来源：Enhancing environmental stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by deletion of NTH1 and FKS3: Implications for beer brewing（International Journal of Food Microbiology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
啤酒酿造中，酵母的自溶与干燥敏感性是制约高品质干酵母商业化应用的关键瓶颈。本研究以德国Kölsch啤酒酵母WLP029为对象，利用CRISPR/Cas9技术分别敲除中性海藻糖酶基因NTH1和1,3-β-葡聚糖合酶基因FKS3，构建三株基因缺失菌株。研究发现，NTH1缺失显著提高胞内海藻糖积累，冻干存活率从野生型的0.015%提升至0.287%；双基因缺失菌株在啤酒发酵后期及4°C冷藏中表现出最优的细胞活力和抗自溶能力。RNA-seq分析揭示抗氧化与应激响应蛋白表达上调，为啤酒酿造用酵母的环境耐受性改良提供了新路径。
研究背景
啤酒通过酵母发酵麦芽和啤酒花等原料制成，产生乙醇、二氧化碳、有机酸及复杂芳香化合物。针对酿造专用酵母菌株的研究包括筛选非酿酒酵母或非酿酒酵母与酿酒酵母共发酵，以及基因工程改造酿酒酵母代谢途径。为避免消费者对转基因生物的顾虑，许多研究采用CRISPR/Cas9技术进行精准酵母修饰而不引入外源DNA，使其成为食品发酵的安全方法。
家庭酿造者或啤酒厂偏好使用干酵母粉，因其体积小、无需冷藏、保质期长且储存成本低。相比之下，液体酵母对小啤酒厂而言成本更高。部分啤酒菌株仅以液体形式供应，因其不耐受干燥。干燥和复水过程会对酵母造成胁迫和细胞损伤。有研究提出改善干酵母发酵能力的方法，如控制生长温度等。
本研究选择NTH1基因（编码中性海藻糖酶）和FKS3基因（编码1,3-β-葡聚糖合酶）作为敲除靶点，预期NTH1缺失可增加酵母胞内海藻糖积累，间接保护细胞膜完整性并提高干燥环境耐受性；FKS3缺失可改变细胞壁结构，从而减缓酵母自溶。
研究方法
2.1 菌株与培养
野生型酿酒酵母WLP029（Kölsch艾尔酵母）购自美国加州WHITE LABS公司。WLP029Δnth1、WLP029Δfks3和WLP029Δnth1Δfks3为本研究通过CRISPR/Cas9技术在野生型WLP029中敲除目的基因获得的菌株。上述酿酒酵母均在YPD培养基（酵母膏胨葡萄糖培养基，含1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖）中培养。大肠杆菌Endura™作为质粒克隆宿主，购自美国威斯康星州Lucigen公司，在Luria-Bertani培养基中培养，添加卡那霉素（50 mg/L）或氨苄青霉素（100 mg/L）筛选成功转化的菌株。
【数据】培养基：YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）；LB培养基；卡那霉素：50 mg/L；氨苄青霉素：100 mg/L
2.2 质粒构建
表1列出了本研究使用的质粒。采用Shaw等（2019）和Ellis实验室网站（https://benchling.com/pub/ellis-crispr-tools）描述的双线性化质粒转化方法，利用CRISPR/Cas9技术敲除酵母中的NTH1和FKS3基因。pWS-082负责表达gRNA，pWS173负责表达Cas9蛋白，通过同源重组在酵母细胞内形成完整质粒。表2列出了本研究所用引物序列。用于敲除WLP029中NTH1和FKS3基因的gRNA序列通过CHOPCHOP网站（https://chopchop.cbu.uib.no）设计。在单链gRNA（nth1_sgRNA_F'和fks3_sgRNA_F'）的5′端添加GACTTT，反向链5′端添加CAAA，3′端添加AA（nth1_sgRNA_R'和fks3_sgRNA_R'）。各取5 μL单链寡核苷酸（10 μM/μL）混合并退火。退火过程需加热至98°C后缓慢冷却至25°C。