双营养缺陷型偶联红色标记策略：酿酒酵母高效基因组编辑新方法

📅 2026-09-01 📰 Fungal Genetics and Biology 2024-08-31 📂 研究进展 👁 13

来源：Dual auxotrophy coupled red labeling strategy for efficient genome editing in Saccharomyces cerevisiae（Fungal Genetics and Biology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：质粒载体构建校验

导读

酿酒酵母基因编辑常被认为"轻而易举"，但本研究揭示了一个被忽视的问题——无论采用同源重组（HR）、CRISPR/Cas9还是二者结合的HDR策略，敲除BY4742的ade2基因时都不可避免地产生杂合克隆（heteroclone），纯合敲除率最高仅76%。研究者巧妙利用ade2缺陷型在YPD平板上呈现红色的特性，构建了"双营养缺陷型偶联红色标记"策略，以BY4742(ade2Δ0)为起始菌株，实现了trp1基因100%的敲除效率，为无颜色表型靶基因的纯合克隆筛选提供了全新方案。

研究背景

真菌按形态可分为酵母、丝状真菌和大型真菌三类。大型真菌多为多细胞真核生物，且大多具有异核体特征（单个细胞内含有两个或以上遗传背景不同的细胞核），这使得其分子遗传操作极为困难。尽管食用菌工厂化智能装备和配套栽培技术日趋成熟——2023年仅福建省食用菌全产业链产值就突破千亿元——但大型真菌的品种改良仍停留在传统杂交育种水平，成为产业发展的瓶颈。

酵母作为进化地位最低的单细胞真菌，遗传背景清晰，分子遗传操作系统相对简单、成熟、高效。以酵母单倍体遗传操作系统为参照，逐步建立大型真菌的复杂遗传操作系统，可能是一条可行路径。本研究系统比较了HR策略、CRISPR/Cas9策略及二者结合的HDR策略在敲除BY4742 ade2基因中的优劣，并据此开发了一种高效筛选纯合敲除克隆的新策略。

研究方法

2.1 菌株、质粒与试剂

本研究所涉及的菌株和质粒信息见表S1。GeneJET凝胶回收试剂盒、GeneJET质粒小提试剂盒及相关限制性内切酶购自Thermo Fisher Scientific。Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶和ClonEXpress II一步克隆试剂盒购自Vazyme。T4 DNA连接酶和2×Taq Master Mix购自Takara。醋酸锂、PEG3350、蛋白胨、酵母提取物和SC培养基粉末均购自Coolaber。引物信息见表S2。引物合成和基因测序由福州博尚生物技术有限公司完成。

【数据】试剂来源：Thermo Fisher Scientific、Vazyme、Takara、Coolaber；引物合成：福州博尚生物技术有限公司

2.2 菌株培养

大肠杆菌在LB培养基中、37°C、200 rpm条件下培养。转化抗性质粒时，培养基中添加的抗生素浓度为：氨苄青霉素100 mg/L或卡那霉素50 mg/L。根据实验要求，酵母菌株在以下培养基中、28°C、200 rpm条件下培养：

YPD：蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L、葡萄糖20 g/L
YPDG：蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L、葡萄糖20 g/L、G418 200 mg/L
SC：葡萄糖20 g/L、酵母氮碱基（YNB）6.7 g/L、SD 0.7 g/L
SC-leu：葡萄糖20 g/L、YNB 6.7 g/L、SD-leu 0.7 g/L
SC-ura：葡萄糖20 g/L、YNB 6.7 g/L、SD-ura 0.7 g/L
SC-ade：葡萄糖20 g/L、YNB 6.7 g/L、SD-ade 0.7 g/L
SC-leu-ura：葡萄糖20 g/L、YNB 6.7 g/L、SD-leu-ura 0.7 g/L
SC-ade-ura：葡萄糖20 g/L、YNB 6.7 g/L、SD-ade-ura 0.7 g/L
SCG-ura：葡萄糖20 g/L、YNB 6.7 g/L、SD-ura 0.7 g/L、G418 200 mg/L
SCF：葡萄糖20 g/L、YNB 6.7 g/L、SD 0.7 g/L、5-FOA 1 g/L
SC-trp：葡萄糖20 g/L、YNB 6.7 g/L、SD-trp 0.7 g/L

【数据】大肠杆菌培养：37°C、200 rpm；氨苄青霉素100 mg/L、卡那霉素50 mg/L；酵母培养：28°C、200 rpm；各培养基成分：蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L、葡萄糖20 g/L、YNB 6.7 g/L、G418 200 mg/L、5-FOA 1 g/L

