来源：Unlocking the flavor potential of brewing yeast with CRISPR/Cas9 genome editing（LWT）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
香气是发酵酒精饮料品质的核心要素，而酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是产生这些香气活性代谢物的主力军。然而，针对增强果香和花香风味的代谢工程改造研究却相对有限。本研究将CRISPR/Cas9基因组编辑技术应用于啤酒酵母，通过失活编码精氨酸酶的CAR1基因，显著提升了异戊醇（热带水果香气）和苯乙醇（花香）的产量。有趣的是，CAR1基因失活与挥发性化合物合成之间的关联此前从未被报道。该发现揭示了一个连接氮代谢与挥发性风味生物合成的新型调控节点，为精准调控发酵食品风味开辟了新路径。
研究背景
酵母在烘焙和酒精发酵中扮演了数百年不可或缺的角色。传统的酵母工程改造依赖诱变剂和紫外线诱导的随机突变，耗时、昂贵且结果不稳定。1996年酿酒酵母基因组测序的完成彻底改变了酵母工程领域，使其转向遗传修饰以实现精准稳定的改造（Goffeau et al., 1996）。分子生物学和测序平台的进步使得对遗传密码的广泛操控成为可能，锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和CRISPR/Cas9等技术相继涌现。其中，CRISPR/Cas9因其简便性和高效率成为变革性工具——它源自细菌免疫系统，利用向导RNA靶向并切割特定DNA序列，产生双链断裂后由细胞机制（同源定向修复HDR或非同源末端连接NHEJ）进行修复。HDR可利用同源模板实现基因校正或整合，而NHEJ则引入随机插入或缺失使基因失活。尽管消费者对天然风味增强的需求日益增长，利用代谢工程手段改善果香和花香的探索仍相对不足，这为本研究提供了切入点。
研究方法
2.1 菌株、质粒与引物
大肠杆菌TOP10菌株（Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA）用作克隆宿主。质粒在大肠杆菌中于含50 μg/mL氨苄青霉素的Luria–Bertani（LB）琼脂平板上、37°C条件下增殖。目标菌株SNUws分离自韩国传统发酵食品。本研究所用菌株和引物分别汇总于表1和表2。
【数据】菌株：E. coli TOP10；抗生素：50 μg/mL氨苄青霉素；温度：37°C；培养基：LB琼脂
2.2 培养条件
酵母菌株在YPD培养基[10 g/L酵母提取物（BD Difco™, Franklin Lakes, USA）、20 g/L蛋白胨（BD Difco™）、20 g/L葡萄糖（Junsei Chemical, Japan）]中、30°C、220 rpm摇床培养。为调控发酵条件，在YPD培养基中添加不同浓度的葡萄糖。初始转化的感受态细胞通过在2% YPD培养基中培养至600 nm光密度（OD）为0.8后制备，然后使用Frozen EZ-Yeast Transformation Kit（Zymo Research, Irvine, CA, USA）进行转化。质粒转化后，转化子在 supplemented with 100 μg/mL G418（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）的YPD培养基中培养。向导RNA（gRNA）通过体外转录合成并转入同一培养基中。
【数据】培养基：YPD（10 g/L酵母提取物+20 g/L蛋白胨+20 g/L葡萄糖）；温度：30°C；转速：220 rpm；OD600：0.8；G418浓度：100 μg/mL
2.3 质粒构建、单向导RNA靶标设计与制备