为将gRNA片段插入pWS082，加入1 μL pWS082、2 μL gRNA片段、1 μL Esp3I限制酶（Thermo Fisher，美国马萨诸塞州）、0.4 μL T4连接酶（Thermo Fisher，美国马萨诸塞州）、2 μL T4连接酶缓冲液和3.6 μL水。反应在PCR仪（德国哥廷根）中进行（30个循环，37°C 5分钟，16°C 3分钟，最终80°C 10分钟灭活酶）。构建的质粒转化至大肠杆菌Endura™中，用氨苄青霉素筛选成功转化菌株。由于gRNA成功插入会破坏GFP（绿色荧光蛋白）基因表达，选取无法表达GFP的非荧光菌落进行扩增并用于酵母转化。购自Thermo Fisher（美国马萨诸塞州）的EcoRV和Esp3I分别用于线性化gRNA表达质粒pWS082和Cas9蛋白表达质粒pWS173。质粒经凝胶提取纯化后同时转化至酵母细胞。
【数据】退火温度：98°C→25°C；PCR循环：30个循环（37°C 5min，16°C 3min，80°C 10min）；限制酶：Esp3I、EcoRV；连接酶：T4连接酶
2.3 供体DNA的构建
为在NTH1和FKS3中创建序列缺失，使用SnapGene Viewer（美国加州）软件将待切除靶序列的上游60 bp和下游60 bp序列组合，合成单链120 bp引物作为模板（供体DNA）。已确认该引物会导致读码框移位，产生提前终止密码子。
【数据】供体DNA长度：120 bp；上游同源臂：60 bp；下游同源臂：60 bp
2.4 转化
酵母转化采用醋酸锂转化法（Gietz等，1992），使用G418（遗传霉素，购自Thermo Fisher，美国马萨诸塞州）筛选成功转化菌株。使用确认引物（表2：nth1_seq_F'、nth1_seq_R'、fks3_seq_F'、fks3_seq_R'）进行聚合酶链式反应（PCR）确认基因编辑结果。NTH1基因编辑成功的菌株，PCR产物大小应从881 bp减小至741 bp。FKS3基因编辑成功的菌株，PCR产物大小应从753 bp减小至350 bp。PCR产物经基因测序进一步确认。筛选出的基因缺失菌株在不含G418的YPD中液体培养。传代三次后，在含G418的YPDA上培养，以确保完全去除酵母细胞中所有引入的质粒。
【数据】G418筛选；PCR产物大小变化：NTH1 881→741 bp；FKS3 753→350 bp；传代次数：3次
2.5 基因组转录分析（RNA-seq）
酵母细胞悬浮于裂解缓冲液中，用玻璃珠破碎。RNA提取按照PureLink RNA Kit（Invitrogen，美国加州）说明书进行，使用TURBO DNA-free™试剂盒（Invitrogen，美国加州）去除DNA。RNA-seq外包给Genomics、BioSci & Tech Co.（台湾新北市）进行测序。使用Illumina HiSeq测序，测序结果使用Transdecoder v3.0.1进行基因序列分析。RNA表达水平使用Agilent 2100 Bioanalyzer和Real-Time PCR System分析。蛋白质功能注释使用Trinotate v3.0.2，不同酵母菌株间的基因表达差异使用edgeR v3.5分析。
【数据】测序平台：Illumina HiSeq；分析软件：Transdecoder v3.0.1、Trinotate v3.0.2、edgeR v3.5
2.6 基因缺失菌株的特性分析
#### 2.6.1 中性海藻糖酶（NTH1）酶活性
胞内海藻糖酶活性使用海藻糖酶检测试剂盒（ARG82017，Arigo Biolaboratories Corp.）测定，1个酶活性单位定义为每分钟产生1 μmol葡萄糖。
【数据】酶活单位：1 U = 1 μmol葡萄糖/min
