来源：Using CRISPR/Cas9 for multiplex genome engineering to optimize the ethanol metabolic pathway in Saccharomyces cerevisiae（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
乙醇被视为化石燃料最具潜力的替代品之一，而酿酒酵母是乙醇生产的经典工业菌株。然而，副产物甘油和乙酸的生成分流了碳代谢流，限制了乙醇产率的进一步提升。本研究基于CRISPR/Cas9系统开发了一种一步法、高效率的多基因同时敲除策略，对ADH2、GPD1和ALD4三个基因进行单、双、三组合敲除，系统筛选出高产乙醇菌株。结果显示，双突变菌株YS-6乙醇产量较野生型提高40.63%，三突变菌株YS-7乙醇得率提升22.54%，且这是首个利用CRISPR/Cas9对ALD4基因进行组合工程改造以提高乙醇生产的研究。
研究背景
化石燃料目前是全球最重要的能源来源，但工业的快速发展和不可再生燃料的持续消耗引发了气候变暖和环境污染等一系列全球性问题。发展环境友好的可持续能源，推动清洁、低碳的全球经济转型已成为迫切需求。生物乙醇作为化石燃料最有前景的替代品之一，已在多国推广应用。
出芽酵母酿酒酵母是研究最深入的模式生物之一，凭借其高生产速率以及对乙醇和渗透压的高耐受性，在乙醇及其他化学品的生产中有着悠久历史，已被广泛用作先进生物燃料和化学品的微生物细胞工厂。在工业规模发酵中，高产率、高生产强度和高终产物浓度是核心目标。厌氧生长条件下，酿酒酵母通过丙酮酸脱羧生成乙醛，再由乙醇脱氢酶（ADH）将乙醛还原为乙醇。然而，天然酿酒酵母在生物乙醇生产过程中会形成甘油和乙酸等多种副产物，导致碳流向乙醇的调控成为提高乙醇产率的关键瓶颈。
研究方法
2.1 菌株、培养基与培养条件
大肠杆菌XL10-Gold用于质粒构建和基因操作。大肠杆菌在LB培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）中于37°C培养，并添加100 μg/mL氨苄青霉素。Y1H被选为酵母宿主菌株，本研究所用酵母菌株列于补充文件3中。转化前，酵母菌株在含10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖和50 mg/L腺嘌呤的YPDA培养基中培养。转化后，酵母细胞在含6.7 g/L酵母氮源基础培养基（不含氨基酸）、20 g/L葡萄糖及适量氨基酸和核苷酸的合成葡萄糖（SD）培养基中培养。固体培养基含20 g/L琼脂。发酵实验中，酵母菌株在发酵培养基（12%（w/v）葡萄糖、0.5%（w/v）硫酸铵、0.2%（w/v）磷酸二氢钾、0.8%（w/v）酵母提取物）中培养。所有酵母实验均在30°C下进行。
【数据】大肠杆菌培养基：LB（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）；温度：37°C；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素；酵母培养基：YPDA（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、50 mg/L腺嘌呤）；SD培养基：6.7 g/L YNB、20 g/L葡萄糖；发酵培养基：12%葡萄糖、0.5%硫酸铵、0.2%磷酸二氢钾、0.8%酵母提取物；温度：30°C
2.2 gRNA选择、供体设计与质粒构建
gRNA选择、供体设计及单gRNA表达盒的构建方法与前期研究一致。多重gRNA表达质粒的构建步骤如下：首先，用引物P1/P2 PCR扩增gRNA-ALD4表达盒，所得PCR产物经KpnI和BamHI双酶切后，分别克隆到经同样酶切的pMD19-T-ADH2和pMD19-T-GPD1质粒中，生成pMD19-T-ADH2-ALD4和pMD19-T-GPD1-ALD4。为构建pMD19-T-ADH2-GPD1和pMD19-T-ADH2-GPD1-ALD4，使用引物P5/P6扩增gRNA-ADH2表达盒，产物经SalI和HindIII酶切后，克隆到经同样酶切的pMD19-T-GPD1和pMD19-T-ADH2-GPD1质粒中（图2a）。
