来源：A fluorescence-based high-throughput assay enabling engineering of BsPPS, a unique phenolic compound–phosphorylating enzyme from Bacillus subtilis（Food Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
天然多酚类化合物水溶性差、口服生物利用度低，磷酸化修饰是改善其理化性质的有效策略。然而，催化酚类化合物磷酸化的酶系统极为罕见，且缺乏高效的高通量筛选平台限制了这类酶的改造与应用。本研究以伞形酮（umbelliferone）为荧光底物，开发了一种基于荧光淬灭的BsPPS活性高通量筛选方法。磷酸化引起伞形酮荧光显著淬灭，荧光强度与酶活性呈反比关系。该方法经系统优化与验证后，成功从易错PCR突变文库中筛选出热稳定性提高的BsPPS变体。
研究背景
天然多酚类化合物（包括黄酮类）展现出显著的治疗潜力和多样的生物活性，但其极低的水溶性和较差的口服生物利用度严重限制了临床及营养保健应用。磷酸化修饰作为一种磷酸酯前药策略，能有效增强难溶性化合物的亲水性、溶出特性和肠道吸收。已有研究表明，多种多酚（如染料木素、橙皮素、木犀草素、芹菜素）的磷酸化衍生物较母体化合物溶解度与生物利用度显著改善，并可转化为增强的体内生物学功效。
然而，能够催化酚类化合物磷酸化的酶系统仍然稀少。来源于枯草芽孢杆菌的酚类磷酸盐合成酶BsPPS具有区域选择性磷酸化多种结构多样的天然多酚的能力，这一转化对改善植物化学物质的水溶性和生物利用度具有重要价值。但目前缺乏高效的高通量筛选平台，严重制约了BsPPS的定向进化和实际应用。
研究方法
2.1 化学试剂与生物材料
染料木素（GEN）标准品购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司（中国上海）。伞形酮（UMB）标准品购自Combi-Blocks（美国圣地亚哥）。分析级盐酸、磷酸、甲酸和乙酸乙酯购自Fisher Chemical（美国休斯顿）。高效液相色谱（HPLC）级乙腈和甲醇购自Merck（德国达姆施塔特）。FastDigest KpnI和XhoI购自Thermo Fisher Scientific（美国沃尔瑟姆）。T4 DNA连接酶购自New England Biolabs（美国伊普斯威奇）。鸡卵清溶菌酶购自BioShop Canada Inc.（加拿大伯灵顿）。大肠杆菌感受态细胞购自Yeastern Biotech Co.（中国台北）。大肠杆菌DH5α用作分子克隆宿主菌株，BL21(DE3)菌株用于蛋白过表达。pET47b(+)（Novagen，美国麦迪逊）用作表达载体。研究中使用的所有其他化学品均为分析纯。BsPPS的DNA和蛋白质序列分别见表S1和表S2。
【数据】GEN标准品来源：上海阿拉丁；UMB标准品来源：Combi-Blocks；宿主菌：E. coli DH5α（克隆）、BL21(DE3)（表达）；表达载体：pET47b(+)
2.2 BsPPS的过表达与纯化
重组BsPPS在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，参照先前报道的方案并进行少量修改。简言之，含有表达质粒的细胞在含卡那霉素（50 μg/mL）的LB培养基中于37°C培养至OD600达到0.6–0.8，随后用0.2 mM IPTG诱导，并于16°C孵育24小时。通过离心收集细胞，重悬于含有1 mM PMSF的酶缓冲液[50 mM Tris–HCl（pH 7.5），100 mM NaCl]中。超声破碎和离心后，将可溶性组分上样至两根串联的5-mL HisTrap HP柱（GE Healthcare）。用10倍柱体积（CV）含40 mM咪唑的结合缓冲液洗涤柱子，随后用5 CV含200 mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱BsPPS。为进一步提高蛋白质均一性，将洗脱组分通过连接到ÄKTA purifier系统（GE Healthcare）的HiLoad 16/600 Superdex 200柱（GE Healthcare）进行尺寸排阻色谱。柱子用酶缓冲液以1.0 mL/min的流速平衡和运行。收集含有纯化BsPPS的组分，合并、浓缩、液氮速冻，并于−80°C保存备用。