#### 2.6.2 冻干耐受性分析
酵母细胞在40 mL YPD培养基（含1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖）中、30°C培养48小时。酵母培养物随后以5000 ×g离心5分钟。所得细胞沉淀用无菌蒸馏水洗涤三次。细胞沉淀在−80°C预冻。预冻样品随后使用Freeze Dryer FD系列冷冻干燥机（Panchum Co., Ltd.，台湾高雄）冻干。干燥过程中，真空压力维持在1.3 × 10¹ Pa以下，样品共干燥48小时。酵母细胞冻干后，使用扫描电子显微镜（TM4000Plus，Hitachi，日本东京）观察酵母细胞形态。冻干酵母粉在35°C无菌水中复水。取0.1 mL等分试样涂布于YPD琼脂平板上。计数冻干前后的菌落形成单位（CFU）以确定存活率。为测定冻干酵母粉的恢复率，将复水的酵母悬浮液调整至OD600为0.3。取200 μL细胞悬浮液以12,000 ×g离心1分钟。去除上清液，沉淀重悬于200 μL YPD培养基中。然后加入10 μL Cell Counting Kit-8试剂（Selleck Chemicals，美国休斯顿），充分混匀，转移至96孔板。在30°C孵育1小时后，每15分钟在450 nm处测定吸光度。
【数据】培养体积：40 mL YPD；温度：30°C；时间：48h；离心：5000 ×g 5min；预冻：−80°C；真空度：<1.3 × 10¹ Pa；冻干时间：48h；复水温度：35°C；OD600：0.3；离心：12,000 ×g 1min；CCK-8孵育：30°C 1h；检测波长：450nm
2.7 啤酒酿造
按照BJCP啤酒风格指南（5B. Kölsch）酿造Kölsch啤酒。将8 kg皮尔森麦芽和1 kg维也纳麦芽加入50 L水中，在67°C糖化1小时。过滤去除残余固体麦芽后，煮沸麦汁，加入30 g Saaz啤酒花。煮沸45分钟后，再加入20 g Saaz啤酒花，再煮沸15分钟后，迅速冷却至室温。随后接种酿酒酵母WLP029或WLP029Δnth1Δfks3（WLPPU），在16°C发酵4周，然后转移至4°C储存。发酵通过接种新鲜预培养的酵母细胞至终浓度1 × 10⁷细胞/mL启动。
【数据】麦芽：8 kg皮尔森麦芽+1 kg维也纳麦芽；水量：50 L；糖化：67°C 1h；啤酒花：30 g+20 g Saaz；发酵温度：16°C；发酵时间：4周；储存温度：4°C；接种浓度：1 × 10⁷细胞/mL
2.8 乙醇含量测定
乙醇浓度使用气相色谱-火焰离子化检测器（Agilent 7890 A，Agilent Inc.，美国加州帕洛阿尔托）测定。样品在210°C进样。分离在SH-Wax色谱柱（60 m × 0.53 mm × 1.0 μm，Shimadzu，日本京都）上进行，以氦气为载气。柱温箱从40°C以2°C/min升温至80°C，然后以10°C/min升温至210°C。检测器温度设定为230°C。
【数据】进样口温度：210°C；色谱柱：SH-Wax（60 m × 0.53 mm × 1.0 μm）；载气：氦气；升温程序：40°C→2°C/min→80°C→10°C/min→210°C；检测器温度：230°C
2.9 胞外碱性磷酸酶（ALP）活性测定
酵母菌株培养——
（原文节选在此处中断，后续步骤原文未详述）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 CRISPR/Cas基因删除技术敲除NTH1和FKS3基因
全基因组测序确认亲本工业菌株WLP029为四倍体（补充材料，图S1）。克服多倍体背景下的编辑复杂性，本研究成功构建了三株基因缺失酵母菌株：NTH1缺失（WLP029Δnth1）、FKS3缺失（WLP029Δfks3）以及NTH1和FKS3同时缺失（WLP029Δnth1Δfks3）。使用NTH1和FKS3特异性引物，以酵母基因组为模板，PCR结果显示缺失菌株中NTH1或FKS3的基因大小均小于其亲本菌株。全基因组测序结果也证实，在RNA引导下，Cas9从WLP029Δnth1和WLP029Δnth1Δfks3的NTH1 DNA中精准删除了140 bp；从WLP029Δfks3和WLP029Δnth1Δfks3的FKS3 DNA中删除了403 bp（补充材料，图S2、S3）。
【数据】NTH1删除片段：140 bp；FKS3删除片段：403 bp；亲本菌株倍性：四倍体
3.2 胞内中性海藻糖酶活性和海藻糖含量