同时含有Cas9和多个sgRNA表达盒的载体构建如下：首先，用SacII和EagI双酶切pML107质粒以去除空白gRNA表达盒。然后，分别以pMD19-T-ADH2-GPD1、pMD19-T-ADH2-ALD4、pMD19-T-GPD1-ALD4和pMD19-T-ADH2-GPD1-ALD4为模板，用引物对P7/P8、P7/P9、P10/P9和P7/P9扩增多重gRNA表达盒ADH2-GPD1、ADH2-ALD4、GPD1-ALD4和ADH2-GPD1-ALD4。所得PCR产物经SacII和EagI酶切后克隆到经同样酶切的pML107质粒中，获得pML107-ADH2-GPD1、pML107-ADH2-ALD4、pML107-GPD1-ALD4和pML107-ADH2-GPD1-ALD4。引物序列见补充文件1。所有构建的质粒均通过菌落PCR和DNA测序验证。供体序列、质粒和菌株分别列于补充文件2和3。
【数据】限制性内切酶：KpnI、BamHI、SalI、HindIII、SacII、EagI；模板质粒：pMD19-T系列、pML107；引物对：P1/P2、P5/P6、P7/P8、P7/P9、P10/P9；验证方法：菌落PCR、DNA测序
2.3 菌株构建与突变鉴定
为构建单基因和多基因编辑菌株，按照前期报道的方案将相应质粒转化至Y1H中。所有靶位点的PCR筛选使用对应引物：ADH2用ADH2 F/R，GPD1用GPD1 F/R，ALD4用ALD4 F/R。每个单靶点和多靶点各挑取10个菌落。PCR产物经纯化后作为Sanger测序模板。
【数据】筛选菌落数：每个靶点10个；引物：ADH2 F/R、GPD1 F/R、ALD4 F/R；测序方法：Sanger测序
2.4 分析方法
酵母摇瓶发酵样品在多个时间点采集。细胞生长通过分光光度计（UV-T6，Persee，中国）在600 nm波长下测定光密度（OD600）来监测。摇瓶配备空气锁，确保排除氧气但允许CO2释放。该装置在细胞消耗残余氧气的短暂初始阶段后，可为发酵主要阶段提供准厌氧条件。为定量代谢物浓度，上清液经0.22 μm滤膜过滤去除杂质后于−80°C保存。葡萄糖、甘油、乙酸和乙醇均使用高效液相色谱仪（HPLC；Waters Corp.，美国）配Aminex HP-87H色谱柱（Bio-Rad，CA，美国）和RID-2414示差折光检测器在55°C下检测定量。流动相为10 mM H2SO4，流速0.6 mL/min。生长曲线和发酵结果的所有数值均以平均值±标准差（SD）表示。采用SPSS 16.0软件进行方差分析（ANOVA），组间离散变量比较使用Tukey多重检验，p < 0.05认为具有统计学显著性。
【数据】检测波长：OD600；HPLC柱温：55°C；流动相：10 mM H2SO4；流速：0.6 mL/min；检测器：RID-2414示差折光检测器；统计学方法：ANOVA + Tukey多重检验；显著性水平：p < 0.05
研究结果
3.1 利用CRISPR/Cas9进行一步法多基因敲除
本研究通过一步转化实现单基因、双基因和三基因敲除。对于单基因敲除，每组转化随机挑取10个菌落，直接通过PCR和测序筛选。结果显示单基因敲除效率高达80%、100%和100%（图1b）。对于多基因敲除，基于10个菌落中所有靶位点的序列基因分型，工程效率在85%至95%之间（图2b）。在缺乏HR修复供体或使用空白sgRNA表达盒时，未检测到基因敲除（数据未显示）。这些结果证明了多gRNA表达盒策略在一步转化中实现多位点高效敲除的有效性。
