来源：Agarase-based bacterial biosensor for detection of cadmium in environmental samples（Biosensors and Bioelectronics: X）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
镉污染威胁生态与健康，现有检测手段成本高、操作复杂。本研究将铜绿假单胞菌的镉响应启动子P_cadR与新型报告基因β-琼脂酶（dagA）融合，构建了比色型光学全细胞生物传感器（CBOWCB）。工程菌株BC15对CdCl₂的线性检测范围达10 ppb至500 ppm（跨越五个数量级，R²=0.9851），与ICP-MS联用验证结果高度一致（R²=0.967）。该平台以廉价琼脂为底物，无需样品前处理，为现场镉监测提供了低成本、高灵敏度的新方案。
研究背景
镉（Cd）是毒性极强的环境污染物，可在重要器官中蓄积，引发神经血管、心血管及神经发育障碍。全球针对饮用水、灌溉水和土壤中镉含量均有严格限值——WHO与印度BIS规定饮用水标准为0.003 mg/L，美国EPA与欧盟为0.005 mg/L，加拿大为0.007 mg/L，澳大利亚为0.002 mg/L；FAO建议灌溉水≤0.01 mg/L，EPA土壤筛选水平约32 mg/kg，印度CPCB允许废水中镉含量最高2.0 mg/L。然而现有检测方法存在检出限不足、背景干扰、样品制备复杂、便携性差和成本高昂等局限。比色型光学全细胞细菌生物传感器（CBOWCB）无需样品预处理即可实现简单、快速、灵敏且低成本的检测，适合现场监测。
研究方法
2.1 菌株、培养基与生长条件
本研究所用细菌菌株和质粒详见表S1。大肠杆菌DH5α（Invitrogen）在Luria-Bertani（LB）肉汤中培养；铜绿假单胞菌BC15在胰蛋白胨酵母提取物琼脂（TYEA）、LB和Kings B培养基中、37°C、140 rpm振荡条件下培养。固体培养基通过向肉汤中添加1.5%（w/v）琼脂制备。氨苄青霉素（Amp）的终浓度为：大肠杆菌100 μg/mL，铜绿假单胞菌BC15为150 μg/mL。菌株在−20°C甘油保存液中储存，并在LB培养基中传代用于后续实验。
【数据】培养基：LB/TYEA/Kings B；温度：37°C；转速：140 rpm；琼脂：1.5%（w/v）；氨苄青霉素：100 μg/mL（E. coli）、150 μg/mL（P. aeruginosa）；保存温度：−20°C
2.2 荧光定量分析
按照Saito（2023）的方法进行，详细流程见补充材料2.2节。
【数据】方法来源：Saito (2023)；详细参数：原文未详述
2.3 P_cadR与琼脂酶基因的PCR扩增及转化
所有实验均按照Sambrook和Russell实验手册中的方案进行。本研究所用引物由美国Invitrogen公司合成。大肠杆菌DH5α作为质粒维持的宿主菌株。铜绿假单胞菌BC15作为携带含镉感应元件和新型报告基因的重组质粒的表达宿主。质粒DNA通过氯化钙转化法转化大肠杆菌DH5α；铜绿假单胞菌BC15的转化采用电穿孔法，使用Gene Pulser（Bio-Rad，美国）电穿孔仪。电穿孔条件为：场强2.5 kV/cm，电容25 mF，电阻200 Ω。
【数据】转化方法：氯化钙法（E. coli）、电穿孔法（P. aeruginosa）；电穿孔条件：2.5 kV/cm、25 mF、200 Ω；仪器：Gene Pulser (Bio-Rad)
2.4 遗传构建
前期研究中已构建了利用P_cadR启动子的GFP生物传感器（Prabhakaran et al., 2018）。无启动子质粒pUCP18由华盛顿大学Pradeep Singh教授惠赠。以铜绿假单胞菌BC15基因组为模板，使用寡核苷酸引物P_cadR F1/P_cadR R1和P_cadR F2/P_cadR R2（表S2）扩增含镉感应元件（P_cadR启动子，GenBank登录号KU302252）的213 bp片段。扩增的镉感应启动子片段经限制性内切酶PciI和KpnI双酶切后，插入无启动子pUCP18质粒的相应酶切位点。含有P_cadR启动子片段的构建质粒（携带pUCP-P_cadR-gfp_mut2）通过限制性酶切和NCBI数据库BLAST分析确认。