【数据】表达菌株：E. coli BL21(DE3)；卡那霉素浓度：50 μg/mL；诱导温度：37°C→16°C；IPTG浓度：0.2 mM；诱导时间：24h；缓冲液：50 mM Tris–HCl (pH 7.5)、100 mM NaCl；咪唑浓度：40 mM（洗涤）/200 mM（洗脱）；流速：1.0 mL/min；保存温度：−80°C
2.3 UMB的酶促磷酸化及HPLC分析
BsPPS对伞形酮（UMB）的磷酸化反应在总体积100 μL中进行，反应体系含纯化BsPPS（终浓度100 μg/mL）和反应混合物[50 mM Tris–HCl缓冲液（pH 7.5），500 μM UMB，10 mM ATP，10 mM MgCl2和2%（v/v）DMSO]。反应在40°C孵育60分钟，随后加入等体积甲醇终止反应。反应混合物用50%（v/v）甲醇/超纯水稀释，然后以15,000 rpm离心5分钟。收集上清液用于HPLC分析。
HPLC分析使用YMC-Pack ODS-AM色谱柱（4.6 × 250 mm，5 μm）。流动相由溶剂A（含0.1%（v/v）磷酸的超纯水）和溶剂B（乙腈）组成，流速1.0 mL/min。进样量20 μL，检测波长330 nm。梯度程序如下：溶剂B在15分钟内从15%升至40%，然后在5分钟内回到15%，随后平衡5分钟，总运行时间25分钟。
【数据】反应体积：100 μL；BsPPS终浓度：100 μg/mL；UMB浓度：500 μM；ATP浓度：10 mM；MgCl2浓度：10 mM；DMSO：2%（v/v）；反应温度：40°C；反应时间：60min；离心：15,000 rpm×5min；HPLC色谱柱：YMC-Pack ODS-AM (4.6×250mm, 5μm)；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；检测波长：330nm
2.4 伞形酮7-O-磷酸的分离与结构鉴定
UMB的磷酸化产物从反应上清液中分离纯化，参照先前报道的方案并进行少量修改。简言之，收集的上清液用12 N HCl酸化至pH 1.0，用乙酸乙酯（1:2，v/v）萃取两次。合并有机层，用无水硫酸钠干燥、过滤并减压浓缩。所得残渣溶于50%（v/v）甲醇中，离心（15,000 rpm，5分钟），然后进行半制备HPLC纯化。收集目标峰对应组分，合并并减压浓缩。纯化产物重新溶解并冻干，获得U7P干粉。根据峰面积百分比，产物纯度经HPLC测定大于97%。
半制备HPLC使用Hypersil ODS C18色谱柱（250 × 10 mm，10 μm）。流动相由溶剂A（含0.2%（v/v）甲酸的超纯水）和溶剂B（含0.2%（v/v）甲酸的甲醇）组成，流速4.0 mL/min，检测波长330 nm。梯度程序如下：溶剂B在10分钟内从25%升至50%，然后在3分钟内回到25%，随后平衡2分钟，总运行时间15分钟。
结构表征方面，纯化产物通过核磁共振（NMR）波谱和液相色谱–电喷雾电离串联质谱（LC–ESI–MS/MS）分析。NMR谱图在Bruker Avance-500光谱仪上记录，以DMSO‑d6为溶剂。1H和13C的化学位移（δ）分别参照DMSO‑d6在δ = 2.50和39.9 ppm处。磷酸三苯酯（TPP）溶于丙酮‑d6中用作外标，31P共振的化学位移校准使用−17.5 ppm。使用TopSpin 4.5进行NMR谱分析。
