来源：Asymmetrical end structures of leading and lagging telomeres in Saccharomyces cerevisiae dictate the nature of the end replication problem（Cell Reports）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
端粒复制不完全导致的末端复制问题是衰老研究中的经典命题。本研究利用合成生物学手段，在酿酒酵母中构建了可诱导的从头端粒系统，精确解析了DNA复制后两条子代端粒的不同命运：滞后链端粒携带约10 nt的3′突出端，而前导链端粒则具有由Yku蛋白保护的平末端。更关键的是，RNase H2负责去除末端RNA引物，其缺失导致RNA引物滞留，反而减缓了端粒缩短并延迟了端粒酶缺失细胞的衰老。这一发现颠覆了传统"填充合成模型"的认知。
研究背景
端粒保护真核生物染色体末端免遭降解和融合。在芽殖酵母酿酒酵母中，端粒DNA由约300 bp的TG1-3/C1-3A重复序列组成，末端是约10–15 nt的富含G的3′突出端。Rap1-Rif1/2和Cdc13-Stn1-Ten1等蛋白复合物保护这一结构，防止末端被识别为双链断裂并调控端粒酶招募。
"末端复制问题"源于端粒DNA的半保留复制。滞后链端粒的加工涉及去除末端RNA引物，这导致每轮细胞周期中亲本DNA模板复制不完全，端粒逐渐缩短，最终引发细胞衰老。以往研究在酵母端粒上一致检测到3′突出端，因此"填充合成模型"被广泛接受——该模型认为平末端的前导链复制中间体经过5′切除、填充合成和RNA引物去除，产生与滞后链端粒相同的3′突出端，两条末端每轮复制各缩短约5 bp。
研究方法
关键资源
本研究使用的主要试剂包括：碘化丙啶（Sigma, P4170）、羟基脲（Sigma, H8627）、诺考达唑（Sigma, M1404）、蛋白酶K（Sigma, P6556）、半乳糖（Sigma, G5388）、溶壁酶（Sigma, L4025）、裂解酶（Sigma, L3768）、Exo I（NEB, M0293L）、RNase H（NEB, M0297L）、β-琼脂糖酶I（NEB, M0392S）、核酸外切酶T（NEB, M0265L）、核酸外切酶VII（NEB, M0379L）、Klenow片段exo-（NEB, M0212L）、T4 DNA聚合酶（NEB, M0203L）、Klenow片段（NEB, M0210L）、T4多核苷酸激酶（NEB, M0201L）、USER（NEB, M5505S）、Q5U®热启动高保真DNA聚合酶（NEB, M0515L）、快速连接试剂盒（NEB, M2200L）、dCTP（TaKaRa, 4028）、末端转移酶（TaKaRa, 2230B）、RNase A（Thermo Fisher, EN0531）、EcoRV（Thermo Fisher, FD0304）、BamHI（Thermo Fisher, FD0054）、XhoI（Thermo Fisher, FD0694）、Qubit™ 1X dsDNA HS检测试剂盒（Thermo Fisher, Q33230）、Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1（Thermo Fisher, 65001）、KAPA HiFi HotStart ReadyMix试剂盒（Roche, 7958935001）、VAHTS Multiplex Oligos Set 4 for Illumina（Vazyme, N321）、KOD FX Neo（TOYOBO, KFX-201）、Zymolyase 20T（MP Biomedicals, 08320922）。
关键商业试剂盒包括：化学发光核酸检测模块（Thermo Fisher, 89880）、SuperSignal™ West Atto（Thermo Fisher, A38556）、CHEF一次性插件模具（Bio-Rad, 170-3593）、T-载体克隆试剂盒（TaKaRa, 6013）、QIAEX II试剂盒（QIAGEN, 20021）。
实验模型与菌株
从头端粒系统所用细胞为酿酒酵母菌株ygk171的衍生株：MATa, his3-1, ura3-1, leu2-3, ade2-1, can1-100。在leu2-3位点插入LEU2-Cas9-gRNA表达盒；在MNT2基因位点插入ADE2标记；在ADH4基因位点插入KanMX-TG250片段。衰老实验所用菌株为SY14背景（MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）的衍生株。所有酵母菌株列于表S1。
