来源：Multi-gene metabolic engineering of Pichia pastoris to synthesize ectoine（Journal of Bioscience and Bioengineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
四氢嘧啶（ectoine）作为一种优良的渗透压保护剂，近年来在化妆品、食品和制药行业应用广泛。本研究首次将巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）开发为四氢嘧啶合成宿主，从盐杆菌中筛选出产四氢嘧啶菌株，克隆其 ectABC 基因簇，并通过多基因代谢工程策略（aspC、aK、asD 单独及组合过表达）系统优化前体供给，最终工程菌株 GS115/pGAPZ A-ectABC-aspC-aK-asD 实现 10.88 g/L 四氢嘧啶产量，证明毕赤酵母是四氢嘧啶生物合成的有效宿主。
研究背景
四氢嘧啶是微生物在高渗环境下积累的渗透压补偿溶质，具有细胞保护功能。其生物合成途径涉及 ectABC 基因簇编码的三步酶促反应。此前研究已在 Escherichia coli、Corynebacterium glutamicum 和 Hansenula polymorpha 中实现了四氢嘧啶的异源生产，但具有高密度发酵优势的毕赤酵母尚未被开发为四氢嘧啶合成宿主。本研究旨在填补这一空白，通过多基因代谢工程手段，在毕赤酵母中构建四氢嘧啶合成途径，并强化前体 L-天冬氨酸-β-半醛的供给。
研究方法
菌株、质粒与培养条件
本研究所用菌株、质粒及引物列于原文表 2 和表 S1。毕赤酵母 GS115 及质粒 pGAPZ A 和 pPICZ A 购自 Invitrogen（Carlsbad, CA, USA）。E. coli 在 LB 培养基（5 g/L 酵母提取物、10 g/L 胰蛋白胨、10 g/L NaCl）中、37°C、220 rpm 振荡培养。毕赤酵母种子培养采用 YPD 培养基（1 g/L 酵母提取物、2 g/L 蛋白胨、2 g/L 葡萄糖）。四氢嘧啶生产时，PGAP 驱动的毕赤酵母在 50 mL BMGY 培养基（10 g/L 甘油、10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨、13.4 g/L YNB、100 mM K₃PO₄ 缓冲液、5 g/L (NH₄)₂SO₄、400 μg/L 生物素，pH 6.0）中培养。甘油耗尽后，每 24 h 补加 1 mL 50% 甘油溶液。PAOX 驱动的毕赤酵母先在 50 mL BMGY 培养基中培养 2 d，随后转入 50 mL BMMY 培养基（10 g/L 甲醇、10 g/L 酵母提取物、13.4 g/L YNB、20 g/L 蛋白胨、5 g/L (NH₄)₂SO₄、400 μg 生物素、100 mmol K₃PO₄ 缓冲液，pH 6.0）。诱导阶段每 24 h 补加 1% 甲醇。毕赤酵母所有培养均在 30°C、220 rpm 条件下进行。嗜盐菌株在含 5 g/L 酵母提取物、10 g/L 胰蛋白胨及不同浓度 NaCl 的选择培养基中筛选，按筛选方案于 37°C 培养。
【数据】培养基：LB/YPD/BMGY/BMMY；温度：37°C（E. coli）/30°C（P. pastoris）；转速：220 rpm；甘油补加：1 mL 50% 甘油/24h；甲醇补加：1%/24h；pH：6.0
产四氢嘧啶嗜盐菌株的筛选与鉴定
嗜盐菌株的富集培养与分离步骤如下：（i）取自中国浙江省宁波盐湖的样品先在含 150 g/L NaCl 的筛选培养基中培养 3–5 d。（ii）培养液用无菌盐水（15%，w/v）进行 10 倍梯度稀释，稀释范围 1:10 至 1:10,000。每个稀释度取 100 μL 涂布于筛选琼脂平板，37°C 培养 7 d。（iii）选取形态特征、色素水平或菌落大小不同的菌落，每个分离株进行连续划线培养以确保克隆纯度。（iv）嗜盐分离株在含 150 g/L NaCl 的筛选培养基中培养 72 h。每 12 h 取样，培养液上清通过离心（8000 rpm，10 min）获得，用于分析四氢嘧啶含量。（v）耐受 15%（w/v）NaCl 的产四氢嘧啶菌株进一步分别在含 20% 和 25%（w/v）NaCl 的筛选培养基中培养，评估其对更高 NaCl 浓度的抗性。产四氢嘧啶菌株通过 16S rDNA 序列分析进行鉴定。