WLP029Δnth1和WLP029Δnth1Δfks3的胞内中性海藻糖酶活性显著低于WLP029（p < 0.05），证实了WLP029Δnth1和WLP029Δnth1Δfks3基因组中NTH1基因的缺失，从而丧失胞内中性海藻糖酶活性（图1a）。图1(b)显示，酵母细胞中NTH1缺失导致降解海藻糖的中性海藻糖酶活性丧失，使WLP029Δnth1胞内海藻糖积累量更大（p < 0.05）。虽然单独缺失FKS3（WLP029Δfks3）降低了胞内海藻糖含量（p < 0.05），但双基因同时缺失（WLP029Δnth1Δfks3）导致胞内海藻糖更显著地增加。这一结果表明NTH1和FKS3的基因表达之间存在一定程度的相互作用，值得进一步研究。
【数据】中性海藻糖酶活性：WLP029Δnth1和WLP029Δnth1Δfks3显著低于野生型（p < 0.05）；胞内海藻糖含量：WLP029Δnth1显著高于野生型（p < 0.05）；WLP029Δfks3显著低于野生型（p < 0.05）；WLP029Δnth1Δfks3显著增加
3.3 冻干对基因缺失菌株的影响
为评估NTH1和/或FKS3缺失是否能如预期增强菌株对干燥环境的耐受性，将WLP029和三株基因缺失菌株以及商业干酵母菌株US-05进行冻干处理。测定了细胞存活率（图2a）和恢复率（图2b）。US-05的存活率（3.85 ± 0.0868%）显著高于WLP029（0.015 ± 0.0015%）。这一结果表明WLP029对干燥的耐受性极低，这可能解释了市场上没有WLP029干酵母粉的原因。WLP029Δnth1的存活率（0.287 ± 0.0516%）显著优于WLP029，表明NTH1缺失能显著提高酵母对冻干的耐受性。然而，FKS3缺失降低了冻干耐受性，WLP029Δfks3的存活率为0.022 ± 0.0021%，WLP029Δnth1Δfks3的存活率为0.031 ± 0.0010%。冻干酵母细胞用水溶性四唑盐8（淡黄色）培养，在细胞代谢过程中被还原为甲臜（橙色）。WLP029的OD450值在培养150分钟后未增加，表明虽然少量细胞仍然存活，但它们可能处于受损状态，因此代谢活性非常低。基因缺失菌株和US-05的细胞活性随培养时间显著增加，表明干燥的基因缺失菌株和US-05在复水60分钟后能恢复代谢能力。特别是WLP029Δnth1在复水后表现出最高的细胞代谢活性，甚至优于US-05。虽然WLP029Δfks3复水后的活性优于其亲本菌株，但仍远低于WLP029Δnth1，且WLP029Δnth1Δfks3复水后的活性也低于WLP029Δnth1。无论冻融和干燥耐受性还是复水后的代谢能力，WLP029中FKS3缺失改善了这些性状，但掩盖了NTH1缺失的效果。
使用扫描电子显微镜观察冻干酵母粉的细胞表面结构。细胞完整性最高的是WLP029Δnth1和WLP029Δfks3，其次是WLP029Δnth1Δfks3，野生型WLP029最低（图3）。冻干后，野生型细胞出现严重破裂，几乎没有完整细胞，而大多数NTH1或FKS3缺失细胞表现为完整或皱缩状态。然而，WLP029Δnth1Δfks3比单基因缺失菌株表现出更多破裂细胞。与野生型相比，三株缺失菌株在冻干后均有更好的存活率和代谢恢复，可能是因为NTH1和FKS3缺失有助于酵母在干燥过程中维持细胞壁形态，进一步减少酵母细胞死亡并增加复水后的活力。然而，双基因缺失在细胞结构方面表现出比单基因缺失更差的脱水耐受性，其原因有待未来研究探索。
【数据】存活率：US-05为3.85 ± 0.0868%；WLP029为0.015 ± 0.0015%；WLP029Δnth1为0.287 ± 0.0516%；WLP029Δfks3为0.022 ± 0.0021%；WLP029Δnth1Δfks3为0.031 ± 0.0010%；代谢恢复时间：60min
3.4 基因缺失菌株在啤酒酿造中的特性分析
