利用CRISPR/Cas9系统在酿酒酵母中

📅 2026-09-01 📰 Analytical Biochemistry 2016-09-15 📂 研究进展 👁 15

来源：Large fragment deletion using a CRISPR/Cas9 system in Saccharomyces cerevisiae（Analytical Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

染色体大片段修饰在自然进化和实验室进化研究中均有广泛应用，在基础研究、医学和生物技术领域潜力巨大。本研究将CRISPR/Cas9系统应用于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）约38 kb染色体片段的删除，并与传统Latour系统进行了平行比较。结果显示，CRISPR/Cas9系统在50株转化子中获得5株阳性缺失菌株（10%效率），而Latour系统在202株中仅获得1株（0.4%效率）。CRISPR/Cas9系统展现出快速、高效、低成本且多能性的基因组编辑优势。

研究背景

染色体大片段修饰（如缺失和倒位）已用于自然进化和实验室进化研究，在基础研究、医学及生物技术应用中潜力巨大——例如提高菌株适应性、揭示毒性通路和易感基因、改善生物产品产量。目前已发展出多种基因组大片段删除策略，各有特点。FLP/FRT系统和Cre/LoxP系统类似重组系统，广泛用于基因功能研究和基因缺失突变体构建，但修饰后基因组中残留外源序列，多次染色体操作后大量外源序列残留可能导致染色体不稳定。PCR介导法结合两步PCR和Cre/loxP标记回收，可将染色体切割为小染色体，但小染色体在分裂生长中具有不确定性。Latour系统是一种无标记删除方法，但效率受限。本研究旨在应用CRISPR/Cas9系统在酿酒酵母中实现大片段删除，并与Latour系统进行比较评估。

研究方法

2.1 菌株与培养基

本研究使用酿酒酵母菌株W303（MAT ura3-52）。YPDA培养基（2%蛋白胨、2%葡萄糖、1%酵母提取物、0.005%腺嘌呤）用于酵母菌株液体培养。通过定期添加新鲜培养基稀释，使培养物维持在对数期（OD600 < 0.6）。酵母细胞涂布于SC培养基（2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱，添加适当氨基酸和碱基）上筛选突变体。必要时，在SC培养基中添加0.05%（w/v）尿嘧啶和0.1%（w/v）5-FOA用于筛选缺失突变体。大肠杆菌DH5α菌株用于质粒繁殖。

【数据】菌株：酿酒酵母W303（MAT ura3-52）；培养基：YPDA（2%蛋白胨、2%葡萄糖、1%酵母提取物、0.005%腺嘌呤）；培养条件：对数期（OD600 < 0.6）；筛选培养基：SC（2%葡萄糖、0.67%酵母氮碱）；添加物：0.05%（w/v）尿嘧啶、0.1%（w/v）5-FOA；大肠杆菌：DH5α

2.2 诱变盒与质粒构建

基于酿酒酵母基因组数据库（SGD, http://www.yeastgenome.org/）和综合酵母基因组数据库（http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast/）分析靶标区域。Latour系统中的诱变盒包含四个组分：直接重复序列、ura3基因选择标记和两个同源序列。同源序列（HS ∼1000 bp）位于XV号染色体nt 142857–143927，直接重复序列（DR ∼400 bp）位于nt 181028–181412。ura3（∼1400 bp）从pRS406扩增。通过重叠延伸聚合酶链式反应生成DR和ura3的拼接片段（DRU）。将DRU和HS分别克隆到pMD19-T中，获得pTDRU和pTHS。将pTDRU经Xma III酶切得到的片段插入经Xma III酶切的pTHS中，构建pTHS:DRU-HS2载体。随后从pTHS:DRU-HS2扩增诱变盒并纯化。

对于Cas9/sgRNA表达载体的构建，使用pCRCT质粒[9]，该质粒含有密码子优化的iCas9和一个截短启动子，可增加质粒拷贝数和HR修复供体的可用性。使用在线工具E-CRISP（http://www.e-crisp.org/E-CRISP/）设计sgRNA内的两个20-nt引导序列。合成含有两个引导RNA和部分直接重复序列的114-bp crRNA组分，经Bsa I酶切后克隆到pCRCT质粒中。所用引物完整列表见表1。