【数据】NaCl 浓度：150 g/L（初筛）、15%/20%/25%（w/v）（耐受性评估）；培养时间：3–5 d（富集）、7 d（平板）、72 h（液体）；离心：8000 rpm，10 min；稀释范围：1:10–1:10,000
HZS01 中四氢嘧啶合成酶基因簇的克隆与测序
基于与产四氢嘧啶分离株 HZS01 同种物种的 ectB 保守序列，设计多对引物，使用 Hieff（Takara, China）进行 PCR 扩增。PCR 产物纯化后送金唯智公司测序。测序得到的 ectB 片段再次提交 NCBI 进行 BLAST，然后以测序比对中同源性最高的已知菌株基因组序列为模板，设计 ectA、ectC 和 ectABC 基因簇的引物。通过 PCR 扩增获得产四氢嘧啶分离株 HZS01 的 ectABC 基因簇序列。为提高 ectABC 在毕赤酵母 GS115 中的转录效率，根据毕赤酵母 GS115 的密码子使用频率对序列进行了优化。
【数据】PCR 酶：Hieff（Takara）；测序公司：金唯智；优化方式：密码子使用频率优化
毕赤酵母 GS115 的多基因代谢工程
使用 ClonExpress II 一步克隆试剂盒（Vazyme, Suzhou, China），将 ectABC 克隆并插入 pPICZ A 的 PAOX 下游，构建 pPICZ A-ectABC。同样，ectABC 插入 PGAP 下游，构建 pGAPZ A-ectABC。随后，pPICZ A-ectABC 和 pGAPZ A-ectABC 均转化至 E. coli JM109，方法参照先前文献。正确转化子通过 PCR 和基因测序确认。pGAPZ A-ectABC 用 AvrII 快速消化酶酶切，pPICZ A-ectABC 用 SacI 快速消化酶酶切。质粒用 DNA 产物纯化试剂盒（Vazyme）纯化获得线性化质粒，然后电转化至毕赤酵母 GS115。电转化后，从含 100 μg/mL 博来霉素的 YPD 平板上挑选单菌落。正确重组菌株通过 PCR、DNA 电泳和基因测序确认。最终获得 GS115/pPICZ A-ectABC（HZS01）和 GS115/pGAPZ A-ectABC（HZS02）。
为进一步提高四氢嘧啶产量，在 GS115/pGAPZ A-ectABC 中单独或组合过表达前体相关酶（AspC、AK 和 AsD）。首先，三个基因分别表达如下：用引物 aspC-ect-F 和 aspC-ect-R 扩增毕赤酵母 GS115 基因组 DNA。用引物 pGAPZ A-ect-aspC-F 和 pGAPZ A-ect-aspC-R 线性化重组质粒 pGAPZ A-ectABC，使插入基因与线性化质粒具有 15–20 bp 同源末端。随后，使用 ClonExpress II 一步克隆试剂盒（Vazyme），将 aspC 插入 pGAPZ A-ectABC 的 ectABC 下游，构建 pGAPZ A-ectABC-aspC。质粒转化至 E. coli JM109 感受态细胞及质粒电转化至毕赤酵母 GS115 的步骤与前述方法相同。最终获得 GS115/pGAPZ A-ectABC-aspC（HZS021）。同样，获得 GS115/pGAPZ A-ectABC-aK（HZS022）和 GS115/pGAPZ A-ectABC-asD（HZS023）。
其次，在 GS115/pGAPZ A-ectABC 中双基因共表达如下：以同样方式，将 aspC-asD、aK-asD 和 aspC-aK 分别插入 pGAPZ A-ectABC 的 ectABC 下游，构建 pGAPZ A-ectABC-aspC-asD、pGAPZ A-ectABC-aK-asD 和 pGAPZ A-ectABC-aspC-aK。所有质粒转化至毕赤酵母，分别获得 GS115/pGAPZ A-ectABC-aspC-asD（HZS024）、GS115/pGAPZ A-ectABC-aK-asD（HZS025）和 GS115/pGAPZ A-ectABC-aspC-aK（HZS026）。
最后，三个基因在 GS115/pGAPZ A-ectABC 中共同过表达，构建 pGAPZ A-ectABC-aspC-aK-aspD（HZS07）。本研究所用引物序列列于表 S1。