LC–ESI–MS/MS分析使用配备电喷雾电离（ESI）源的Agilent 6460三重四极杆质谱仪（Agilent Technologies），正离子模式运行。仪器参数如下：气体温度300°C，气体流速10 L/min，雾化器压力45 psi，鞘气温度325°C，鞘气流速10 L/min，毛细管电压4.0 kV。
【数据】酸化pH：1.0（12 N HCl）；萃取：乙酸乙酯（1:2，v/v）×2次；产物纯度：>97%（HPLC峰面积）；半制备色谱柱：Hypersil ODS C18 (250×10mm, 10μm)；流速：4.0 mL/min；检测波长：330nm；NMR谱仪：Bruker Avance-500（DMSO‑d6）；31P外标：TPP（−17.5 ppm）；质谱仪：Agilent 6460 Triple Quadrupole；ESI正离子模式；气体温度：300°C；鞘气温度：325°C；毛细管电压：4.0 kV
2.5 荧光测量及UMB对BsPPS活性的影响评估
使用UMB和U7P进行荧光测量。样品在50%（v/v）甲醇/50 mM Tris–HCl缓冲液（pH 7.5）中制备至终浓度5 μM。取100 μL等分试样转移至黑色96孔微孔板中，用透明粘合膜（Microseal® B）密封以防止甲醇蒸发。使用SpectraMax i3x微孔板读数仪测量荧光强度，激发和发射波长分别设为360和460 nm。
UMB对BsPPS活性的潜在影响通过在50 mM Tris–HCl缓冲液（pH 7.5）中、40°C下，将纯化BsPPS（100 μg/mL）与或不与UMB（250 μM）孵育2小时来评估。孵育后，将50 μL样品与50 μL反应混合物[50 mM Tris–HCl缓冲液（pH 7.5），10 mM ATP和10 mM MgCl2]混合启动酶促反应，反应10分钟。加入等体积甲醇终止反应，然后用50%（v/v）甲醇稀释并离心（15,000 rpm，5分钟）。取上清液进行HPLC分析以测定酶活性。未经热处理的4°C保存酶用作对照，定义为100%活性。
【数据】荧光测量浓度：5 μM；激发波长：360nm；发射波长：460nm；孵育温度：40°C；孵育时间：2h；UMB浓度：250 μM；反应时间：10min；对照：4°C保存未热处理酶（100%活性）
2.6 荧光测量条件优化与标准曲线建立
通过评估pH、溶剂组成和激发/发射波长的影响来优化UMB的荧光测量条件。pH优化方面，UMB溶液（5 μM）分别配制于50 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 3–6）、50 mM磷酸钠缓冲液（pH 6–7.5）和50 mM Tris–HCl缓冲液（pH 7–9）中。溶剂优化方面，UMB（5 μM）配制于含0%、25%、50%、75%或100%（v/v）甲醇的50 mM Tris–HCl缓冲液（pH 7.5）中。取100 μL等分试样转移至黑色微孔板中，进行荧光测量。
（原文此段后续内容未在节选中完整呈现，涉及标准曲线建立等具体操作细节，原文未详述。）
【数据】UMB浓度：5 μM；pH范围：3–9（柠檬酸钠pH 3–6、磷酸钠pH 6–7.5、Tris–HCl pH 7–9）；甲醇比例：0%、25%、50%、75%、100%（v/v）
研究结果
3.1 UMB作为BsPPS荧光底物的鉴定及其磷酸化产物的结构表征
为建立高效省时的BsPPS定向进化高通量筛选平台，选择合适底物是关键决定因素。先前研究表明，BsPPS能够磷酸化多种多酚底物，其中大多数在紫外–可见光谱范围内有吸收。然而，单磷酸基团的引入仅引起这些化合物吸收波长的极小位移。这种有限的光谱变化显著阻碍了可靠比色终点测定的开发，从而对构建有效筛选系统构成重大挑战。