【数据】单基因敲除效率：80%、100%、100%；多基因敲除效率：85%–95%；筛选菌落数：每组10个
3.2 ADH2/ALD4敲除提高乙醇产量
乙醇通过丙酮酸脱羧和ADH介导的乙醛还原为乙醇而合成。为确定ADH2和ALD4基因敲除突变株在乙醇发酵中的表现，在92小时内按特定时间间隔测定细胞生长和代谢物。如图3a所示，就细胞生长而言，单敲除突变株YS-1和YS-3以及双敲除突变株YS-6在有氧条件下对细胞生长无影响。代谢物分析显示，YS-1菌株在69小时内消耗39.954 g/L葡萄糖，产生17.706 g/L乙醇（图3b和d），而YS-3菌株消耗46.856 g/L葡萄糖并产生21.348 g/L乙醇，野生型Y1H消耗33.779 g/L葡萄糖并产生15.431 g/L乙醇。YS-6菌株消耗45.790 g/L葡萄糖，产生21.711 g/L乙醇。三个突变株YS-1、YS-3和YS-6的葡萄糖消耗速率分别比Y1H菌株提高1.18倍、1.39倍和1.36倍，乙醇生产强度分别提高14.76%、38.37%和40.74%（表1）。与前期报道一致，ADH2敲除菌株YS-1的乙醇产量显著提高。综合本研究结果，ALD4基因的敲除似乎促进了葡萄糖的同化利用，从而有助于乙醇生产强度的提高。
此外，本研究考察了ADH2和ALD4基因敲除对甘油和乙酸产量的影响（图3c和e）。发酵69小时后，三个突变株（YS-1、YS-3、YS-6）的甘油和乙酸产量分别比野生型菌株增加了10.22%和3.52%、11.78%和9.88%、21.66%和13.05%。甘油和乙酸产量的增加可解释为一种补偿机制——通过再生NAD+/NADH来维持氧化还原代谢中的氧化还原平衡。本研究还发现ALD4的敲除显著增加了乙酸产量。此前有研究提出Ald4p扮演乙醛泵的角色，直接增加NADH生成通量。该活性还可能通过Adh2p增加胞质中NAD+的还原通量。因此，ALD4在发酵过程中可能并非乙酸生成的关键角色，而可能参与维持氧化还原平衡。
【数据】YS-1：消耗39.954 g/L葡萄糖、产17.706 g/L乙醇；YS-3：消耗46.856 g/L葡萄糖、产21.348 g/L乙醇；Y1H：消耗33.779 g/L葡萄糖、产15.431 g/L乙醇；YS-6：消耗45.790 g/L葡萄糖、产21.711 g/L乙醇；葡萄糖消耗速率提升：1.18倍、1.39倍、1.36倍；乙醇生产强度提升：14.76%、38.37%、40.74%；甘油增加：10.22%、11.78%、21.66%；乙酸增加：3.52%、9.88%、13.05%；发酵时间：69h
3.3 GPD1敲除降低甘油和乙酸产量
为评估GPD1敲除对乙酸和甘油产量的影响，在发酵培养基中考察了菌株YS-2、YS-4和YS-5的生长及产物形成。与菌株Y1H相比，三个突变株表现出生长缓慢（图4a），原因如前期报道所述，是NADH和乙醛的积累所致。在图4c和e中，GPD1敲除突变株的甘油和乙酸产量显著低于野生型（YS-2为2.100 g/L甘油和0.419 g/L乙酸，YS-4为2.063 g/L甘油和0.416 g/L乙酸，YS-5为1.973 g/L甘油和0.391 g/L乙酸，而Y1H为3.218 g/L甘油和0.567 g/L乙酸）（表1）。三个突变株的甘油和乙醇产量也分别比野生型降低了34.74%和26.10%、35.89%和26.63%、38.69%和31.04%。在厌氧条件下，酿酒酵母中NADH的再氧化严格依赖于糖还原为甘油。乙酸生成的减少可能是细胞在GPD1被敲除、碳流向甘油被阻断时，为最小化NADH过剩而进行的氧化还原平衡调整。
接下来，本研究考察了GPD1敲除对菌株YS-2、YS-4和YS-6乙醇产量的影响。如图4b和d及表1所示，该敲除导致乙醇产量略有下降，原因是细胞生长受损和葡萄糖消耗速率降低。然而，乙醇得率分别提高了15.75%、15.97%和3.06%，达到0.529 g/g葡萄糖、0.530 g/g葡萄糖和0.471 g/g葡萄糖，而野生型菌株为0.457 g/g葡萄糖。