【数据】克隆试剂盒：ClonExpress II（Vazyme）；同源臂：15–20 bp；筛选抗生素：博来霉素 100 μg/mL；酶切酶：AvrII/SacI 快速消化酶；电转化宿主：毕赤酵母 GS115
分析方法
使用紫外分光光度计（UV-1800，Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan）按前述方法测定培养液在 600 nm 处的光密度（OD600）。干细胞重（DCW）按已报道方法测定。培养液中四氢嘧啶的提取参照前述方法并稍作修改：培养液以 12,000 rpm 离心 3 min，上清经 0.22 μm 微孔滤膜过滤。滤液中四氢嘧啶含量（g/L）按 Hu 等报道的方法测定。比产量（g/g DCW）根据四氢嘧啶含量和 DCW 计算。结果为三次独立测定的平均值，标准差在平均值的 ±10% 范围内。组间差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计显著性比较，P 值 < 0.05 视为显著。
【数据】OD600 测定：UV-1800 分光光度计；离心：12,000 rpm，3 min；滤膜：0.22 μm；统计方法：one-way ANOVA，P < 0.05 显著
研究结果
产四氢嘧啶嗜盐菌株的筛选
从高 NaCl 湖水中，在含 15% NaCl 的培养基中筛选出潜在的四氢嘧啶合成菌株。通过 16S-rDNA 测序，获得 5 株不同菌株：Halobacillus trueperi HZS/A、Halobacillus faecis HZS/B、Halobacillus sp. HZS/C、Staphylococcus saprophyticus HZS/D 和 Chromohalobacter salexigens HZS/E。其中，仅 C. salexigens HZS/E 能在 20%（w/v）NaCl 条件下生长，且所有菌株均不能在含 25%（w/v）NaCl 的筛选培养基上生长。
比较了 5 株菌的生长速率和四氢嘧啶产量。如图 2A 所示，C. salexigens HZS/E 在含 15%（w/v）NaCl 的培养基中生长曲线最高，60 h 时 OD600 最大值达 18.93。与 C. salexigens HZS/E 相比，其余 4 株菌生长速率相对较慢。当 NaCl 浓度从 15% 升至 20% 时，C. salexigens HZS/E 的生长速率显著受抑（p < 0.05），表明高盐度导致生长抑制。
就四氢嘧啶产量而言（图 2B），C. salexigens HZS/E 同样最高。在 20% 和 15% NaCl 浓度下，四氢嘧啶峰值分别为 46.96 mg/L 和 39.56 mg/L，表明 NaCl 浓度与四氢嘧啶水平密切相关，与先前报道一致。其他菌株中，H. trueperi HZS/A 和 H. faecis HZS/B 分别产生 27.50 mg/L 和 23.49 mg/L 四氢嘧啶，而 Halobacillus sp. HZS/C 和 S. saprophyticus HZS/D 在 15% NaCl 条件下未积累四氢嘧啶，提示可能存在其他耐盐机制。
【数据】OD600 最大值：18.93（60 h，15% NaCl）；四氢嘧啶峰值：46.96 mg/L（20% NaCl）、39.56 mg/L（15% NaCl）；HZS/A：27.50 mg/L；HZS/B：23.49 mg/L
ectABC 在毕赤酵母 GS115 中的表达及四氢嘧啶产量
鉴于 C. salexigens HZS/E 具有最佳四氢嘧啶生产能力，克隆并测序了其负责四氢嘧啶合成的 ectABC 基因。C. salexigens HZS/E 与 C. salexigens DSM3043 的 ectABC 序列同源性为 98.74%，存在 30 个碱基对差异。通过蛋白序列比较分析，存在两个氨基酸差异（EctA 中 P129S；EctB 中 A64T），这两个突变对酶活性的影响需进一步研究。
随后，为在毕赤酵母中过表达修饰后的 ectABC，采用 PAOX 和 PGAP 两种常用启动子，并比较其性能。将 pPICZ A-ectABC 导入毕赤酵母 GS115，构建 PAOX 型毕赤酵母 GS115/pPICZ A-ectABC（HZS01）。将 pGAPZ A-ectABC 转化至毕赤酵母 GS115，构建 PGAP 型毕赤酵母 GS115/pGAPZ A-ectABC（HZS02）。