本研究发酵啤酒4周。虽然标准艾尔发酵通常在3-5天内完成，但本研究延长的发酵时间是由Kölsch风格杂交发酵的特殊要求决定的。在16°C下发酵酿酒酵母WLP029菌株——显著低于常规艾尔发酵温度范围（>20°C）——麦芽糖利用效率显著降低。这一现象主要归因于麦芽糖摄取的温度依赖性动力学，这通常是啤酒酵母的限速步骤（Rautio and Londesborough, 2003）。与拉格菌株不同，艾尔菌株主要利用的Agt1转运蛋白在低温下活性急剧下降（Vidgren et al., 2010）。酿酒酵母利用麦汁中存在的可发酵糖——本研究麦汁中主要包含麦芽糖（167.11 ± 0.39 mM）、葡萄糖（69.17 ± 1.8 mM）和果糖（43.65 ± 0.16 mM），以及麦芽三糖——来产生乙醇。我们观察到麦芽糖水平在第二周降至最低（补充图S6），而葡萄糖和果糖在第一周内被完全消耗（数据未显示）。乙醇浓度在整个4周内持续增加（补充材料，图S5），进一步证实了在这种特定杂交条件下（在拉格式低温下使用艾尔酵母）的缓慢发酵动力学。
图4显示了发酵过程中酵母活力的变化。由于营养缺乏和乙醇浓度增加等环境胁迫，酵母细胞在初级发酵两周后开始死亡（图4a）。发酵三周后，基因缺失菌株的活力显著高于野生型。发酵四周后，虽然所有菌株的活力均显著下降，但WLP029Δnth1Δfks3显著高于其他三组，表明NTH1和FKS3同时缺失在提高酵母对营养缺乏和乙醇的耐受性方面比单独缺失NTH1或FKS3更有效。在啤酒酿造的次级发酵阶段，添加0.07%葡萄糖以确保啤酒中产生足够的CO₂。由于营养物质的重新可用，大多数细胞也恢复生长（图4b）。当酵母细胞缺乏营养时，胞内海藻糖酶会分解细胞壁海藻糖作为营养来源。可以观察到，NTH1缺失（无论是WLP029Δnth1还是WLP029Δnth1Δfks3）导致恢复速度较慢，可能是因为无法降解胞内海藻糖作为恢复的碳源，但大多数细胞在次级发酵第二周时能够恢复。
啤酒酿造完成后，在4°C下储存，细胞活力随储存时间增加而下降（图5）。特别是野生型的活力——
（原文节选在此处中断）
【数据】麦汁糖组成：麦芽糖167.11 ± 0.39 mM、葡萄糖69.17 ± 1.8 mM、果糖43.65 ± 0.16 mM；发酵温度：16°C；次级发酵添加葡萄糖：0.07%；储存温度：4°C
讨论与解读
本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除德国Kölsch啤酒酿造酵母WLP029基因组中的NTH1和FKS3基因。NTH1缺失增加了酵母胞内海藻糖积累，间接保护细胞膜完整性并提高干燥环境耐受性；FKS3缺失改变细胞壁结构，减缓酵母自溶。CRISPR/Cas9技术避免了向宿主细胞染色质插入外源基因，且在不含G418的培养基中传代后可轻松去除宿主细胞中的外源质粒。因此，经CRISPR基因编辑技术改造的生物体基因组不携带任何外源基因，缓解了消费者对转基因食品安全性的担忧。
WLP029在干燥后常丧失发酵活性，无法成功转化为干酵母粉。本研究通过基因编辑显著改善了其冻干存活率和代谢恢复能力。双基因缺失菌株在啤酒发酵后期和冷藏储存中表现出最优的细胞活力和抗自溶特性，同时RNA-seq分析显示抗氧化和应激响应蛋白表达上调。
【编译者解读】本研究巧妙地将海藻糖代谢（NTH1）与细胞壁合成（FKS3）两个靶点结合，从膜保护和壁结构两个维度协同提升酵母胁迫耐受性。CRISPR/Cas9的非转基因特性契合食品工业对GMO的审慎态度，具有明确的产业化路径。值得注意的是，双基因缺失在冻干耐受性上反而不及单基因缺失，提示基因编辑的叠加效应并非总是正向——这一反直觉发现为合成生物学的多靶点策略提供了重要警示。未来若能解析NTH1与FKS3间的互作机制，或将实现更精准的菌株设计。
参考来源
Tan, C.-Y. (2026). Enhancing environmental stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by deletion of NTH1 and FKS3: Implications for beer brewing. International Journal of Food Microbiology. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2026.111778
DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2026.111778