使用大肠杆菌TOP10菌株作为克隆宿主来扩增质粒以产生靶基因。质粒p414–TEF1p–Cas9(KanMX)（引自Chin et al., 2021前期研究）源自亲本载体p414–TEF1p–Cas9–CYC1t（Addgene, #43802），含有编码G418抗生素抗性的KanMX基因。为构建gRNA，设计位于NGG序列上游的20核苷酸序列作为CAR1基因的互补序列，以确保与包含同源区的供体DNA成功进行同源重组。为运行CRISPR/Cas9复合体，需要单向导RNA（sgRNA）。sgRNA合成为包含启动子区段、与靶基因互补的间隔区段和支架区段的单链RNA。使用正向和反向引物构建sgRNA框架，然后通过重叠PCR生成T7启动子和gRNA支架。sgRNA被设计用于切割靶基因，形成Cas9复合体。PAM序列（5′-NGG-3′）必须位于靶基因的3′端。为有效失活靶基因，在靶DNA上游设计了20核苷酸的sgRNA间隔序列。sgRNA的DNA模板通过PCR扩增组装。主茎的DNA模板使用MEGAscript T7 Kit（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）按制造商方案进行转录。合成的RNA使用MEGAclear™试剂盒（Thermo Fisher Scientific）纯化以提高转化质量。sgRNA的纯度和质量使用NanoVue Plus分光光度计（GE Healthcare, Nordrhein-Westfalen, Germany）测量。纯化的sgRNA（1200 ng/μL）随后转化入表达Cas9活性的转化子中。
【数据】sgRNA长度：20 nt；PAM序列：5′-NGG-3′；sgRNA浓度：1200 ng/μL；试剂盒：MEGAscript T7 Kit、MEGAclear™ kit；仪器：NanoVue Plus Spectrophotometer
2.4 遗传转化与突变体验证
使用CRISPR/Cas9失活SNUws中的CAR1基因。利用Frozen-EZ-Yeast Transformation Kit，将野生型SNUws菌株转化为易于接受外源遗传物质（如Cas9质粒）的感受态细胞。质粒转化菌株通过在YPDG琼脂（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、100 μg/mL G418）上铺板筛选。作为额外验证步骤，使用RT-PCR确认G418抗性菌落中的Cas9表达。携带Cas9表达质粒（p414-TEF1p-Cas9-CYC1t）的菌落在添加G418的YPDG琼脂上筛选。从选定的酵母中提取总RNA，使用oligo-dT引物进行cDNA合成，随后使用特异性引物（F_Cas9 expression和R_Cas9 expression）进行RT-PCR。在YPDG琼脂平板上生长的菌落通过菌落PCR检测。鉴于酿酒酵母主要通过HDR修复DNA断裂，进行菌落PCR以验证是否存在预期的HDR介导的缺失基因型。为分离具有预期CAR1缺失的HDR系统菌落，收集菌落，在20 mM NaCl溶液中裂解，离心收集裂解上清液。使用AccuPower Taq PCR Master Mix（Bioneer Co., Daejeon, Republic of Korea）按制造商说明以上清液中的DNA为模板进行PCR扩增。F_CAR1_2034bp和R_CAR1_2034bp引物可扩增野生型菌株基因组中存在的2034 bp片段和ΔCAR1基因组中存在的1032 bp片段。通过凝胶电泳根据片段大小差异评估基因缺失情况。为选择性分离CAR1破坏突变体，使用基于Kitamoto et al.（1993）报道方案开发的菌株特异性培养基，在该培养基中精氨酸酶缺陷突变体可在含鸟氨酸的培养基上生长，但不能在含精氨酸的培养基上生长。为进一步区分无义突变体（Gln26stop）与野生型菌株，使用CAO选择性培养基[1.7 g/L酵母氮碱（无氮）、150 mg/L刀豆氨酸、5 mM鸟氨酸、1 mM精氨酸、20 g/L葡萄糖]，该培养基可选择性地促进精氨酸酶缺陷突变体的生长，同时抑制野生型菌株或不完全突变体的生长（Kitamoto et al., 1993; Kuribayashi et al., 2013）。最佳刀豆氨酸浓度（150 mg/L）使用ΔCAR1菌株确定。鉴于Gln26stop突变引入了限制酶MseI识别的TTAA限制性位点，相应突变体可通过电泳出现两条带进行区分。因此，在CAO选择中存活的菌落随后通过菌落PCR和MseI酶切消化进行筛选。由此选出的菌落进一步通过PCR扩增子的Sanger测序验证，以确认预期点突变的存在。