【数据】同源序列HS：∼1000 bp（XV号染色体nt 142857–143927）；直接重复序列DR：∼400 bp（XV号染色体nt 181028–181412）；ura3：∼1400 bp（模板：pRS406）；诱变盒载体：pMD19-T；酶切位点：Xma III；Cas9/sgRNA载体：pCRCT质粒；gRNA长度：20-nt；crRNA组分：114-bp；限制酶：Bsa I

2.3 敲除突变体的构建

使用LiAc/SS载体DNA/PEG方法[15]将诱变盒和质粒转化入感受态酿酒酵母细胞。通过在无尿嘧啶的SC琼脂平板上培养重组体筛选插入事件。对于Latour系统，重组体在YPDA培养基中于30°C培养24小时，然后涂布于含5-FOA的MMA培养基上。当缺失区域为非必需区域时，直接重复序列之间的同源重组会产生缺失体。使用新产生的缩短序列验证缺失体，并进一步使用靶区域内3个基因（ypq1、adh1、ars1510）的特异性引物确认缺失。引物根据靶区域侧翼序列设计以扩增连接点序列——仅当发生大片段缺失时才能跨越连接点进行扩增。

【数据】转化方法：LiAc/SS载体DNA/PEG法；筛选条件：SC无尿嘧啶琼脂平板；Latour系统培养：YPDA培养基、30°C、24小时；筛选培养基：含5-FOA的MMA培养基；验证基因：ypq1、adh1、ars1510

研究结果

3.1 Latour系统的设计与性能评估

待删除的染色体区域包含20个已报道为非必需的ORF（表2），包括染色体复制起点ars1510。该基因簇跨度约38 kb。在本实验中使用Latour系统时，诱变盒通过双交叉整合到酵母染色体后，ura3和靶标片段位于直接重复序列之间（图1）。

▲ Schematic representation of the deletion of the target region and selectable marker. The combined white squares and squares within vertical lines show HS; black show the target region; gray show DR; and squares within horizontal lines shows ura3. DRU was cloned into the restriction enzyme cutting si

在5-FOA培养基中培养重组菌株后，产生了5-FOA抗性菌落。通过PCR验证是否为缺失体。结果显示，202株中仅获得1株缺失体（图2）。

▲ 重组体和缺失体的PCR确认。(A) 重组体的PCR结果。1a，重组体（约2800 bp）。2a，亲本菌株（约1000 bp）。(B) 缺失体的PCR结果。1b，缺失体（约1600 bp）。2b，亲本菌株。

切除事件的发生频率（0.4%）远低于此前在裂殖酵母中报道的水平[4]。其他5-FOA抗性克隆表现出两种意外缺失类型：第一种仅丢失ura3标记，第二种丢失ura3标记下游最近的一个或两个基因。对缺失菌株中新缩短序列的序列分析证实，靶序列上游和下游区域已无缝整合，未留下任何一对外源序列碱基。

【数据】靶区域：约38 kb、20个非必需ORF（含ars1510）；Latour系统缺失效率：1/202（0.4%）；意外缺失类型：2种（仅丢失ura3标记；丢失ura3下游1-2个基因）；连接方式：无缝整合，无外源序列残留

3.2 CRISPR/Cas9系统的设计与性能评估

Cas9和gRNA的表达水平是基因组编辑效率的关键因素，编辑效率呈剂量依赖性[16]。本研究中，Cas9/sgRNA载体PCRCT以ura3为选择标记，其表达由截短启动子驱动，因而Cas9和gRNA在细胞中可维持较高表达水平。基因编辑的关键步骤是在靶标基因组位点产生DSB。大片段删除需要在两个靶标基因组位点同时诱导两个DSB。本研究设计了两个特异性gRNA——gRNA1和gRNA2，分别基于基因簇两端的trm10和rex4基因序列，并分别在NCBI中进行BLAST比对，靶向同一约38 kb区域（图3）。

