来源：Environ Microbiol Rep | 编译：DNA Lab Space
**导语**
微生物合成中链脂肪酸（MCFA）因在生物燃料、饲料添加剂及医药中间体领域的广阔前景而备受关注。酿酒巨球型菌（*Megasphaera cerevisiae*）作为一种天然产己酸和辛酸的厌氧细菌，近年来被视作底盘细胞开发的重要候选者。Sabra 等近期发表于 *Environmental Microbiology Reports* 的研究，首次利用代谢通量分析与多维生长谱技术，系统揭示了该菌株碳流量分配规律与生产性能限制因子，为理性改造高产中链脂肪酸的细胞工厂提供了关键的代谢蓝图和工程靶点。
**研究背景**
中链脂肪酸及其衍生物具有高能量密度和多功能化学活性，传统来源依赖棕榈仁油或石油基合成，可持续供应瓶颈突出。近年来，利用合成生物学手段将葡萄糖、乙醇或合成气转化为己酸、辛酸等 MCFA 已成为国际竞争热点。专性厌氧的梭菌纲微生物——尤其是克氏梭菌（*Clostridium kluyveri*）和埃氏巨型球菌（*Megasphaera elsdenii*）——在此领域占据重要地位，它们通过逆β–氧化途径实现碳链延长。相比之下，酿酒巨球型菌具有更高的耐酸性、宽泛的底物谱及天然MCFA出口系统，吸引力日增。然而，其代谢网络内部碳流分布、关键节点的通量控制系数以及生长对产物合成的联动机制尚不清晰，导致代谢工程改造长期缺乏定量依据。Sabra 等的这项研究正是瞄准这一知识空缺，旨在建立一套从全局代谢通量到生理表型的高分辨率定量框架。
**研究方法**
研究者构建了酿酒巨球型菌 DSM 20590 的代谢网络模型，结合培养示踪实验与约束性通量分析，对碳核心代谢进行了系统解析。
（1）**菌株与培养条件设置**：研究以 DSM 20590 为出发菌株，在严格厌氧工作站中分别以葡萄糖、乙醇/乙酸混合底物或合成气模拟气为碳源，维持 pH 5.8–6.2，温度 37°C，并实时监测氧化还原电位。
（2）**生长谱多参数获取**：为刻画代谢–生长耦合关系，作者采用在线尾气分析与自动取样系统，记录细胞密度、底物消耗、产物（己酸、辛酸、丁酸、乙醇、氢气等）生成及关键辅因子平衡。特别地，设置了 16 个不同稀释率的恒化培养（D = 0.05–0.4 h⁻¹），以获得稳态代谢通量分布，由此构建“生长速率–产物得率”相图。
（3）**¹³C 代谢通量分析**：在恒化稳态下，切换流加[1-¹³C] 葡萄糖或[U-¹³C] 乙酸，待同位素稳态后取样，通过气相色谱–质谱联用（GC–MS）检测蛋白源氨基酸和中央代谢物的同位素标记模式。所得标记数据输入开源软件 INCA，迭代拟合全局代谢通量图谱。模型包含糖酵解、磷酸戊糖途径、丙酮酸代谢、逆β–氧化循环、三羧酸循环（部分还原）及脂肪酸合成模块，总计 67 个反应和 56 种代谢物。
（4）**转录组学验证**：为进一步确认通量跃变背后的调控层级，研究人员选取高低产酸条件下样本进行 RNA–seq 分析，重点考察逆β–氧化关键酶（如硫解酶、3–羟基丁酰辅酶 A 脱氢酶、酰基辅酶 A 还原酶）及铁氧还蛋白相关脱氢酶的转录丰度，并与通量计算结果进行皮尔逊相关性分析。
（5）**代谢控制分析**：基于得出的稳态通量分布，团队进一步计算了各反应对己酸合成通量的控制系数（MCC），明确限制节点。