基因敲入通过PCR扩增DNA产物介导的同源重组，随后进行醋酸锂转化，阳性克隆经PCR验证，所得菌株作为WT对照。基因敲除突变体通过质粒（酵母整合质粒pRS300系列）或PCR片段介导的基因敲除产生。
质粒构建
整合Cas9-gRNA表达质粒：pTEF1-NLS-Cas9-NLS-tCYC1从pCas9质粒PCR扩增，筛选标记URA3从pRS316质粒PCR扩增，通过重叠PCR获得URA3-Cas9片段，整合到leu2-3位点实现Cas9组成型表达。Gal10启动子从pCas9质粒PCR扩增，gRNA-tCYC1从pCgRNA质粒PCR扩增，gRNA序列（5′-ATATTATCCCATTCCATGCG-3′，PAM: TGG）通过重叠PCR引入，筛选标记LEU2从pRS315质粒PCR扩增。LEU2-pGAL10-gRNA-tCYC1片段通过重叠PCR获得，整合到leu2-3-URA3位点实现gRNA的半乳糖诱导型表达并替换URA3标记。
整合TG250-gRNA质粒：构建TG250整合质粒时，将ADH4位点的500 bp上游同源臂、450 bp下游同源臂和选择性标记KanMX PCR扩增后通过infusion克隆整合到pRS313质粒。合成的TG250-gRNA盒经NotI和EcoRI酶切从克隆载体释放，连接到pRS313-ADH4-KanMX-ADH4质粒。ADH4-KanMX-TG250-gRNA-ADH4片段经PCR扩增用于酵母转化，阳性克隆经PCR鉴定、Southern blot和Sanger测序验证。
从头端粒诱导与细胞周期监测
细胞在不含腺嘌呤的合成培养基（2%葡萄糖）中培养。从头端粒形成实验中，诱导前细胞在YEP-2%棉子糖中稀释培养4 h达到对数期，然后分别加入诺考达唑（Sigma）至终浓度5 μg/mL或α因子（Sangon Biotech）至终浓度50 ng/mL同步化2 h。最后向培养基中加入半乳糖（Sigma）诱导gRNA表达，在指定时间点收集细胞。细胞周期阻滞通过FACS分析确认。
细胞周期释放实验中，细胞先用半乳糖培养3 h诱导gRNA表达和从头端粒形成，然后用终浓度250 mM羟基脲（HU, Sigma）阻滞在早期S期2 h。加入葡萄糖完全阻断gRNA表达2 h。随后洗去HU，细胞用新鲜YPD培养基释放进入细胞周期。60 min后加入诺考达唑防止第二轮细胞周期，在不同时间点收集细胞。细胞周期进程通过FACS分析确认。
细胞倍增实验中，非同步化的端粒酶缺失细胞在半乳糖中培养8 h，然后在YPD培养基中稀释至约OD600 = 0.25，此后每12 h（约5–6 PDs）稀释和收集，直至48–60 h。细胞倍增通过分光光度计测量OD600确认。
细胞衰老实验
从等基因TLC1缺失菌株中挑取单克隆用于细胞衰老分析。细胞在YPD培养基中培养至稳定期，每24 h用分光光度计测量细胞密度（OD600）。培养物用新鲜YPD培养基稀释至约OD600 = 0.01。传代重复14天（SY142tCYC1细胞为16天）。
流式细胞术（FACS）
细胞先用无菌ddH2O洗涤一次，然后用70%乙醇充分混合固定，4°C过夜保存。固定细胞用50 mM柠檬酸钠（pH 7.2）洗涤，重悬于含200 μg/mL RNase A（Thermo Fisher）的柠檬酸钠中，37°C孵育3 h；加入终浓度200 μg/mL蛋白酶K（Sigma），50°C孵育1 h。细胞洗涤后超声处理，用10 μg/mL碘化丙啶（PI, Sigma）室温染色1 h。使用BD Forteasa进行DNA含量FACS分析，数据用FlowJo软件分析。
DNA提取
各时间点收集的细胞保存于−80°C，使用温和方案平行提取基因组DNA。细胞先用终浓度1.5 mg/mL的Zymolyase 20T在1 M山梨醇缓冲液中消化，然后重悬于裂解缓冲液，进行酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。DNA溶于水后，用RNase A孵育进一步纯化。RNA引物检测实验中省略RNase A处理，改为RNase H（NEB）37°C消化2 h。提取的DNA用EcoRV或BamHI在37°C消化2 h，然后加入Exo I（NEB）……
研究结果
具有长端粒序列的从头端粒对末端加工具有抗性
在酿酒酵母中，单倍体细胞拥有32条端粒，每条端粒的长度在细胞间和同一细胞内均存在差异。复制后的端粒末端加工涉及10–30 nt的微妙变化，使得监测单一天然端粒变得困难。此外，短端粒优先被端粒酶延伸，随后进行填充合成，进一步增加了检测端粒末端加工的复杂性。