2.3 转化

从−80°C冰箱取出大肠杆菌感受态细胞。按照常规大肠杆菌转化方法，将10 μL连接产物或10 μL重组产物转化至感受态细胞中。

酵母转化采用醋酸锂化学转化法。将酵母菌株单菌落接种至10 mL YPD中，在旋转摇床上过夜培养。生长12–16小时后，用分光光度计测定酵母细胞数。将培养物转接至50 mL新鲜YPD培养基，调整至0.25 OD，培养至细胞数至少达到2×10⁷ cells/mL。这一过程约需5小时。随后7000 g离心5分钟收集细胞，用0.01倍体积的无菌水重悬，每管分装50 μL，再次离心。弃去上清后，向管中加入混合物（240 μL 50%（m/v）PEG3350、36 μL 1 M LiAc、25 μL SSDNA、不超过50 μL转化DNA）。用微量移液器吹打均匀后，混合物置于30°C水浴30分钟，再转移至42°C水浴25分钟，5000 g离心1分钟，弃上清。向管中加入100 μL无菌水，混匀后涂布于相应的抗性平板或营养缺陷型平板上。

【数据】酵母培养：10 mL YPD、12–16 h；转接至50 mL YPD、0.25 OD、约5 h至2×10⁷ cells/mL；离心：7000 g、5 min；分装：50 μL/管；转化体系：240 μL 50% PEG3350、36 μL 1 M LiAc、25 μL SSDNA、≤50 μL DNA；水浴：30°C 30 min、42°C 25 min；离心：5000 g、1 min；最终重悬：100 μL无菌水

2.4 质粒构建

#### 2.4.1 HR策略用质粒构建

以P1和P2为引物，扩增BY4742 ade2 CDS上游1000 bp片段，命名为ADE2 UHA；以P3和P4为引物，扩增ade2 CDS下游1000 bp片段，命名为ADE2 DHA。ADE2 DHA经Sac I和EcoR I双酶切后，克隆至经同样酶切的pFA6a-KanMX6质粒中，获得穿梭载体。该穿梭载体经BamH I和Sal I双酶切，通过ClonEXpress II一步克隆试剂盒将ADE2 UHA组装至酶切产物中。该载体命名为pFA6a-ADE2 UHA-KanMX-ADE2 DHA，载体上的ADE2 UHA-KanMX-ADE2 DHA片段命名为UKD。

以pRS425质粒为模板，用P5和P6引物扩增leu2表达盒。该片段用于替换pFA6a-ADE2 UHA-KanMX-ADE2 DHA载体中的KanMX表达盒，从而获得载体pFA6a-ADE2 UHA-LEU2-ADE2 DHA。该载体上的ADE2 UHA-LEU2-ADE2 DHA片段命名为ULD。

以pFA6a-ADE2 UHA-LEU2-ADE2 DHA为模板，用P7和P8引物扩增ADE2 UHA，用P9和P10引物扩增ADE2 DHA。以ADE2 UHA和ADE2 DHA为模板、P7和P10为引物，通过桥式PCR技术获得ADE2 UHA-ADE2 DHA片段，命名为UD。UD、UKD和ULD用于后续HR策略，并作为CRISPR/Cas9策略中的同源介导修复模板。

【数据】同源臂长度：各1000 bp；限制性内切酶：Sac I、EcoR I、BamH I、Sal I；片段名称：UD、UKD、ULD

#### 2.4.2 含ade2表达盒的同源介导修复载体构建

首先，用P11和P12引物扩增ade2 CDS，将该片段组装至经Mlu I和Hind III消化的pRS426-Tp-At（图S1）中。该载体命名为pRS426-Tp-ADE2-At。其次，以P13和P14为引物扩增Tp-ADE2-At表达盒。该片段组装至经Xho I和Apa I消化的pRS313-MCH（图S1）中。该载体命名为pRS313-Tp-ADE2-At。最后，用P15和P16引物扩增trp1 CDS上游1000 bp（TRP1 UHA），用P17和P18引物扩增trp1 CDS下游1000 bp（TRP1 DHA）。TRP1 UHA和TRP1 DHA组装至经Xho I和Sac I消化的pRS313-Tp-ADE2-At中。该载体命名为pRS313-TRP1-Tp-ADE2-At。pRS313-TRP1-Tp-ADE2-At经Sal I线性化后，用作CRISPR/Cas9-HDR策略中trp1敲除的修复模板。

