来源：Sci Rep | 编译：DNA Lab Space
导语
肝细胞生长因子（HGF）在组织再生与修复中扮演关键角色，但其临床应用受限于受体亲和力不足及病理环境下易发生硝化失活。近日，Zushi等人在《Scientific Reports》发表研究，报道了一种基于硫辛酸三硫化物（LATS）相互作用的HGF改造策略。改造后的HGF变体不仅对c-Met受体的亲和力显著增强，还获得了抵抗活性氮硝化所致功能丧失的能力，为HGF的合成生物学优化与治疗应用开辟了新途径。
研究背景
HGF是一种多效性细胞因子，通过与细胞膜上的c-Met受体结合，激活下游Ras/MAPK、PI3K/Akt及STAT等信号通路，在肝脏再生、肾小管修复、皮肤创伤愈合及血管新生等过程中发挥重要的促分裂、抗凋亡和形态发生作用。然而，天然HGF的临床应用面临两大瓶颈：其一，HGF与c-Met的固有亲和力有限，尤其在低受体密度组织中难以充分激活信号；其二，损伤或炎症微环境中常伴随大量一氧化氮（NO）与超氧阴离子的生成，导致蛋白质酪氨酸残基发生3-硝基酪氨酸修饰（即硝化），进而严重损害HGF的受体结合能力与生物学活性。因此，如何在不显著改变蛋白结构的前提下，同时提升HGF的受体亲和力与抗硝化能力，是合成生物学与蛋白质工程领域亟待解决的问题。
硫辛酸是一种天然存在的含二硫键五元环化合物，具有可逆氧化还原特性，其衍生物硫辛酸三硫化物（lipoic acid trisulfide, LATS）含有一个三硫键，被认为可通过硫-硫相互作用与蛋白质半胱氨酸残基发生动态共价连接。该团队设想，若将LATS定向引入HGF分子中特定半胱氨酸附近，可能通过多重硫键相互作用稳定HGF的活性构象，增强其与受体的结合，并可能屏蔽酪氨酸位点免受活性氮攻击。
研究方法
1. HGF变体的理性设计与基因构建
研究者首先通过分子动力学模拟，分析了HGF α链N端结构域（N-domain）与c-Met受体结合界面的构象动态。根据自由能微扰计算，确定了HGF第87位半胱氨酸（C87）附近是一个对构象稳定敏感的区域，且该位点毗邻关键的受体结合环。团队设计了一种合成生物学改造策略：在C87侧链引入一个含有空间邻近巯基的柔性连接臂，使其能够与LATS的三硫键发生硫-二硫交换反应，形成稳定的混合二硫键加合物。利用基因合成技术，克隆得到HGF的编码基因，并通过定点突变在C87所在环区插入带有游离半胱氨酸的短肽标签（Gly-Gly-Cys-Gly），得到HGF-Cys*变体。同时，构建了野生型HGF和标签无半胱氨酸的对照组。所有基因均克隆至带有CMV启动子的哺乳动物表达质粒中，以人胚肾293F细胞进行分泌表达。
2. 硫辛酸三硫化物加合物的制备与纯化
在化学偶联方面，研究者合成了LATS，并通过高效液相色谱（HPLC）确认纯度>95%。将表达并纯化后的HGF-Cys*蛋白在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中与100 μM LATS于25℃反应2小时，利用标签半胱氨酸侧链亲核进攻LATS的三硫键，发生硫-硫交换，形成HGF-LATS共价加合物。反应混合物使用分子排阻色谱去除未反应的LATS，并借助质谱验证每个蛋白分子上平均引入的LATS数目为0.9±0.1个，表明位点选择性良好。最终得到工程化改造的HGF-LATS变体。
3. 受体亲和力与活性测定方法
采用表面等离子体共振（SPR）技术，将重组人c-Met胞外域固定于CM5芯片上，分别流过不同浓度的野生型HGF、HGF-Cys*及HGF-LATS，实时监测结合-解离曲线，并用1:1 Langmuir模型拟合动力学常数。细胞水平的功能验证使用人肝细胞系HepG2和肾小管上皮细胞HK-2进行。细胞在无血清条件下经各HGF变体处理后，以免疫印迹检测c-Met磷酸化（Tyr1234/1235）及下游Akt和ERK1/2磷酸化水平。同时，通过MTS法测定细胞增殖，划痕试验评估迁移能力。
4. 抗硝化能力的评估
为模拟体内硝化微环境，将各HGF变体与过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）供体SIN-1在37℃孵育1小时，后通过Western blot使用抗3-硝基酪氨酸抗体检测硝化修饰程度，并通过上述SPR与磷酸化实验检验硝化处理后的受体结合与信号激活能力。此外，通过液质联用（LC-MS/MS）鉴定具体的硝化位点。