GS115、HZS01 和 HZS02 的生长曲线和四氢嘧啶生产能力比较见图 3。如图 3A 所示，与毕赤酵母 GS115 相比，诱导型 HZS01 生长曲线略低（p < 0.01），原因是甲醇的利用速率慢于甘油。因此，HZS01 在 96 h 时的最大 OD600 仅为 GS115 的 85.50%。相比之下，组成型 HZS02 与 GS115 的生长曲线和生物量几乎无差异（p < 0.01），归因于整个培养周期使用相同的碳源（甘油）。
就四氢嘧啶生产能力而言，对 HZS01 和 HZS02 进行了比较。如图 3B 所示，PAOX 型 HZS01 在 96 h 后合成四氢嘧啶峰值为 7.13 g/L，而 PGAP 型 HZS02 积累的最高四氢嘧啶含量为 8.03 g/L，比 HZS01 高 12.62%。然而，两株菌在收获期的比产量均为 0.18 g/g，表明其体积产量的差异完全源于 96 h 时的生物量差异。
据我们所知，多种异源宿主（包括 E. coli 和 C. glutamicum）已被用于合成四氢嘧啶，而毕赤酵母的适用性此前未被研究。考虑到毕赤酵母的多重优势，本研究评估了其潜力，并报道表达 ectABC 积累的四氢嘧啶高于嗜盐分离株。HZS02 的更好生产表现表明，基于 PGAP 的毕赤酵母 GS115 更适合四氢嘧啶合成，因其生长显著（p < 0.05）。
【数据】ectABC 同源性：98.74%（30 bp 差异）；氨基酸差异：2 个（P129S in EctA；A64T in EctB）；HZS01 产量：7.13 g/L（96 h）；HZS02 产量：8.03 g/L（96 h）；HZS02 比 HZS01 高：12.62%；比产量：均为 0.18 g/g；HZS01 最大 OD600：GS115 的 85.50%
AspC、AK 和 AsD 共表达对 HZS02 四氢嘧啶产量的影响
由于 aspC（Gene ID: 8197922）、aK（Gene ID: 8201060）和 asD（Gene ID: 8199599）负责天冬氨酸-β-半醛（四氢嘧啶的关键前体）的合成，以 pGAPZ A-ectABC 为载体，通过单独和组合表达这些基因对 HZS02 进行进一步优化。
首先，将三个基因分别导入 pGAPZ A-ectABC，构建 pGAPZ A-ectABC-aspC、pGAPZ A-ectABC-aK 和 pGAPZ A-ectABC-asD。转化至 GS115 后，构建了 3 株重组菌株：GS115/pGAPZ A-ectABC-aspC（HZS021）、GS115/pGAPZ A-ectABC-aK（HZS022）和 GS115/pGAPZ A-ectABC-asD（HZS023）。
如图 4B 所示，aspC、aK 或 asD 的过表达均促进了四氢嘧啶产量。HZS021、HZS022 和 HZS023 在 96 h 后分别达到 9.19 g/L、9.42 g/L 和 9.53 g/L，分别比 HZS02（96 h 时 8.03 g/L）提高 14.69%、17.23% 和 18.64%。其四氢嘧啶比产量在 96 h 时分别为 0.21 g/g、0.22 g/g 和 0.23 g/g，均高于 HZS02（0.18 g/g）。比产量的增加表明产量的提升源于毕赤酵母细胞四氢嘧啶合成能力的增强。
单基因对四氢嘧啶合成的促进作用与先前报道一致。与 E. coli MG1655ΔcrrΔiclRΔthrA/pFT28-ectABC 相比，E. coli MG1655ΔcrrΔiclRΔthrA/pFT28-ectABC-aK 产生的四氢嘧啶水平高 24.53%。额外过表达 asD 进一步使四氢嘧啶水平提高 8.39%。在另一项研究中，与 E. coli W3110ΔthrA/pTrc-ectABC 相比，E. coli W3110ΔthrA/pTrc-ectABC/pSTV-aK 产生的四氢嘧啶高 9.80%。此外，aspC 的过表达也能提高四氢嘧啶产量，其在 C. glutamicum LYS-4/pXtuf-HEectABC 中的过表达使四氢嘧啶增加 19.70%。这些报道支持 aK、asD 和 aspC 在四氢嘧啶合成中发挥积极作用。