**研究结果**
葡萄糖为碳源时，酿酒巨球型菌在低稀释率（D = 0.1 h⁻¹）下表现出最高的己酸选择性，其每摩尔葡萄糖产己酸可达 0.32 mol/mol，辛酸约 0.09 mol/mol，而丁酸和乙醇均低于 0.10 mol/mol。随着稀释率升高至 0.35 h⁻¹，碳流急剧转向生物质和乙醇形成，己酸得率下降约 45%，表现为典型的“生长–产物解耦”现象。乙醇/乙酸混合底物条件下，己酸得率最高提升至理论最大值的 76%，说明乙酰辅酶 A 浓度直接推动逆β–氧化循环速率。
¹³C 通量图谱揭示，核心碳流在丙酮酸节点发生显著分流——约 52% 进入乙酰辅酶 A 池，其中逾 60% 被引导进入逆β–氧化途径而非 TCA 循环或乙醇脱氢酶分支；但至丁酰辅酶 A 与己酰辅酶 A 延长这一步骤，通量骤降约 35%，构成主要代谢瓶颈。进一步代谢控制分析证实，催化该步骤的酰基辅酶 A 脱氢酶（Mce–ACD）的控制系数高达 0.58，成为最高优先级改造靶点。磷酸戊糖途径通量相对稳定（占葡萄糖代谢的 18%–22%），主要提供 NADPH。有趣的是，电子收支平衡显示，当氢气产量被抑制时，NADH 的再氧化转向由 Rnf 复合体驱动，显著提升了铁氧还蛋白的还原态水平，进而拉动丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶的活性，使得乙酰辅酶 A 产量增加 19%。
转录组数据与通量计算结果高度一致（r = 0.83），在低稀释率高产酸条件下，逆β–氧化循环基因簇表达上调 3.2–5.7 倍，而乙醇脱氢酶基因被显著抑制。由此，作者提出一条以“弱化丁酰辅酶 A 出口、强化己酰辅酶 A 延长与末端释放”为核心的正向代谢改造路线。
该研究还意外发现，酿酒巨球型菌在乙醇/乙酸混养体系中表现出双相稳态：当乙酸浓度超过 120 mM 时，己酸合成被抑制，碳流重新分配至氢气与乙醇生成；这一耐受阈值对应细胞膜电位去极化达 30%，暗示膜转运系统或质子梯度平衡成为瓶颈。
**讨论与展望**
Sabra 等的工作首次为酿酒巨球型菌绘制了高分辨率代谢通量图谱，并以定量方式锁定逆β–氧化循环中的关键通量控制步骤，结束了以往仅凭经验改造的局面。与传统依赖梭菌的模式相比，该菌株的耐酸性及电子代谢灵活性为工业发酵提供了独特优势，尤其在利用纤维素水解液或合成气等非粮底物时更是如此。
基于本研究成果，未来可开展多层面工程：首先，针对 Mce–ACD 进行同源建模与饱和突变，或导入异源酰基辅酶 A 脱氢酶以解除己酰辅酶 A 延长瓶颈；其次，精准调控 Rnf–铁氧还蛋白氧化还原轴，通过增加还原当量供应拉动碳流通量；再次，重构膜脂成分或过表达多药外排泵以提升乙酸耐受性，从而在混合底物发酵中实现高浓度产物合成。此外，通量图谱可作为数字孪生模型的基础，指导动态代谢控制策略（如光遗传调节工具）的开发，实现在线碳流重定向。
从更广视角看，本研究建立的通量–生长谱联用分析框架，对其他厌氧羧化菌株的系统表征和工业转化具有方法论借鉴价值，有望加速下一代脂肪酸生物炼制的设计与实施。
**参考来源**
Sabra W, Villotti S, Fensterle J, Zeng AP, Haddad AM. Metabolic Flux and Growth Profiling of *Megasphaera cerevisiae* for Medium-Chain Fatty Acid Synthesis. *Environ Microbiol Rep*, 2026 Aug. DOI:10.1111/1758-2229.70390