两个由DR间隔的短gRNA被合成并克隆到Cas9表达载体中，使一个质粒能够同时表达两个不同的短gRNA和Cas9。转化后，克隆在2 ml SC-Ura液体培养基中生长4天。我们假设gRNA1和gRNA2的NHEJ介导缺失可围绕靶位点位置发生。通过新缩短序列验证了两个远端靶位点之间发生大片段染色体缺失的突变体。结果符合预期：在50株菌株中获得5株成功删除约38 kb基因组区域的缺失体（图4A），缺失效率为10%。

▲ 大染色体修饰的确认。(A) 1，缺失株（约1000 bp）。2，亲本菌株。(B、C、D) 分别为目标区域中ypq1、adh1、ars1510的产物。1a、1b、1c，亲本菌株。2a、2b、2c，缺失株。

此外，在缺失体中未观察到靶区域内3个基因（ypq1、adh1、ars1510）的PCR产物（图4B–D）。对缺失菌株的序列分析证实靶区域已被删除。经过数代培养后，缺失体仍保持稳定。因此，CRISPR/Cas9系统被证明是一种高效的基因组编辑方法。

然而，本研究中的大片段缺失效率仅为10%。我们随机选取了10株未发生大片段缺失的菌株进行部分测序。结果显示，所有被测序菌株均含有Cas9/sgRNA表达质粒，并在两个靶位点表现出基因组编辑事件。10株菌株均在trm10切割位点含有1–3 bp缺失。其中9株在rex4靶位点含有1–3 bp缺失，1株含有单碱基替换（图5）。

▲ 突变体序列分析。（A）gRNA1在trm10切割位点的序列。（B）gRNA2在rex4靶位点的序列。

【数据】CRISPR/Cas9系统缺失效率：5/50（10%）；靶区域：约38 kb；gRNA靶基因：trm10和rex4；培养条件：2 ml SC-Ura液体培养基、4天；trm10切割位点：10/10株含1–3 bp缺失；rex4靶位点：9/10株含1–3 bp缺失、1/10株含单碱基替换

讨论与解读

本研究成功将CRISPR/Cas9介导的系统应用于酿酒酵母的大片段删除。近年来，CRISPR/Cas9系统已被证实在多种生物和细胞类型中可有效删除大染色体片段，包括大肠杆菌[17]、水稻[18]、小鼠[19]和人类[20]。CRISPR/Cas9系统在酵母中的应用也已有报道——芽殖酵母是最早展示CRISPR/Cas9系统用于基因编辑的生物之一[21]。然而，此前尚无将CRISPR/Cas9系统用于酿酒酵母大片段删除的相关报道，这类操作通常通过PCD方法[22]和Latour系统[4]完成。

本研究尝试将传统Latour系统和CRISPR/Cas9系统分别用于删除酿酒酵母中同一大染色体区域。Latour系统完全依赖基本的同源重组进行染色体片段删除。然而，基于HR的大片段染色体删除耗时且需要与每个基因组靶位点对应的长同源臂，难以降低劳动强度和提高通量。ura3/5-FOA反选择也存在缺陷，因为大量5-FOA抗性克隆来源于酵母基因组自发缺失[23]。在操作过程中，Latour系统的同源重组缺失体出现频率较低。

编译者解读

本研究最直接的贡献在于用同一套标准平行比较了两种大片段删除策略——CRISPR/Cas9系统以10%对0.4%的效率优势明显胜出，且操作流程更简洁。从合成生物学应用角度看，CRISPR/Cas9系统无需构建长同源臂，仅需设计两个gRNA即可完成大片段切除，大幅降低了实验门槛和成本。值得注意的是，CRISPR/Cas9组中10株未发生大片段缺失的菌株均检测到靶位点编辑事件（1–3 bp indel或碱基替换），说明切割效率高但双位点同时切割后的NHEJ连接产物不一定产生预期的大片段缺失——这提示后续优化方向可聚焦于提高双DSB同时发生的概率或引入同源修复供体。该方法为酵母基因组的精简化和代谢通路重构提供了高效工具。

参考来源

Hao H. Large fragment deletion using a CRISPR/Cas9 system in Saccharomyces cerevisiae. Analytical Biochemistry, 2016. DOI: 10.1016/j.ab.2016.07.008

DOI: 10.1016/j.ab.2016.07.008

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