报告基因β-琼脂酶（dagA）以pET21a载体为模板扩增（该载体由韩国高丽大学In-Geol Choi教授提供），所用引物dagAF2和dagAR2分别携带KpnI和HindIII酶切位点。938 bp的dagA基因PCR产物经KpnI和HindIII双酶切后，连接到经KpnI和HindIII消化的pUCP-P_cadR载体中（gfp_mut2通过KpnI和HindIII消化去除）。最终构建体pUCP-P_cadR-dagA39（GSR39）和pUCP-P_cadR-dagA40（GSR40）携带P_cadR（213 bp）和报告基因琼脂酶dagA（938 bp），通过菌落PCR、限制性酶切分析及P_cadR F2和dagAR2引物（表S2）测序确认。为增强镉抗性并减少细胞死亡，将表达载体电穿孔转入表达宿主铜绿假单胞菌BC15。
【数据】P_cadR片段：213 bp（登录号KU302252）；dagA基因：938 bp；酶切位点：PciI/KpnI（P_cadR）、KpnI/HindIII（dagA）；模板：P. aeruginosa BC15基因组、pET21a载体
2.5 比色型光学全细胞生物传感器报告分析（CBOWCB）
#### 2.5.1 CBOWCB对镉的定性检测
携带P_cadR-dagA构建体的细胞在含0.3%琼脂的LB培养基中、37°C培养24小时，以诱导镉响应的β-琼脂酶表达。培养物离心（14,000 rpm，20分钟，4°C），收集含胞外β-琼脂酶的100 μL无细胞上清液。CBOWCB镉检测中，将100 μL上清液加入1.5%琼脂平板上的孔中，随后用Lugol碘液染色并在37°C孵育10分钟以观察琼脂水解。琼脂平板上可见孔周围出现清晰透明圈（halos），即β-琼脂酶已裂解琼脂底物。透明圈的大小与细胞产生的β-琼脂酶量直接相关，而后者由镉离子的存在诱导产生。检测方法和设备与Ng-Ying-Kin和Yaphe所述一致，使用特定琼脂平板、打孔技术和Lugol碘液（1% I₂，2% KI）染色。此外，携带dagA基因（编码β-琼脂酶）的pET21a质粒（韩国高丽大学In-Geol Choi教授提供）在整个实验过程中作为阳性对照。本研究通过P_cadR启动子调控下的β-琼脂酶活性诱导，成功实现了基于琼脂水解模式目视评估的镉定性检测。
【数据】诱导条件：LB+0.3%琼脂、37°C、24h；离心：14,000 rpm、20min、4°C；上清用量：100 μL；琼脂平板：1.5%；染色：Lugol碘液（1% I₂、2% KI）、37°C、10min
2.6 CBOWCB对镉的定量检测
将过夜培养物接种到5 mL含递增浓度CdCl₂（0.1至500 ppm）和0.1%琼脂的TY肉汤中，在适宜条件下孵育。孵育后，培养液在14,000 rpm、4°C离心20分钟，获得含胞外蛋白（包括琼脂酶）的无细胞上清液。培养上清中琼脂酶的活性采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法进行定量评估，具体操作参照He等人（2025）的方案。具体而言，750 μL培养上清与250 μL DNS试剂混合，煮沸10分钟，用5 mL蒸馏水稀释。所得溶液在570 nm处的吸光度（反映琼脂水解过程中释放的还原糖）使用 multimode 微板阅读器（Tecan）测定，并与D-半乳糖标准曲线比对。酶活以每毫克蛋白的单位数（U/mg）表示，一个酶活单位定义为每分钟释放1 μmol D-半乳糖所需的酶量。该方法确保了对不同CdCl₂浓度下琼脂酶活性的精确定量，为不同环境条件下酶行为提供了有价值的信息。
【数据】培养体积：5mL TY肉汤；CdCl₂范围：0.1–500 ppm；琼脂：0.1%；离心：14,000 rpm、20min、4°C；DNS法：750 μL上清+250 μL DNS、煮沸10min、5mL水稀释；检测波长：570nm；酶活单位：U/mg（1 U=1 μmol D-半乳糖/min）
2.7 比色型光学全细胞细菌生物传感器的特异性分析
使用六种金属阳离子评估比色型全细胞生物传感器对镉的特异性。细胞在与定性实验相同的条件下培养，在对数生长期加入六种金属阳离子（50 μM ZnCl₂、10 μM Pb(C₂H₃O₂)₂、25 μM NiSO₄、25 μM CuSO₄、0.5 μM HgCl₂和0.4 μM CdCl₂），随后孵育3小时。比较生物传感器响应以评估镉特异性，具体方案参照Hui等人（2021）的规程。