【数据】YS-2：2.100 g/L甘油、0.419 g/L乙酸；YS-4：2.063 g/L甘油、0.416 g/L乙酸；YS-5：1.973 g/L甘油、0.391 g/L乙酸；Y1H：3.218 g/L甘油、0.567 g/L乙酸；甘油降低：34.74%、35.89%、38.69%；乙醇降低：26.10%、26.63%、31.04%；乙醇得率：0.529、0.530、0.471 g/g葡萄糖；野生型得率：0.457 g/g葡萄糖；得率提升：15.75%、15.97%、3.06%
3.4 利用组合工程优化乙醇途径
在单突变和双突变分析之后，本研究分析了野生型和三突变菌株YS-7的发酵产物水平。与三个突变株YS-2、YS-4和YS-5类似，YS-7菌株在69小时后产生2.056 g/L甘油和0.420 g/L乙酸（图4c和e），分别比野生型菌株降低了36.11%和25.93%。另一方面，三突变菌株与Y1H相比乙醇产量无显著下降（图4d），且其乙醇浓度高于其他三个突变株（表1）。YS-7菌株的乙醇得率提高了22.54%，也高于野生型和其他三个突变株。有趣的是，多重敲除还表现出对乙醇水平的组合效应。例如，双突变株YS-6的乙醇产量高于单突变株YS-1（21.711 vs 17.706，P < 0.05），而三突变株YS-7的乙醇得率高于单突变株YS-2和YS-4（0.560 vs 0.529 vs 0.530，P < 0.05）。总之，本研究构建了七个突变菌株来优化乙醇途径，特别是双基因和三基因编辑菌株，以验证对高产乙醇生产强度/得率菌株的探索性分析，并确定适合进一步代谢工程改造以提高生物乙醇生产的组合基因组编辑。
【数据】YS-7：2.056 g/L甘油、0.420 g/L乙酸；甘油降低：36.11%；乙酸降低：25.93%；乙醇得率提升：22.54%；YS-6 vs YS-1乙醇产量：21.711 vs 17.706 g/L（P < 0.05）；YS-7 vs YS-2 vs YS-4乙醇得率：0.560 vs 0.529 vs 0.530 g/g葡萄糖（P < 0.05）
讨论与解读
本研究将CRISPR/Cas9多重基因组工程工具成功应用于乙醇代谢途径的组合优化。在双突变菌株YS-6（adh2::Δ123-129 ald4::Δ46-52）中，乙醇产量提高了40.63%；在三突变菌株YS-7（adh2::Δ123-129 gpd1::Δ49-56 ald4::Δ46-52）中，乙醇得率提高了22.54%。据作者所知，这是首次利用CRISPR/Cas9对酵母ALD4基因进行组合工程改造以提高乙醇产量。该策略的高效性——单基因敲除效率80%–100%、多基因敲除效率85%–95%——为酿酒酵母代谢通量的精细调控提供了有力工具。
编译者解读：该研究的核心价值在于将CRISPR/Cas9的多重编辑能力与代谢通路的组合优化策略相结合，以"探索性分析"替代传统的逐一改造试错，系统性地绘制了ADH2、GPD1、ALD4三基因扰动对乙醇生产的全谱效应。尤其值得关注的是ALD4基因的引入——传统乙醇代谢工程多聚焦于ADH2和GPD1，而本研究揭示ALD4敲除可通过促进葡萄糖同化间接提升乙醇生产强度，为乙醇菌株改良开辟了新靶点。不足之处在于摇瓶发酵条件与工业规模仍有差距，且组合编辑对氧化还原平衡的扰动机制尚待更深入的代谢流分析验证。
参考来源
Liu K. Using CRISPR/Cas9 for multiplex genome engineering to optimize the ethanol metabolic pathway in Saccharomyces cerevisiae. Biochemical Engineering Journal, 2019. DOI: 10.1016/j.bej.2019.02.017
DOI: 10.1016/j.bej.2019.02.017