【数据】同源臂长度：TRP1 UHA 1000 bp、TRP1 DHA 1000 bp；限制性内切酶：Mlu I、Hind III、Xho I、Apa I、Sac I、Sal I

#### 2.4.3 CRISPR/Cas9敲除质粒构建

从NCBI下载酿酒酵母S288C基因组序列，提取ade2 CDS序列。在网站（https://zlab.bio/guide-design-resources）上设计ade2 CDS的gRNA，选择一条高评分的20 nt gRNA序列。gRNA单链（P19）和互补链（P20）经人工合成后杂交为双链DNA（程序：95°C 5分钟，每分钟下降2°C，设置30个循环，39°C 1分钟，25°C 5分钟）。杂交后的双链连接至经Bcl I和Swa I消化的pML104中。该载体命名为pML104-ADE2-sgRNA。pML104-TRP1-sgRNA的构建过程与此类似。

【数据】gRNA长度：20 nt；杂交程序：95°C 5 min、每min降2°C、30循环、39°C 1 min、25°C 5 min；限制性内切酶：Bcl I、Swa I

2.5 不同策略敲除BY4742 ade2

#### 2.5.1 HR策略敲除BY4742 ade2

UD、UKD和ULD DNA片段通过PCR扩增大量制备并分别纯化。将纯化后的DNA片段转化至BY4742感受态细胞中，设置10⁵–10⁸四个细胞梯度。最终转化产物分别涂布于YPD平板、YPDG平板和SC-leu平板上。从上述平板随机挑取克隆，划线至YPD平板观察颜色变化。大多数情况下，划线后的亚克隆呈现三种颜色表型：纯白、纯红、红白相间。为区分脱靶克隆、不完全敲除克隆和完全敲除克隆，根据亚克隆在YPD平板上的颜色定义：纯红为纯合敲除克隆；纯白为脱靶克隆；红白相间为杂合克隆。纯合敲除克隆率和杂合克隆率的计算公式分别为公式(1)和公式(2)：

(1) 纯合敲除克隆率 = 纯红色克隆数 ÷ 所有生长克隆数 × 100%

(2) 杂合克隆率 = 红白相间克隆数 ÷ 所有生长克隆数 × 100%

【数据】转化细胞梯度：10⁵–10⁸；筛选平板：YPD、YPDG、SC-leu；判定标准：纯红=纯合敲除、纯白=脱靶、红白=杂合

#### 2.5.2 CRISPR/Cas9策略敲除BY4742 ade2

将pML104-ADE2-sgRNA质粒转化至BY4742，涂布于SC-ura平板，培养至明显克隆生长。将SC-ura平板上生长的克隆划线至YPD平板。统计不同颜色表型的克隆数。

【数据】筛选平板：SC-ura；二次筛选：YPD平板

#### 2.5.3 CRISPR/Cas9-HDR策略敲除BY4742 ade2

将pML104-ADE2-sgRNA质粒与同源介导修复模板（UD、UKD或ULD）共转化至BY4742细胞，涂布于SC-ura平板。从各组平板随机挑取克隆，划线至YPD平板观察颜色表型并统计。

【数据】共转化组合：pML104-ADE2-sgRNA + UD/UKD/ULD；筛选平板：SC-ura

研究结果

3.1 HR策略敲除BY4742 ade2

UD、UKD和ULD的结构示意图如图1A所示。转化细胞数设置10⁵至10⁸四个梯度。统计不同颜色表型的克隆数。根据转化子中红色克隆的比例判断ade2敲除效率。

▲ HR strategy used for BY4742 ade2 knockout. A: Schematic diagram of the structures of UD, UKD, and ULD; B: Pictures to show clone growth from 105 to 108 cells transformed by UD, UKD, and ULD, respectively; C: Picture to show that some red clones from YPDG plate and SC-leu plate were restreaked onto Y

UD转化至BY4742后，10⁵至10⁸四个梯度的转化酵母在YPD平板上均呈现白色菌落（图1B）。实验结果表明，UD在没有任何选择压力的情况下无法敲除ade2。

UKD转化至BY4742后，涂布于YPDG平板。实验结果如图1B所示。10⁵–10⁷转化平板上同时出现红色克隆和白色克隆。从10⁵–10⁷平板中随机选取50个红色克隆划线至YPD平板，发现部分划线红色克隆的亚克隆为杂合克隆，同时包含红色克隆和白色克隆（图1C）。统计数据显示，UKD策略的纯合敲除克隆率在16.67%至76.25%之间，杂合克隆率在9.75%至23.33%之间（图1D）。