【数据】测试金属：ZnCl₂ 50μM、Pb(C₂H₃O₂)₂ 10μM、NiSO₄ 25μM、CuSO₄ 25μM、HgCl₂ 0.5μM、CdCl₂ 0.4μM；孵育时间：3h
2.8 CBOWCB在琼脂凝胶上的固定化
采用改良方法进行假单胞菌在琼脂中的固定化。在PBS（pH 7.2）中制备0.1–0.5%琼脂溶液，于50°C加热。冷却至室温后，将2–20 μL细胞与190 μL不同浓度的琼脂溶液混合，立即取200 μL加入96孔板。室温凝固后，平板保存在PBS（pH 7.2）中、4°C条件下。琼脂酶活性按Ng-Ying-Kin和Yaphe的方法测定。
【数据】琼脂浓度：0.1–0.5%；缓冲液：PBS pH 7.2；温度：50°C（加热）、室温（凝固）、4°C（保存）；细胞体积：2–20 μL；琼脂溶液：190 μL；总体积：200 μL/孔
2.9 ICP-MS分析条件
镉浓度使用NexION 300X电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）系统（PerkinElmer，美国）进行定量。详细的ICP-MS操作条件和分析流程见补充材料2.9节。
【数据】仪器：NexION 300X ICP-MS（PerkinElmer）；详细参数：见补充材料2.9节
2.10 CBOWCB的应用
本研究分析了30份自然污染的环境水样（十个列出的地点各三个独立样本，每份样本三次重复分析；表1中数值为平均值±标准差）。加标样本仅单独用于生物传感器校准和验证。水样采集自泰米尔纳德邦南部不同污染区域（十个地点）。
【数据】样本数：30份自然污染水样；采样点：10个地点；重复：3个独立样本/地点、每样本3次重复；表示方式：平均值±标准差
研究结果
来自假单胞菌属的P_cadR启动子对Cd²⁺表现出高度特异性和敏感性，非常适合全细胞生物传感器应用。这种选择性由CadR调控因子介导，CadR是MerR家族金属响应转录因子（Steunou et al., 2024）。在无Cd²⁺时，CadR使P_cadR启动子保持转录失活状态，基础表达极低（Zhang et al., 2024）。当Cd²⁺结合时，诱导CadR发生构象变化，使−35和−10启动子元件重新对齐，激活转录。CadR对Cd²⁺的高亲和力归因于富含半胱氨酸和组氨酸的金属结合结构域，这些结构域偏好与软金属离子配位。重要的是，该结合位点通过空间位阻和电子约束排斥Zn²⁺、Cu²⁺和Pb²⁺等其他二价金属离子，导致交叉反应性极低。前期研究表明，在等摩尔浓度下，P_cadR系统对Cd²⁺的荧光响应比Zn²⁺高10倍以上，进一步支持了其高金属离子选择性（Hui et al., 2021; Herath et al., 2023）。
【数据】Cd²⁺响应倍数：较Zn²⁺高>10倍（等摩尔浓度）；调控机制：MerR家族CadR转录因子
3.1 CBOWCB生物传感器的识别机制
镉生物传感器的识别机制依赖于P_cadR启动子——一个镉特异性转录调控元件，与dagA报告基因融合。Cd²⁺离子结合后激活P_cadR，诱导下游报告基因的转录（Prabhakaran et al., 2018; Chellaiah, 2018）。与其他金属响应系统不同，P_cadR对镉表现出高度特异性，与锌或铅等其他二价金属的交叉反应性极低（Prabhakaran et al., 2018）。激活后，dagA基因编码β-琼脂酶，该酶水解琼脂或琼脂糖，产生新琼脂二糖和L-脱水半乳糖（Rajkumar et al., 2018）。这些产物天然不存在于环境或临床样本中，可实现清晰、选择性的比色检测。比色信号强度与样本中镉浓度呈定量相关。该设计确保生物传感器在环境相关浓度下高效检测Cd²⁺，同时通过固有镉抗性机制维持宿主细胞存活（Chellaiah, 2018）。总体而言，该识别机制将金属特异性启动子激活与独特的酶报告系统相结合，为可现场部署的镉检测提供了高灵敏度、高特异性和操作简便性（Vinayagam and Rajeswari, 2024; Kuang et al., 2024）。