【数据】裂解液：20 mM NaCl；PCR预混液：AccuPower Taq PCR Master Mix；野生型片段：2034 bp；ΔCAR1片段：1032 bp；CAO培养基组分：1.7 g/L YNB（无氮）、150 mg/L刀豆氨酸、5 mM鸟氨酸、1 mM精氨酸、20 g/L葡萄糖；限制酶：MseI（识别TTAA位点）
2.5 生长参数测定
为评估发酵性能，将野生型、ΔCAR1和Gln26stop菌株在含100 g/L葡萄糖的YPD培养基中培养，每8小时间隔采集样品。发酵过程中，使用UV-160分光光度计（Shimadzu, Kyoto, Japan）在600 nm处监测光密度以跟踪细胞生长，所得值使用预定转换系数0.30换算为干细胞重量（DCW）。培养上清液中的葡萄糖和乙醇浓度使用高效液相色谱（HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）定量。
【数据】葡萄糖浓度：100 g/L；采样间隔：8 h；OD600监测仪器：UV-160分光光度计；DCW转换系数：0.30；定量方法：HPLC
2.6 使用GC–MS鉴定风味产物
进行GC–MS分析时，将各种酿酒酵母SNUws、KCCM 51299和SNUit菌株在YPD（10% D-葡萄糖）培养基中、100 rpm、30°C条件下培养。样品每8小时间隔三次重复采集，最大转速离心10分钟，通过0.2 μm孔径注射器过滤器过滤，在−70°C下储存，随后进行GC–MS风味分析。为建立标准曲线，将异戊醇和苯乙醇（Sigma-Aldrich）用10%乙醇稀释至0.5–500 mg/L（ppm）以匹配标准浓度。GC–MS分析中，使用固相微萃取（SPME）Arrow从20 mL顶空螺口瓶（Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA）中的500 μL样品中提取挥发性化合物。该装置使用1.10 mm SPME Arrow（DVB/PDMS：二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷，紫色），旨在实现对不同沸点挥发性化合物的良好分离。分析物使用Thermo Scientific™ TriPlus RSH™自动进样器处理，SPME Arrow方法包括以下步骤：30°C、500 rpm下样品平衡15分钟，30°C下分析物提取30分钟……
【数据】培养基：YPD（10% D-葡萄糖）；转速：100 rpm；温度：30°C；采样间隔：8 h；离心：最大转速10 min；滤膜：0.2 μm；储存温度：−70°C；标准品浓度范围：0.5–500 mg/L；SPME Arrow规格：1.10 mm DVB/PDMS；平衡条件：30°C、500 rpm、15 min；提取条件：30°C、30 min
研究结果
3.1 酿酒酵母KCCM 51299 ΔCAR1和Gln26stop突变体风味分析