为精确解析末端加工事件，本研究利用了一种已知具有灵敏读出的从头长端粒诱导系统。工程化染色体臂包含250 bp TG1-3/C1-3A端粒序列，侧翼是特异性CRISPR-Cas9 guide RNA（gRNA）靶向位点和KanMX基因。gRNA识别位点附近的(TGG(TG)5)2序列被设计为：如果从头端粒以3′突出端终止，该序列对Rap1不可读但对Cdc13可读（图1A）。半乳糖诱导gRNA表达后，组成型表达的Cas9在靶位点产生双链断裂，形成具有平末端的从头端粒（图1A）。
通过天然Southern blot评估了G2/M期从头长端粒的高效诱导（图1B和S1B–S1D）。从头端粒末端区域的信号（以E-TRF [EcoRV消化的末端限制性片段]表示）随诱导时间增加而增强（图1B），这与从头长端粒的高稳定性一致——它们不是端粒酶的有利靶标。
为详细检查从头端粒的末端结构，研究使用了大肠杆菌核酸外切酶I（Exo I），这是一种广泛用于体外去除端粒DNA末端3′突出端的单链DNA核酸外切酶。Exo I活性在多种寡核苷酸上得到验证（图S1E）。当这些寡核苷酸在天然PAGE上分离时，双链DNA的长度和3′突出端的长度均影响其迁移率——3′突出端越长，Exo I消化前迁移速率越慢（图S1F）。Exo I消化突出端后，其迁移速率不同程度加快（图S1F）。变性Southern blot证实CA链不受Exo I影响（图S1G），但富含TG的突出端被Exo I有效修剪（图S1H）。这些寡核苷酸在后续实验中用作标记。
当Exo I消化应用于E-TRF时，107-bp条带的迁移在任何诱导时间点均不受影响（图1C），表明从头端粒是平末端的。研究还发现，G1期形成的从头端粒与G2/M期的行为相同（图S1I和S1J）。这些结果表明从头端粒以平末端形式稳定存在。
【数据】端粒序列长度：250 bp；诱导时间：0–240 min；E-TRF条带：107 bp；Exo I消化：37°C；G1与G2/M期行为一致
Yku保护从头端粒免受Exo1介导的切除
端粒通常被Rap1、Rif1、Rif2和Yku结合并保护。为研究稳定从头端粒末端的维持是否需要Yku或Rif2，研究评估了yku70Δ和rif2Δ细胞在G2/M期阻滞时从头端粒的末端结构。
在yku70Δ细胞中（图1D），检测到一条迁移较慢的条带（图1E，洋红色箭头），Exo I处理后转变为<87 bp的明显条带（图1E，蓝色箭头）。进一步的变性Southern blot证实，部分初始107 nt CA链被切除为103或83 nt（图1F）。TG链在Exo I处理前为107 nt，但Exo I处理后部分信号转变为87 nt（图1G）。这些结果表明，yku70Δ细胞中从头端粒的CA链发生5′切除，根据TG(107 nt)-CA(83 nt)计算的3′突出端约为24 nt（图1F和1G）。鉴于天然凝胶中大部分107-bp信号对Exo I消化具有抗性，研究推测103-nt CA链可能是通过细胞内核切酶的切割产生的（图1F）。
虽然先前研究表明Rif2和Rap1在短从头端粒保护中发挥主要作用，但本研究发现rif2Δ细胞G2/M期诱导的从头端粒是平末端的（图S1K和S1L），yku70Δ rif2Δ细胞中从头端粒末端的动态与yku70Δ细胞相似（图S1M和S1N），表明Rif2在长从头端粒保护中不起主要作用。
83-nt条带的积累表明CA链切除受到严格调控，可能由蛋白质屏障介导。由于Rap1结合序列（5′-CACCCAC-3′）位于距CA链末端28 nt处（图1A），研究假设Rap1结合阻止了yku70Δ细胞中的进一步切除。
酵母Exo1是一种5′-3′核酸外切酶，负责yku70Δ细胞端粒处单链DNA（ssDNA）的产生。为确定其在从头端粒切除中的作用，研究分析了exo1Δ和yku70Δ exo1Δ突变体中从头端粒的末端结构。在这两种菌株中，从头端粒均表现出对Exo I消化具有抗性的平末端结构（图S1O、S1P、1H和1I）。变性Southern blot证实没有切除发生，CA和TG链均保持初始107-nt长度（图S1Q和S1R）。因此，Yku在野生型（WT）细胞中保护从头端粒末端，而在其缺失时，末端变得易受Exo1介导的切除（图1J）。
【数据】yku70Δ细胞CA链切除产物：103 nt和83 nt；3′突出端长度：约24 nt；Rap1结合位点距CA链末端：28 nt；Exo1介导切除；rif2Δ：平末端；yku70Δ rif2Δ：与yku70Δ相似
前导链端粒在复制后维持稳定平末端
为监测从头端粒产生的子代端粒（假定类似于天然端粒）在一轮复制后的末端加工，细胞在从头端粒诱导后阻滞于早期S期，然后释放进入细胞周期（图2A）。通过FACS分析确认了正确的细胞周期进程（图2B）。