【数据】HZS021 产量：9.19 g/L（+14.69%）；HZS022 产量：9.42 g/L（+17.23%）；HZS023 产量：9.53 g/L（+18.64%）；比产量：0.21/0.22/0.23 g/g；对照 E. coli 提升：24.53%（aK）、8.39%（asD）、9.80%（aK）、19.70%（aspC）
接下来，进行 aspC、aK 和 asD 中两个基因的组合表达。构建了重组菌株 GS115/pGAPZ A-ectABC-aspC-asD（HZS024）、GS115/pGAPZ A-ectABC-aK-asD（HZS025）和 GS115/pGAPZ A-ectABC-aspC-aK（HZS026）。
如图 5B 所示，与 HZS02（96 h 时 8.03 g/L）相比，HZS024、HZS025 和 HZS026 在 96 h 后分别产生 8.38 g/L、8.27 g/L 和 8.23 g/L 的四氢嘧啶，分别提高 4.38%、2.95% 和 2.81%。其四氢嘧啶比产量分别为 0.20、0.19 和 0.21 g/g，均高于 HZS02，表明其合成四氢嘧啶的能力增强。然而，其比产量低于 HZS021、HZS022 和 HZS023（p < 0.05）。
其他研究报道，在 E. coli BL21(DE3)/pRSF-ectABC 中共过表达 aK 和 asD，在 C. glutamicum K02Δpck/pXMJ19-ectBAC 中组合表达突变 aK 和 asD，以及其他涉及 AsA 合成关键酶的协同表达，均促进了四氢嘧啶合成。在本研究中，HZS024、HZS025 和 HZS026 也表现出高于 HZS02 的四氢嘧啶产量（p < 0.01），与这些文献一致。另一方面，HZS024、HZS025 和 HZS026 的生产力低于 HZS021、HZS022 和 HZS023（p < 0.05）。本研究中，虽然双基因表达提高了四氢嘧啶产量，但效果不如三基因单独表达。这些发现表明，这些基因对提高四氢嘧啶产量可能具有综合重要性。
【数据】HZS024 产量：8.38 g/L（+4.38%）；HZS025 产量：8.27 g/L（+2.95%）；HZS026 产量：8.23 g/L（+2.81%）；比产量：0.20/0.19/0.21 g/g；双基因表达比产量低于单基因表达（p < 0.05）
在后续实验中，进行了 aspC、aK 和 asD 的同时表达。将 aspC、aK 和 aspD 全部连接到 pGAPZ A-ectABC 上。所得质粒转化后，最终获得 GS115/pGAPZ A-ectABC-aspC-aK-asD（HZS07），其四氢嘧啶产量最高，达 10.88 g/L，比产量为 0.25 g/g DCW。
【数据】HZS07 产量：10.88 g/L；比产量：0.25 g/g DCW
讨论与解读
本研究鉴定出一株产四氢嘧啶的嗜盐分离株 C. salexigens HZS/E，确定了其负责四氢嘧啶合成酶的 ectABC 基因簇，并在毕赤酵母中过表达。GS115/pGAPZ A-ectABC 积累 8.03 g/L 四氢嘧啶。为进一步提高生产力，还表达了参与 AsA 合成的三个关键酶。GS115/pGAPZ A-ectABC-aspC-aK-asD 产生的四氢嘧啶水平最高，达 10.88 g/L，比产量为 0.25 g/g DCW。
编译者解读
本研究首次将毕赤酵母作为四氢嘧啶合成宿主，展示了"天然菌株筛选—基因簇克隆—多基因代谢工程"的完整技术路线。选用组成型 PGAP 启动子优于甲醇诱导型 PAOX，规避了甲醇的安全与成本问题，利于工业化放大。单基因过表达（HZS021–023）比双基因组合（HZS024–026）效果更好，提示代谢通量分配并非简单叠加，前体供给与四氢嘧啶合成之间的平衡值得进一步优化。10.88 g/L 的产量在异源四氢嘧啶生产中具有竞争力，但距 C. salexigens 天然菌株 46.96 mg/mL 的积累仍有差距，后续可探索发酵工艺优化与途径酶定向进化。
参考来源
Zhang S. Multi-gene metabolic engineering of Pichia pastoris to synthesize ectoine. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2025. DOI: 10.1016/j.jbiosc.2025.02.006
DOI: 10.1016/j.jbiosc.2025.02.006