸途径增强了NADPH生成。所得菌株SK-FGGX在29 h内共消耗12.8 g/L木糖、45.4 g/L甘油和2.1 g/L乙酸，产生37.8 g/L乙醇（82.4%理论值），副产物大幅减少（木糖醇0.63 g/L，2,3-BDO 2.2 g/L），生物量OD600 = 33.7。
为进一步增强工程菌株，SK1-1中删除了GPP1以抑制甘油生物合成，SK1-2中NDE1被SeEutE替换。SK1-2表现优于SK1-1，消耗13.0 g/L木糖、2.7 g/L乙酸和46.4 g/L甘油，产生39.8 g/L乙醇。SK1-1产生37.6 g/L乙醇，转化效率略高（91.9%对91.6%）。单因素方差分析与Duncan检验（P < 0.05）确认差异显著。
【数据】D452-2：甘油增加1.3 g/L；乙酸4.5→5.1 g/L；木糖醇3.1 g/L；2,3-BDO 0.8 g/L；乙醇峰值11.9 g/L；OD600 15。SK-FGG4：29 h消耗葡萄糖29.4 g/L、木糖4.2 g/L、甘油41.4 g/L、乙酸0.6 g/L；乙醇30.5 g/L；木糖醇4.0 g/L；2,3-BDO 3.9 g/L；理论乙醇得率79.6%；总转化效率94%。SK-FGGX：29 h消耗木糖12.8 g/L、甘油45.4 g/L、乙酸2.1 g/L；乙醇37.8 g/L（82.4%理论值）；木糖醇0.63 g/L；2,3-BDO 2.2 g/L；OD600 33.7。SK1-2：消耗木糖13.0 g/L、乙酸2.7 g/L、甘油46.4 g/L；乙醇39.8 g/L。SK1-1：乙醇37.6 g/L；转化效率91.9% vs 91.6%；P < 0.05
3.2 工程菌株SK2-2至SK2-5的半好氧发酵能力
鉴于菌株SK1-2优于SK1-1的表现，我们评估了其在半好氧条件下的行为（100 mL摇瓶中20 mL培养物），此时氧气传递受限。特别是在乳酸乳球菌产水NADH氧化酶（LlNoxE）存在的情况下——该酶在先前构建甘油发酵菌株SK-FGG4时已引入。半好氧条件下，SK1-2在29 h内消耗所有可用葡萄糖以及12.8 g/L木糖、38.9 g/L甘油和2.5 g/L乙酸。值得注意的是，乙醇产量保持不变，仍为39.8 g/L——与完全好氧条件下观察到的完全相同。然而，氧气可用性的变化导致理论乙醇转化率提高至89.1%，表明在氧气受限条件下碳到乙醇的效率增强。
为解决半好氧条件下观察到的较慢发酵速率，我们通过在菌株SK1-2中工程化两个关键组分来增强乙酸代谢：（i）单羧酸/质子共转运体JEN1，和（ii）突变型乙酰辅酶A合成酶ACS1 L707P。由此构建菌株SK2-2。同时，通过用SeEutE替换NDE2生成菌株SK2-3，以进一步改善胞质NADH氧化。两种修饰均旨在通过乙酸通量促进NADH周转并强化氧化还原稳态。与SK1-2相比，SK2-2和SK2-3均表现出葡萄糖、木糖、甘油和乙酸共利用的改善。值得注意的是，SK2-2中乙酸同化显著增强，达3.5 g/L，而SK2-3为2.9 g/L。这转化为更高的乙醇滴度：SK2-2为42.0 g/L，SK2-3为39.7 g/L，证实了直接增强乙酸通量的有效性。
为评估两种策略的联合效应，将SeEutE引入SK2-2背景，生成菌株SK2-4。这种协同配置进一步改善了乙酸利用（3.9 g/L，高于SK2-2的3.5 g/L），并将木糖醇积累从1.8 g/L降至1.2 g/L。乙醇产量相应增加至42.8 g/L，支持了协调氧化还原和通量平衡在优化多碳发酵中的作用。