复制前，端粒末端是平端的（图2C，0 min）。复制后（图2C，120 min），E-TRF迁移略微变慢（灰色箭头）；Exo I消化后，观察到107和97 bp两条条带（图2C，分别由蓝色和粉色箭头指示），分别对应平末端和带突出端的端粒。该结果可重复（图S2A–S2D），两种结构的百分比相似，分别占总信号的43.4%和47.1%（图2D）。
进一步的变性Southern blot显示每条链的精确长度：复制后，CA链在原始107 nt条带旁产生99、97和95 nt的离散条带，可能对应RNA引物去除后的产物（图S2E，120 min）。TG链在基因组复制前为107 nt，复制后信号增加；Exo I消化使信号减少约一半，转变为101、99、97和87 nt的条带（图S2F，120 min）。这些结果表明，子代端粒2上的3′突出端根据TG(107 nt)-CA(99/97/95 nt)计算为8/10/12 nt（下文简称约10 nt；图S2E和S2F）。端粒测序结果也证实了平末端的子代端粒（图S2G和S2H）。
通过对α因子阻滞细胞进行细胞周期分析，也发现两条子代端粒具有不同的末端结构。一条端粒是平末端且对Exo I具有抗性，而另一条含有约10 nt的突出端，Exo I消化后产生97 bp条带（图2F–2H）。这些结果与两条子代端粒均具有3′突出端的模型相矛盾，但符合一条子代端粒为平末端、另一条携带约10 nt 3′突出端的模型。
【数据】平末端比例：43.4%；带突出端比例：47.1%；CA链产物：99/97/95 nt；TG链产物：101/99/97/87 nt；3′突出端长度：8/10/12 nt；Exo I消化后条带：107 bp和97 bp
两条子代端粒均受Yku70保护
（此部分原文节选未完整呈现，以下根据可获得的原文内容翻译）
【数据】菌株：yku70Δ、exo1Δ、yku70Δ exo1Δ；检测方法：FACS、Southern blot
rnh201Δ细胞中RNA引物保留在滞后链端粒上
（此部分原文节选未完整呈现，以下根据可获得的原文内容翻译）
【数据】RNA引物检测方法：RNase H消化；寡核苷酸对照：10-bp DNA-RNA杂交/10-nt 3′突出端
RNA引物保留减缓端粒缩短，不依赖TERRA表达和同源重组
（此部分原文节选未完整呈现，以下根据可获得的原文内容翻译）
【数据】PDs：约25次；菌株：tlc1Δ、rnh201Δ tlc1Δ、rnh1Δ tlc1Δ、rnh1Δ rnh201Δ tlc1Δ
RNA引物保留延迟衰老
（此部分原文节选未完整呈现，以下根据可获得的原文内容翻译）
【数据】衰老分析天数：14天（SY142tCYC1为16天）；OD600稀释至：0.01
讨论与解读
酵母端粒的经典形象是带有保护性3′突出端的末端，这被认为是末端RNA引物去除和/或5′切除的结果。本研究发现的复制后前导链端粒平末端（图2）以及天然端粒上平末端的普遍存在（图3），挑战了被广泛接受的"填充合成模型"。
平末端端粒长期未被发现可能有以下原因：（1）端粒酶介导的端粒延伸需要3′突出端，强化了端粒应具备利于端粒酶作用结构的预期。（2）不同长度的端粒可能经历不同类型的末端加工——短端粒容易被端粒酶或HR活性延伸，最终在RNA引物去除后留下3′突出端，先前使用的检测方法可能混合了端粒酶或HR延伸的端粒与常规半保留复制端粒的信号。（3）广泛使用的引物连接延伸和单端粒长度分析（STELA）基于3′突出端的假设，埋在模糊条带中的平末端端粒被忽视。（4）由于端粒长度的异质性……
编译者解读
本研究巧妙运用合成生物学方法——CRISPR-Cas9诱导的从头端粒系统——将端粒末端加工这一复杂问题转化为可精确追踪的单一分子事件。平末端的发现不仅修正了教科书模型，更提示RNase H2与端粒酶在端粒维持中的功能冗余可能成为抗癌靶点。值得关注的是，RNA引物滞留延缓衰老这一反直觉发现，为端粒缩短机制提供了新的干预思路。然而，从头端粒与天然端粒在染色质环境上的差异仍需更多验证，Yku在人类端粒中的同源保护机制也有待探索。
参考来源
Ye T. Asymmetrical end structures of leading and lagging telomeres in Saccharomyces cerevisiae dictate the nature of the end replication problem. Cell Reports, 2025. DOI: 10.1016/j.celrep.2025.116622
DOI: 10.1016/j.celrep.2025.116622