为解决这一局限，研究团队寻求通过鉴定合适的荧光底物来开发基于荧光的筛选策略。伞形酮（UMB），又称7-羟基香豆素，是一种天然香豆素衍生物，因其在水性环境中去质子化后产生显著荧光而被广泛用作荧光探针——这是由扩展共轭体系的形成所致（图1A和B）。研究团队因此假设，UMB的单磷酸化将抑制去质子化，从而削弱共轭并降低荧光发射，实现荧光强度与酶活性之间的反比关系。
为评估BsPPS能否单磷酸化UMB，将纯化酶与UMB孵育1小时，反应混合物通过HPLC–DAD分析监测新产物形成。随着反应进行，在4.2分钟保留时间处出现新峰，命名为U1。1小时后，U1峰面积大幅增加，同时UMB峰（12.8分钟）完全消失（图1C–F）。U1较早洗脱表明其极性高于底物，与磷酸基团的引入一致。U1的紫外–可见吸收谱也与UMB高度相似，表明酶促修饰后香豆素核心结构保持完整（图S1）。这些结果初步表明U1是UMB的磷酸化衍生物。
为确认U1的化学身份，从反应混合物中分离产物并纯化至均一，通过LC–ESI–MS/MS和NMR波谱进行结构表征。在正离子模式LC–ESI–MS分析中，U1在m/z 242.9处显示分子离子峰，对应[M + H]+离子，与单磷酸化UMB的理论分子量一致。为进一步结构确认，选择m/z 243离子并在30.0 V碰撞能量下进行碎裂。MS/MS谱在m/z 162.9处显示显著碎片峰，对应去磷酸化的UMB离子。这些MS1和MS/MS数据共同确认U1是UMB的磷酸化产物（图S2）。
为确定磷酸化位点，将纯化U1溶于DMSO‑d6中，在500 MHz下进行1H–31P HMQC NMR分析。在31P信号与芳香质子H-5、H-6和H-8之间观察到清晰的交叉峰（图1G和H）。该耦合模式与7-羟基位点的磷酸化完全一致，从而确认了该修饰的区域选择性。综合LC–MS/MS和NMR分析，U1被明确鉴定为伞形酮7-O-磷酸（U7P）（图S3和表S4）。
【数据】U1保留时间：4.2min；UMB保留时间：12.8min；U1分子离子峰：m/z 242.9 [M+H]+；MS/MS碎片峰：m/z 162.9（去磷酸化UMB）；碰撞能量：30.0V；磷酸化位点：7-羟基（1H–31P HMQC确认）
3.2 UMB磷酸化后的荧光淬灭
在确认U1为伞形酮7-O-磷酸后，研究团队进一步评估磷酸化是否导致荧光强度降低。在相同条件下测量等浓度的UMB和U7P标准品。如图2所示，U7P的荧光强度急剧降低至仅UMB的1.82%。这一显著降低在透明96孔板中也清晰可见，表明两种化合物之间存在明显的视觉差异。荧光的显著降低可归因于7-羟基的磷酸化——磷酸化阻止了伞形酮阴离子的形成，从而破坏了荧光发射所需的扩展共轭体系的形成。
这些结果证实，UMB的磷酸化有效淬灭其荧光，从而建立了荧光强度与BsPPS催化活性之间稳健的反比关系，验证了基于荧光的BsPPS变体高通量筛选方法的可行性。
【数据】U7P荧光强度：UMB的1.82%
3.3 UMB对BsPPS活性的潜在抑制效应评估
由于芳香族分子常通过聚集或混杂相互作用与酶发生非特异性抑制（Coan et al., 2009），研究团队专门评估了UMB是否引入可能使筛选结果产生偏差的此类假象。将纯化BsPPS与UMB在40°C下孵育2小时，随后测定酶活性。设置仅含酶的对照组进行比较。未孵育酶样品的活性定义为100%，用于归一化各组的相对活性。
在测试条件下，2小时孵育后的相对活性分别为90.4%和89.6%，表明UMB对BsPPS无显著抑制效应（图2C）。值得注意的是，研究未评估更长的孵育时间——因此，长时间暴露下的潜在抑制效应不能完全排除。但考虑到高通量筛选测定的典型时间尺度，这些结果充分证明UMB不干扰酶活性，不影响筛选平台的可靠性。
综上，UMB是适合高通量筛选平台的底物，磷酸化依赖性荧光强度降低可可靠地用作BsPPS催化活性的反向读数。
【数据】2h孵育后相对活性：90.4%（含UMB）、89.6%（对照）；孵育温度：40°C；UMB浓度：250 μM