ULD用于ade2敲除时，10⁵至10⁸转化平板上均有克隆出现（图1B）。统计数据显示，ULD策略的纯合敲除率在7.41%至12.28%之间，杂合克隆率为74.55%至86.79%（图1D）。

【数据】UD策略：10⁵–10⁸梯度均无敲除；UKD策略：纯合敲除率16.67%–76.25%，杂合率9.75%–23.33%；ULD策略：纯合敲除率7.41%–12.28%，杂合率74.55%–86.79%

3.2 CRISPR/Cas9策略敲除BY4742 ade2

ade2位点上的gRNA PAM位点和Cas9向导靶位点如图2A所示。将pML104-ADE2-sgRNA质粒转化至10⁷个细胞，涂布于SC-ura平板。结果显示，该平板上仅生长少量克隆，每板10至30个克隆（图2B）。

▲ 用于BY4742 ade2敲除的CRISPR/Cas9策略。A：ade2位点上Cas9向导靶标及其邻近PAM；B：显示CRISPR/Cas9或CRISPR/Cas9-HDR策略产生的克隆图片；C：统计数据。

当pML104-ADE2-sgRNA质粒与同源介导修复模板（UD、UKD或ULD）共转化时，平板上生长的克隆数显著增加，每板160至350个克隆（图2B）。从每组平板随机挑取80个克隆划线至YPD平板。结果显示，单独使用CRISPR/Cas9时，纯合敲除克隆率和杂合克隆率分别为0%和38.89%。CRISPR/Cas9与UD联合使用时，纯合敲除克隆率仍为0%，但杂合克隆率升至96.55%。然而，当UKD或ULD作为修复模板与CRISPR/Cas9联用时，纯合敲除克隆率为43%–44%，杂合克隆率为55%–56%（图2C和表1）。

上述结果清楚表明，CRISPR/Cas9-HDR策略能显著提高转化细胞的存活率，且在同源介导修复模板中引入选择标记后，纯合敲除克隆率可达约43%。就基因编辑而言，CRISPR/Cas9通常被认为远比传统HR高效。本研究结果也确实如此。为更直观地展示这一点，我们在10⁷个细胞中比较了CRISPR/Cas9与HR的基因编辑效率（表1）。数据显示，CRISPR/Cas9-HDR策略的编辑效率为100%。更重要的是，与其他两种策略相比，CRISPR/Cas9-HDR提高了纯红色克隆的比例。

【数据】CRISPR/Cas9单用：每板10–30克隆，纯合敲除率0%，杂合率38.89%；CRISPR/Cas9+UD：每板160–350克隆，纯合敲除率0%，杂合率96.55%；CRISPR/Cas9+UKD/ULD：纯合敲除率43%–44%，杂合率55%–56%；CRISPR/Cas9-HDR编辑效率：100%

3.3 菌株BY4742(ade2Δ0)的构建

上述结果表明，无论采用何种策略敲除BY4742 ade2，获得的克隆中均有一部分是杂合克隆。若想获得纯合敲除克隆，需要多步分离纯化。对于具有颜色表型的靶基因（如ade1或ade2），分离纯化纯合敲除克隆简单方便。然而，对于其他无颜色表型靶基因的敲除，则需要提取大量候选克隆基因组，再通过生物学技术（PCR或Southern印迹等）筛选纯合敲除克隆。这是一个盲目的、耗时费力的过程。因此，建立一种从生长克隆中简单快速筛选纯合敲除克隆的策略具有重要意义。

▲ 菌株BY4742(ade2Δ0)的构建。A：展示BY4742(ade2Δ0)在YPD、SC、SC-ura和SC-ade平板上重新划线培养的图片；B：PCR扩增鉴定BY4742(ade2Δ0)，泳道M：5000 DL marker，泳道1：P23和P24引物扩增BY4742基因组得到的PCR产物，泳道2：

采用CRISPR/Cas9联合UD策略敲除ade2，选取一个在YPD平板上多次划线仍为纯红色的克隆。将该克隆划线至SCF平板以消除pML104质粒。候选质粒消除克隆分别划线至YPD、SC、SC-ade和SC-ura平板。结果显示，该克隆在YPD平板上呈红色，在SC平板上呈白色，但无法在SC-ade和SC-ura平板上生长（图3A）。分子鉴定结果如图3B所示。ade2敲除克隆基因组扩增的PCR产物位于500 bp处，而BY4742基因组扩增的产物位于2000 bp处，表明ade2已被成功删除。该克隆重新命名为BY4742(ade2Δ0)。