【数据】报告酶：β-琼脂酶（dagA基因编码）；水解产物：新琼脂二糖、L-脱水半乳糖；特异性：对Cd²⁺高度特异，与Zn²⁺/Pb²⁺交叉反应极低
3.2 基于P_cadR的GFP生物传感器构建
假单胞菌属具有高度特异且对镉敏感的启动子P_cadR（Prabhakaran and Thamarai, 2024）（图S1A）。前期已开发了基于GFP的细菌生物传感器（图S1）。本研究使用0.01 ppm至250 ppm的CdCl₂浓度对GFP生物传感器进行特异性分析，通过荧光定量法检测镉，结果如图S1C-D和图S2所示。类似地，Zhang等人也开发了用于检测重金属的全细胞生物传感器。在我们的生物传感器中，P_cadR控制下的GFP表达提供可量化的光学输出，荧光强度与0.01至250 ppm的Cd²⁺浓度呈线性相关。狭窄的激活阈值和陡峭的响应曲线归因于Cd²⁺与CadR二聚体的协同结合，这增强了信噪比分辨率并确保特异性激活。结合GFP检测的高灵敏度，这种分子精度使P_cadR生物传感器成为复杂环境样本中镉监测的可靠且选择性工具。携带P_lac启动子和突变gfp（gfp_mut2）的对照菌株未显示显著的gfp表达（图S2A和B）。为提高存活率和镉检测能力，将P_cadR构建体转化至天然宿主铜绿假单胞菌中，获得阳性克隆RGS16和RGS23（图S3）。高内涵筛选（HCS）显示，RGS16和RGS23的GFP表达显著高于携带pUCP-P_cadR-gfp_mut2的大肠杆菌菌株RGSTC3和RGSTC8（图S2G和I）。镉检测通过Cd暴露后的GFP荧光测定进行评估（大肠杆菌：0.001–100 ppm；铜绿假单胞菌：0.001–500 ppm；图S3）。检出限（LOD）和定量限（LOQ）值已计算并与先前报道的生物传感器进行了比较（表S3）。RGS16和RGS23对56.2–562 ppm（0.5–5 mM）CdCl₂表现出线性GFP响应，经流式细胞术确认（图S4），荧光定量镉检测结果如图S5所示。
【数据】GFP线性检测范围：0.01–250 ppm（E. coli）、56.2–562 ppm（P. aeruginosa）；LOD/LOQ：见表S3；对照菌株：P_lac-gfp_mut2无显著表达
3.3 基于琼脂酶生物转导的比色全细胞细菌生物传感器构建及环境水样中镉的定性鉴定
P_cadR启动子是一个镉响应调控元件，在Cd²⁺存在时激活基因表达。在假单胞菌生物传感器中，Cd²⁺与CadR调控因子结合激活P_cadR启动子，驱动报告酶（如琼脂酶）的表达。琼脂酶介导的琼脂水解产生可见的透明圈——经染色后——可实现镉的定性和定量检测。全细胞生物传感器方法通过消除繁琐的样品制备简化了分析流程，并在多种环境条件下提供稳健性能，使其适合现场镉监测。
接下来，为构建CBOWCB，我们将琼脂酶（dagA）基因整合到上述构建的基于GFP的细菌生物传感器pUCP-P_cadR-gfp_mut2中，如图1和图S5所示。使用琼脂酶（琼脂水解酶）作为报告基因是一项新技术。琼脂酶的底物是琼脂——一种在实验室微生物学中常用的藻胶。琼脂是一种非常廉价且常规可得的化学物质。α-琼脂酶（E.C. 3.2.1.158）切割α-1,3糖苷键，而β-琼脂酶（E.C. 3.2.1.81）切割β-1,4糖苷键。反应终产物可通过比色法定量；因此，比色技术可用于提取生物传感器技术的信号（Silva-Salinas et al., 2021）。
首先，将938 bp长度的β-琼脂酶（dagA）融合到P_cadR启动子下游（图1C）。随后，将所得构建体pUCP-P_cadR-dagA39和pUCP-P_cadR-dagA40转化至铜绿假单胞菌BC15中以获得更高的重金属存活率（命名为菌株GSR39和GSR40）（图1D–F）。质粒转化成功通过PCR确认——使用P_cadR正向和dagA基因反向引物在阳性克隆中扩增出1151 bp片段（图1D），并通过限制性酶切（图1E）、测序和BLAST分析确认。阳性重组细菌克隆铜绿假单胞菌GSR39和铜绿假单胞菌GSR40用于进一步的镉鉴定和定量研究（图1F）。携带pUCP-P_cadR-dagA的重组铜绿假单胞菌在细胞经镉处理后表达β-琼脂酶。结果可通过观察透明圈形成来目视识别琼脂酶活性（图1G–J）。其假设是：携带pUCP-P_cadR-dagA的铜绿假单胞菌暴露于镉时，由于dagA基因与P_cadR启动子基因片段相连，将表达琼脂酶。dagA表达导致DagA蛋白（β-琼脂酶）合成，β-琼脂酶将切割琼脂。琼脂裂解或菌落周围形成的透明圈，可通过添加Lugol碘液目视检查（图1J）。因此，该技术非常简单，适用于镉的定性检测。值得注意的是，在其他重金属存在时没有明显的琼脂酶产生，该表达系统的结果与我们之前使用GFP融合细胞的研究一致。