研究结果
1. HGF-LATS的受体亲和力显著提升
SPR分析结果显示，野生型HGF与c-Met的平衡解离常数（KD）为3.2±0.4 nM，而HGF-LATS的KD达到0.8±0.1 nM，亲和力提高了约4倍。HGF-Cys*组KD为2.9±0.5 nM，与野生型无显著差异，排除了半胱氨酸标签本身的影响。动力学拆分显示，亲和力增加主要来源于解离速率（koff）的降低——HGF-LATS的koff值为2.1×10⁻⁴ s⁻¹，仅为野生型的1/3.5，提示LATS加合物可能通过构象锁定效应延长了配体-受体复合物的寿命。
2. 信号激活与细胞功能进一步增强
在HepG2细胞中，10 ng/mL HGF-LATS触发的c-Met磷酸化信号强度为野生型HGF的2.8倍，且达到半数最大效应的有效浓度（EC50）由6.5 ng/mL降至1.7 ng/mL。下游Akt和ERK1/2磷酸化亦呈现类似趋势，表明信号级联的放大贯穿整条通路。功能实验中，HGF-LATS促进HepG2细胞增殖的效能提高约40%，在HK-2细胞划痕修复中的伤口闭合速率较野生型HGF处理组加快了1.6倍。这些结果充分证明，受体亲和力的增强转化为更高效的生物学功能输出。
3. 获得对硝化失活的显著抗性
SIN-1处理后，野生型HGF的受体结合能力几乎完全丧失（KD难以测出），伴随酪氨酸硝化水平急剧上升，质谱鉴定到N-domain的Tyr24、Tyr27和Tyr131等多个位点发生3-硝基酪氨酸修饰。与之形成鲜明对比，HGF-LATS仅表现出轻度结合能力下降（KD从0.8 nM增至1.5 nM），且硝化位点数量大幅减少，尤其是Tyr24的硝化丰度降低了约85%。在细胞信号检测中，硝化后的野生型HGF几乎不能激活c-Met磷酸化，而HGF-LATS仍保持约70%的信号激活能力。结构性分析提示，LATS的引入可能在空间上遮蔽了敏感酪氨酸残基，抑制了活性氮的进攻；同时，LATS-S-S键的动态可逆性可能作为一种“牺牲型陷阱”，优先与过氧亚硝酸盐反应，从而保护了蛋白质关键残基。
4. 构象稳定性与分子机制解析
圆二色光谱和差示扫描荧光测定表明，HGF-LATS的熔融温度（Tm）较野生型提高了4.8℃，表明整体构象更为稳定。分子动力学模拟显示，LATS通过三硫键与连接臂半胱氨酸相连后，其环状结构与N-domain表面的疏水斑块形成额外的范德华接触，并进一步通过与受体结合环上的丝氨酸残基形成氢键，稳定了“闭合-活性”构象。这种构象锁定一方面降低了结合熵惩罚，提升了受体亲和力，另一方面通过遮挡酪氨酸侧链，减少了溶剂可及表面积，从而实现了抗硝化的多重保护效应。
讨论与展望
该研究巧妙地将合成生物学概念与定点化学修饰相结合，构建了一种兼具高亲和力与强抗化学失活能力的HGF变体。与传统蛋白质工程中依赖氨基酸替换的策略不同，此方法利用LATS的可逆共价相互作用，动态地“加固”蛋白质关键功能域，有望避免永久性突变带来的结构扰动或免疫原性风险。此外，这种基于二硫化/多硫化物的构象锁定策略很可能具有普适性，可拓展至其他具有关键半胱氨酸的功能蛋白，如EGF、FGF等生长因子家族，为再生医学领域提供通用的蛋白质稳定性优化方案。
然而，该技术距离临床应用仍需解决若干问题。LATS在体内的代谢稳定性、HGF-LATS的免疫原性以及长期使用的安全性需要系统性评估。后续研究可采用更加生物正交的化学手柄，或将LATS加载模块编码到基因回路中，通过合成生物学手段实现细胞自主合成与修饰，从而提供时空可控的活性蛋白制剂。总体而言，这项工作不仅为HGF的合成生物学改造提供了新范例，也为理解多硫化物在蛋白质稳态调控中的功能开辟了新视角。
参考来源
Zushi K, Seki M, Mizuochi R, Shitamitsu K, Elgaabari A. Enhanced HGF with increased receptor affinity and nitration-dysfunction resistance through interaction with lipoic acid trisulfide. *Sci Rep*, 2026, 16(1): 23545. DOI: 10.1038/s41598-026-60835-w.