若以BY4742(ade2Δ0)为起始菌株，以SC-ade-ura为筛选平板，转化克隆将在筛选平板上承受双营养缺陷标记的选择压力，并在YPD平板上呈现颜色表型，从而有可能快速筛选出纯合敲除克隆。

【数据】PCR鉴定：ade2敲除克隆500 bp、BY4742野生型2000 bp；筛选平板：SCF、YPD、SC、SC-ade、SC-ura

3.4 双营养缺陷型偶联红色标记策略用于trp1敲除

本研究选取trp1作为测试基因。trp1位点上的Cas9向导靶位点及其相邻PAM如图4A所示。示意图展示了trp1敲除过程（图4B）。将总共10⁷个BY4742(ade2Δ0)细胞用sgRNA质粒和线性化UAD转化，转化细胞涂布于SC-ade-ura平板，如图4C所示。

▲ 双营养缺陷型偶联红色标记策略用于trp1敲除。A：trp1位点上的Cas9指导靶标及其相邻PAM；B：显示trp1敲除过程的示意图；同时标出了用于UAD整合验证的引物；C：trp1敲除克隆的筛选过程

从SC-ade-ura平板随机挑取8个克隆划线至YPD平板。所有克隆均呈现纯白色（图4C），表明所有转化子的ade2缺陷均得到了补偿。将这8个克隆划线至SC-trp平板，结果显示它们均无法生长（图4C），表明trp1功能已被破坏。为进一步验证修复模板是否正确整合至BY4742(ade2Δ0)基因组中，提取这8个克隆的基因组，通过PCR扩增这些基因组上可能存在的嵌合DNA片段（图4D）。分子鉴定结果表明，所分析克隆的基因组中存在UAD片段。此外，UAD以正确方向整合至trp1位点。

【数据】转化细胞数：10⁷；筛选平板：SC-ade-ura；随机挑取克隆数：8个；YPD表型：全部纯白；SC-trp生长：全部不能生长；UAD整合方向：正确

讨论与解读

此前研究表明，ade2缺陷型酵母在YPD平板上呈现红色，提示ade2可作为遗传操作中的可视化表型。本研究利用颜色变化判断ade2删除操作是否成功，系统分析了不同策略对ade2删除的敲除效率。根据Wang等人的结果，当同源重组臂长度为1000 bp时，敲除Ogataea polymorpha ade2的效率相对较高。因此，本研究使用的同源重组臂或同源介导修复模板长度均设计为约1000 bp。

研究结果显示，当转化细胞数在10⁵–10⁸之间时，UD无法敲除ade2；UKD敲除ade2的效率与转化细胞数呈负相关；而ULD敲除ade2的效率几乎不受转化细胞数影响。此前研究表明，营养缺陷型标记优于药物抗性筛选标记。无论采用UKD还是ULD策略，候选敲除克隆中均存在未编辑细胞，这通过划线至YPD平板得以证实。此外，当采用CRISPR/Cas9策略时，同样存在类似问题。

本研究建立的双营养缺陷型偶联红色标记策略，以BY4742(ade2Δ0)为起始菌株，利用ade2红色表型作为可视化筛选标记，同时施加双营养缺陷选择压力，实现了trp1基因100%的敲除效率，解决了无颜色表型靶基因难以筛选纯合敲除克隆的技术难题。

编译者解读

本研究最值得称道之处，在于将"缺陷"转化为"工具"——ade2敲除产生的红色表型本是编辑事件的副产物，研究者却将其设计为筛选标记，与营养缺陷型选择压力形成双重筛选机制。这种"以子之矛攻子之盾"的策略思维，对合成生物学中其他模式菌株的基因编辑具有借鉴价值。值得注意的是，该方法对异核体大型真菌的适用性仍需验证——大型真菌单核菌丝体的遗传操作远比酵母复杂，同源重组效率、gRNA递送效率等关键参数均有待探索。但至少，该策略为大型真菌基因编辑中纯合克隆筛选这一共性难题提供了一种可参考的解决思路。

参考来源

Li, J. (2024). Dual auxotrophy coupled red labeling strategy for efficient genome editing in Saccharomyces cerevisiae. Fungal Genetics and Biology. DOI: 10.1016/j.fgb.2024.103910

DOI: 10.1016/j.fgb.2024.103910

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