在分析了常用于韩国米酒生产的野生型酿酒酵母KCCM 51299菌株及其CRISPR/Cas9衍生突变菌株的全基因组序列后（Hwang et al., 2020），我们发现野生型与突变菌株之间的风味特征存在一致性差异。这促使我们使用SPME Arrow偶联GC–MS分析对其挥发性化合物组成进行全面表征。酿酒酵母KCCM 51299的ΔCAR1和Gln26stop突变体均携带CAR1失活突变，因此缺乏精氨酸酶活性。然而，风味化合物的表型差异表明，除预期靶标外，还存在更广泛的代谢扰动。值得注意的是，所有菌株的乙醇产量相似（图1）；但香气组成发生了显著变化。在两种突变体中，异戊醇（热带风味）和苯乙醇（玫瑰风味）的产量均持续高于野生型。相反，中链脂肪酸（包括己酸、辛酸和癸酸）及其相应的乙酯（己酸乙酯、癸酸乙酯和十六烷酸乙酯）显著减少，表明脂质来源的风味途径受到干扰。有趣的是，两种突变体中乙酸己酯的水平也有所下降。由于酵母很少从支链氨基酸（如亮氨酸或异亮氨酸）生成乙酸己酯的直接前体己醇，这种减少可能反映了上游扰动。一个合理的途径是己酸氧化为己醛，随后还原为己醇，再经乙酰辅酶A乙酰化。这表明CAR1失活间接影响了脂肪酸代谢和酯类生物合成。据我们所知，此前尚无研究报道CAR1与这些挥发性化合物生物合成之间的关联。尽管这些发现可能具有菌株特异性，但它们为靶向基因编辑如何影响酵母中更广泛的代谢和风味相关途径提供了宝贵见解。为更准确地评估基于GC–MS相对比较的初步发现，我们在不同菌株背景下额外构建了ΔCAR1和Gln26stop突变体，以精确定量异戊醇和苯乙醇水平，并确定观察到的增加是菌株特异性现象还是酿酒酵母菌株间的普遍代谢反应。
【数据】乙醇产量：所有菌株相似；异戊醇/苯乙醇：突变体中持续上调；中链脂肪酸（己酸、辛酸、癸酸）及乙酯：显著减少；乙酸己酯：两种突变体中均下降
3.2 CRISPR/Cas9编辑的Cas9转录评估与菌落筛选
在进行基因组编辑之前，我们首先进行RT-PCR以验证携带Cas9编码质粒（p414-TEF1p-Cas9-CYC1t）的酵母菌株中Cas9的表达，从而确认其适用于下游CRISPR/Cas9应用。为实现精准基因组编辑，将表达Cas9的感受态细胞与高纯度gRNA和设计用于靶位点同源重组的修复模板共转化。仅转化Cas9和gRNA的菌落预期存活率极低，因为NHEJ易出错；而存在修复DNA模板时，预期通过HDR显著增加菌落形成。然而，ΔCAR1菌落的存活率略高于无修复模板的阳性对照，表明Cas9活性并非最优。相比之下，转化了Gln26stop突变修复模板的菌落表现出高存活率，这可能归因于其与靶位点的同源性。这些结果强调了菌株特异性因素和位点特异性异质性（尤其在野生来源菌株如酿酒酵母SNUws中）对编辑效率的影响。存活的菌落包含未编辑、NHEJ修复和HDR修复细胞的混合物，这凸显了优化gRNA设计和Cas9活性对实现可靠基因组编辑结果的重要性。
【数据】ΔCAR1菌落存活率：略高于无修复模板阳性对照；Gln26stop菌落存活率：高
3.3 CRISPR/Cas9编辑的CAR1突变体筛选与鉴定
使用靶向CAR1基因的PCR筛选推定转化子。ΔCAR1突变体产生约1 kb的扩增子，而野生型菌落产生约2 kb的产物，分别反映基因的缺失或存在（图2A）。对于某些菌落，我们同时观察到1 kb和2 kb条带，表明存在混合基因型。为解决此问题，对菌落进行传代培养并重新分析，从而确认所选ΔCAR1菌株中CAR1的完全缺失。对于Gln26stop突变体，单独进行电泳无法区分突变体，因为其PCR产物大小与野生型相似。因此，为便于筛选，我们使用含150 mg/L刀豆氨酸的CAO培养基，该培养基可促进精氨酸酶缺陷突变体的生长，同时抑制野生型和不完全突变体的生长（图2B）。存活的菌落被视为候选菌落并进行进一步验证。为确认Gln26stop突变，对PCR扩增产物进行MseI酶切消化。引入的突变创建了TTAA识别位点，因此MseI消化在突变体中产生两个片段（75 bp和40 bp），而野生型保留单一的115 bp产物（图2C和D）。
【数据】ΔCAR1扩增子：约1 kb；野生型扩增子：约2 kb；刀豆氨酸浓度：150 mg/L；MseI消化产物：突变体75 bp+40 bp，野生型115 bp
3.4 CRISPR/Cas9编辑菌株的测序验证