为进一步验证和增强这一配置，我们通过在SK2-4背景中引入额外拷贝的PsXDH构建了多碳菌株SK2-5。这一修饰改善了木糖向木酮糖的转化并加强了氧化还原耦合。结果，SK2-5（称为multi carbon）表现出木糖、甘油和乙酸摄取的改善，同时将木糖醇积累降至0.6 g/L。该菌株实现最高乙醇滴度43.2 g/L（1.49 g/L/h），对应92.7%的理论乙醇转化率。Duncan多重比较检验显示菌株SK1-2、SK2-2、SK2-3、SK2-4和SK2-5之间乙酸消耗存在显著差异（P < 0.05）。这些结果表明，氧化还原和通量优化的菌株能够实现多种木质纤维素碳源的高效高得率共发酵。
【数据】SK1-2半好氧：29 h消耗葡萄糖全部、木糖12.8 g/L、甘油38.9 g/L、乙酸2.5 g/L；乙醇39.8 g/L；理论转化率89.1%。SK2-2：乙酸3.5 g/L；乙醇42.0 g/L。SK2-3：乙酸2.9 g/L；乙醇39.7 g/L。SK2-4：乙酸3.9 g/L；木糖醇1.8→1.2 g/L；乙醇42.8 g/L。SK2-5：木糖醇0.6 g/L；乙醇43.2 g/L（1.49 g/L/h）；理论转化率92.7%；P < 0.05
3.3 增加培养体积对发酵特性的影响
为进一步研究氧气可用性的影响，我们比较了多碳菌株在两种培养体积——20 mL和30 mL——下的发酵曲线，条件为100 mL锥形瓶、250 rpm、YPGly50Glu30X15A5培养基。图4A和4B显示两种条件下葡萄糖和木糖消耗无显著差异。然而，当培养体积增加至30 mL时，甘油消耗下降约15%，表明氧气传递效率降低。而乙酸消耗统计学上显著增加9%，30 mL条件下消耗4.4 g/L……
【数据】20 mL vs 30 mL：葡萄糖和木糖消耗无显著差异；甘油消耗下降约15%；乙酸消耗增加9%，30 mL消耗4.4 g/L
讨论与解读
本研究首次成功构建了一株能同时共利用甘油、木糖、乙酸和葡萄糖产乙醇的酿酒酵母菌株。所得多碳菌株在微好氧条件下实现超过95%的转化效率，拓展了底物范围，解决了传统糖基发酵的局限性。该平台为新兴生物精炼——特别是富含甘油和乙酸的有机溶剂法和生物柴油预处理流——提供了有前景的整合潜力。虽然摇瓶实验为代谢性能提供了有价值的见解，但不能完全模拟工业发酵动态。氧气传递限制、氧化还原稳态和抑制剂耐受性——尤其是木质纤维素水解液中的——仍是进一步优化的方向。未来工作将集中于在受控生物反应器系统中使用真实生物质水解液验证菌株性能，并微调氧化还原和碳通量以提高乙醇产量和工艺稳健性。
编译者解读
该研究的技术路线体现了典型的"模块化代谢工程"思维——将木糖同化、乙酸同化和氧化还原平衡拆解为独立遗传模块，逐层叠加到同一菌株背景中。方法上值得称道的是选择XR/XDH途径而非XI途径，主动利用其产生额外NADH的特性来驱动乙酸还原为乙醇，实现氧化还原协同而非仅仅消除不平衡。ACS1 L707P的定点突变设计也颇具巧思，针对乙酸同化的限速环节精准改造。不过，摇瓶实验与工业发酵罐之间存在显著放大差距，特别是氧气传递系数和抑制剂耐受性方面，从"菌株可行"到"工艺可行"仍有相当距离。未来若能在真实水解液中验证并配合适应性进化，该平台的工业应用潜力将更为可观。
参考来源
Khattab, S. M. R. Engineering Saccharomyces cerevisiae for ethanol production from glycerol, xylose, acetic acid, and glucose. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132921
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132921