【数据】dagA基因：938 bp；P_cadR-dagA融合片段PCR产物：1151 bp；宿主菌株：P. aeruginosa BC15（菌株GSR39/GSR40）；检测方式：Lugol碘液染色目视观察透明圈
3.4 定量检测
定量检测部分原文节选未完整呈现，但根据摘要和结论部分信息，工程菌株P. aeruginosa BC15对CdCl₂的线性检测范围为10 ppb至500 ppm（R²=0.9851），固定化传感器Pa-CadBacS-GSR39和GSR40在ppb和ppm范围内均表现出强线性响应（R²=0.94–0.963）。图2展示了Pa-CadBacS对镉的定量检测结果——包括试管中0–80 ppm和96孔板中0–100 ppm的标准CdCl₂比色响应、定性目视检测以及铜绿假单胞菌GSR40在56.2–562 ppm（0.5–5 mM）CdCl₂范围内的比色检测。
【数据】线性范围：10 ppb–500 ppm（R²=0.9851）；固定化传感器R²：0.94（ppb）、0.963（ppm）；试管检测范围：0–80 ppm；96孔板检测范围：0–100 ppm；GSR40检测范围：56.2–562 ppm
3.5 与ICP-MS的相关性验证
图3展示了ICP-MS与生物传感器镉定量之间的Bland-Altman一致性分析。生物传感器系统测得的镉浓度与ICP-MS分析结果相关（R²=0.967），确认了其准确性。
【数据】ICP-MS vs 生物传感器：R²=0.967；分析方法：Bland-Altman一致性分析
讨论与解读
本研究将铜绿假单胞菌的镉诱导型P_cadR启动子工程化至菌株RGS16和RGS23中，其转录活性显著高于大肠杆菌系统——GFP荧光在0.01–250 ppm CdCl₂范围内递增。定量分析确认了56.1–562 ppm（0.5–5 mM）范围内的线性GFP响应。将938 bp的β-琼脂酶（dagA）报告基因连接到P_cadR控制下，产生了功能性构建体（pUCP-P_cadR-dagA39和pUCP-P_cadR-dagA40）。工程化铜绿假单胞菌BC15菌株实现了10 ppb–500 ppm CdCl₂的宽线性检测范围（跨越五个数量级；R²=0.9851）。固定化全细胞生物传感器Pa-CadBacS-GSR39和Pa-CadBacS-GSR40表现出稳健响应，OD 570在环境相关的ppb（R²=0.94）和ppm（R²=0.963）范围内线性增加。Pa-CadBacS测得的镉浓度与ICP-MS高度相关（R²=0.967），证实了其准确性。
局限性方面：这些结果主要是在受控实验室条件下验证的。现场环境影响和长期稳定性（超过30天）仍需进一步测试。未来工作包括通过启动子工程实现多种金属的检测、现场样本验证等。
编译者解读
该研究以廉价琼脂为底物、以β-琼脂酶为报告酶，巧妙规避了传统GFP传感器需要荧光设备的限制，使镉检测仅凭肉眼即可完成。将检测范围拓展至五个数量级（10 ppb–500 ppm）是显著亮点，兼顾了饮用水标准与工业废水场景。固定化设计进一步提升了现场适用性。值得注意的是，琼脂酶法依赖培养上清液酶活测定，响应时间可能受蛋白分泌效率制约；且实验室验证与真实环境基质间的差距仍需田间试验弥合。总体而言，该策略为重金属现场监测提供了"肉眼可见"的低成本方案，在资源有限地区的环境筛查中具有推广潜力。
参考来源
Prabhakaran R. Agarase-based bacterial biosensor for detection of cadmium in environmental samples. Biosensors and Bioelectronics: X, 2026. DOI: 10.1016/j.biosx.2026.100750
DOI: 10.1016/j.biosx.2026.100750