为确认成功的基因组编辑，我们对ΔCAR1和Gln26stop菌株的CAR1位点进行了测序。对于ΔCAR1突变体，测序显示约1000 bp的缺失，从而确认了CAR1完整编码区的去除以及上下游序列的精确连接。值得注意的是，我们未检测到非预期的序列改变，表明CRISPR/Cas9系统在无脱靶效应的情况下特异性靶向了指定位点。对于Gln26stop菌株，测序验证了CAR1近5′端存在CAGG到TAA的替换，引入了早期终止密码子。与野生型基因组相比，这4 bp的修饰是唯一的序列差异，从而证实了点突变编辑的准确性和效率。
【数据】ΔCAR1缺失大小：约1000 bp；Gln26stop突变：CAGG→TAA（4 bp替换）；脱靶效应：未检测到
3.5 野生型与CRISPR/Cas9编辑菌株的发酵性能
为评估发酵性能，我们比较了三种评估的酿酒酵母菌株（SNUws、KCCM 51299和SNUit）的野生型与ΔCAR1和Gln26stop突变体的生长和乙醇产量。生长随时间的推移进行监测并以DCW表示，而乙醇浓度使用HPLC定量。在SNUws菌株中，Gln26stop突变体的生长速率略高于野生型或ΔCAR1菌株，但差异很小（图3A）。相比之下，在KCCM 51299和SNUit菌株中，野生型与CRISPR编辑突变体之间未检测到显著生长差异（图3B和C）。在乙醇产量方面，SNUws的ΔCAR1突变体与相应野生型和Gln26stop突变体相比，发酵产量略有升高，但未达到显著水平（图3A）。在KCCM 51299和SNUit菌株背景下也观察到类似趋势，CAR1破坏对乙醇生产力无显著影响（图3B和C）。这些发现表明，无论菌株背景如何，CRISPR/Cas9介导的CAR1失活对突变菌株的发酵能力和生长表型仅有极小影响。
【数据】SNUws Gln26stop生长速率：略高于野生型和ΔCAR1；KCCM 51299和SNUit生长差异：不显著；SNUws ΔCAR1乙醇产量：略有升高但不显著；CAR1破坏对乙醇生产力影响：不显著
3.6 风味化合物GC–MS分析：异戊醇和苯乙醇
GC–MS分析表明，CAR1失活在所有测试的酿酒酵母菌株中一致性地增加了异戊醇和苯乙醇的产量，尽管显著性程度因菌株和化合物而异。野生型酿酒酵母SNUws产生243.04 mg/L异戊醇……
【数据】野生型SNUws异戊醇产量：243.04 mg/L（原文节选未完整呈现其余数值，具体各菌株数据以原文完整版为准）
讨论与解读
本研究由假说驱动而非确定性预期，鉴于探索CAR1与酵母风味特征关系的研究有限，最初期望值并不高。然而，两种靶向CAR1基因但通过不同策略（ΔCAR1和Gln26stop突变体）修饰的酵母菌株在风味代谢组中表现出的一致性差异，为进一步研究CAR1在风味调控中的潜在作用提供了有力证据。我们也考虑了菌株特异性效应的可能性——观察到的结果可能局限于某些酵母背景。为解决这一问题，我们纳入了额外的基因修饰啤酒酵母菌株，发现结果在不同背景下相当一致，表明啤酒酵母的基因修饰可以增强菌株特异性风味特征。值得注意的是，尽管某些风味化合物在修饰菌株中得到增强，但一些理想风味有所减弱，表明本研究开发的菌株可能不适合商业化酒精生产。然而，通过优化底物或微调发酵条件，风味特征可朝预期方向引导。重要的是，这些菌株中精氨酸酶的失活还减少了氨基甲酸乙酯（EC，一种毒性化合物）的产生，凸显了多效性益处。这些发现对开发安全和定制的酵母菌株具有重要潜力。
编译者解读
从合成生物学应用角度看，本研究巧妙地将CRISPR/Cas9精准编辑工具引入传统发酵菌株改良，选择CAR1这一氮代谢关键基因作为靶点，意外发现了氮代谢与挥发性风味生物合成之间的新型调控节点。方法上采用完全缺失与提前终止密码子插入两种策略互为验证，增强了结论的可靠性；跨菌株验证的设计也很好地回应了菌株特异性的质疑。不过，原文也坦承精确的代谢机制尚不清楚——精氨酸酶失活如何导致异戊醇和苯乙醇积累，值得通过代谢流分析和转录组学进一步深挖。此外，部分理想风味化合物的减少提示多基因协同改造或许是未来商业化应用的方向。
参考来源
期刊：LWT, 2025
DOI: 10.1016/j.lwt.2025.118254
DOI: 10.1016/j.lwt.2025.118254