3.4 基于荧光的UMB定量方法的开发
在验证UMB为合适荧光底物后，研究团队优化了测量条件以确保可靠且可重复的荧光读数。由于UMB的荧光源于其7-羟基的去质子化形式，pH和溶剂组成都可能显著影响其电离行为和荧光强度（Fink & Koehler, 1970）。为建立稳健一致的测定系统，研究团队系统评估了pH和溶剂组成对UMB荧光强度的影响，旨在找到平衡荧光灵敏度、实验一致性和酶促反应兼容性的条件。
如图3A所示，pH 3–5时荧光可忽略不计。荧光强度随pH从6升至7.5而急剧增加，并在pH 8–9范围内达到平台期。在酸性条件下，UMB主要以质子化形式存在，导致荧光发射极低。当pH接近7-羟基的pKa时，去质子化物种比例增加，荧光强度显著增强。在碱性pH下，UMB主要以去质子化形式存在——因此，pH进一步升高仅引起荧光微小变化。
溶剂效应方面，甲醇比例增加导致荧光强度显著降低（图3B）。这一趋势可归因于高甲醇含量下溶剂极性和溶剂化能力降低，降低了介电常数，有效提高了UMB的表观pKa，从而抑制去质子化并减少荧光发射。（原文此段后续内容涉及标准曲线建立、线性范围验证等具体数据，未在节选中完整呈现。）
【数据】pH范围：3–9；最佳pH：8–9（平台期）；甲醇比例效应：甲醇增加→荧光降低；UMB浓度：5 μM
3.5 高通量筛选工作流程的建立
（原文此部分内容未在节选中完整呈现，涉及高通量筛选流程示意图及具体操作步骤。）
【数据】原文未详述
3.6 背景干扰评估与粗酶制备优化
（原文此部分内容未在节选中完整呈现，涉及大肠杆菌裂解液内源干扰评估及粗酶制备条件优化。）
【数据】原文未详述
3.7 高通量筛选平台的应用及热稳定性BsPPS变体的表征
（原文此部分内容未在节选中完整呈现，涉及易错PCR突变文库筛选及G145D变体的热稳定性表征。）
【数据】突变文库规模：约3360个变体（易错PCR）；变体：G145D
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究建立了以伞形酮为替代底物的BsPPS荧光高通量筛选平台。传统的基于吸光度的筛选方法对此酶极为困难，因为大多数多酚底物单磷酸化后光谱变化极小。相比之下，UMB 7-羟基的磷酸化阻止了荧光伞形酮阴离子的形成，产生显著的荧光强度下降。荧光信号与酶活性之间清晰的反比关系为筛选提供了可靠且灵敏的读数。LC–MS/MS和NMR结构表征确认了伞形酮7-O-磷酸的形成，支持观察到的荧光变化源于预期酶促反应。
为确保测定 robustness，研究团队进行了系统优化与验证。通过精心选择测量条件（pH 7.5和50%甲醇），在荧光灵敏度与酶促反应工作流程兼容性之间取得平衡，最小化了环境变化引起的系统误差。在优化测量条件下，该测定方法展现出已验证的1–5 μM线性范围、实验验证的0.36 μM定量限、92.5–96.7%的回收率，以及≤5.9%的日内和日间变异系数。结合板内CV值6.9–8.5%和板间CV值3.9%，这些结果共同证实了该筛选平台的可靠性和可重复性。
【编译者解读】该研究巧妙利用伞形酮磷酸化前后荧光性质的巨大差异，将"不可测"转化为"易测"，解决了酚类磷酸化酶缺乏高通量筛选方法这一关键瓶颈。方法学上，pH和溶剂组成的系统优化体现了对荧光机理的深入理解；从约3360个变体中筛选出热稳定性提高的G145D变体，验证了平台的实际筛选能力。这一策略不仅适用于BsPPS，也为其他酚类磷酸化酶的工程改造提供了可推广的方法模板。不足之处在于，部分筛选流程细节和变体全面表征数据在正文中未完整呈现，限制了对其工业应用潜力的充分评估。
参考来源
期刊：Food Chemistry, 2026
DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.150937
DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.150937