多铜氧化酶CopA参与细菌木质素氧化的表征

来源：Characterization of multicopper oxidase CopA from Pseudomonas putida KT2440 and Pseudomonas fluorescens Pf-5: Involvement in bacterial lignin oxidation（Archives of Biochemistry and Biophysics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

木质素是自然界中最难降解的芳香族聚合物之一。白腐真菌是公认最有效的木质素降解者，而细菌如何参与这一过程仍迷雾重重。本研究从具有木质素氧化活性的细菌——恶臭假单胞菌KT2440和荧光假单胞菌Pf-5中克隆表达了多铜氧化酶CopA，并对其进行了系统的生化表征。研究发现CopA不仅参与铜抗性，还能氧化多种木质素模型化合物及木质素磺酸钙，生成香草酸等产物。基因敲除实验证实CopA与细菌在小分子芳香化合物上的生长能力密切相关。该研究为细菌木质素降解机制提供了新的酶学证据。

研究背景

多铜氧化酶（MCOs）是一类含铜酶家族，包括漆酶（EC 1.10.3.2）、抗坏血酸氧化酶（EC 1.10.3.3）、铁氧化酶（EC 1.16.3.1）、亚硝酸还原酶（EC 1.7.2.1）和铜蓝蛋白（EC 1.16.3.1）等亚群。MCOs通常含有四个铜原子，分别排列在两个不同的铜中心：一个I型铜（T1）赋予蛋白质特征性的蓝色，另一个三核铜中心（TNC）包含一个II型铜和双核III型铜。某些MCOs能够通过将电子转移与双氧分子的四电子还原为水相偶联来氧化特定底物。MCOs中参与铜结合和电子传递的氨基酸残基高度保守，尽管它们的序列同源性较低，保守基序包括HXHG、HXH、HXXHXH和HCHXXXHXXXXM/L/F。漆酶是MCOs中最大且最重要的亚群，在自然界中广泛分布。真菌漆酶研究最为深入，常见于白腐真菌中，提示漆酶在木质素降解中发挥重要作用，但详细机制尚不清楚。CopA是丁香假单胞菌番茄致病变种铜抗性操纵子的组成部分，但通过基因文库筛选也将其鉴定为潜在的木质素氧化酶。目前仅发现少数细菌多铜漆酶同源物可参与木质素降解。生物信息学分析显示，具有木质素氧化能力的细菌菌株基因组中存在copA和copC基因。

研究方法

2.1 copA与copC基因的克隆

以CopA-II（UniProt代码Q88C03）的氨基酸序列为探针，在NCBI在线数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行BLAST搜索，在UniProt在线数据库（https://www.uniprot.org/）中检索获得恶臭假单胞菌KT2440和荧光假单胞菌PF-5中的CopA蛋白，以及伯克霍尔德氏菌（Burkholderia xenovorans）中的CopC蛋白。使用Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega）分离基因组DNA，以染色体DNA为模板通过PCR扩增来自恶臭假单胞菌KT2440和荧光假单胞菌PF-5的CopA编码基因。扩增引物如下：恶臭假单胞菌copA-II正向引物（5′ CACC GTG ACC AGC CCT GGC CAA CCG 3′）和反向引物（5′ TCA TTC GTC CAC GCG GAC TTC 3′），表达蛋白命名为Pp-CopA；荧光假单胞菌copA正向引物（5′ CACC GTC AGC AGC CCG GGC CAG 3′）和反向引物（5′ TCA AGC TTC ATG GTG GCG TTC CTC 3′），表达蛋白命名为Pf-CopA。设计引物时排除了这些基因中预测的TAT信号序列。使用Pfx Taq聚合酶进行PCR扩增后，纯化PCR产物并使用Champion™ pET Directional TOPO® Expression Kit（Invitrogen）进行克隆。所得载体分别转化入TOP10大肠杆菌感受态细胞用于质粒维持，以及BL21大肠杆菌感受态细胞用于蛋白表达，操作均按照制造商方案进行。叶杆菌属（Microbacterium phyllosphaerae）分离自林地土壤，在先前研究中被鉴定为细菌木质素降解菌[33]。选择两个CopC编码基因copC886（登录号MH924843）和copC1032（登录号MH924844）进行克隆和蛋白表达，采用两种不同表达系统：基于大肠杆菌BL21的pET151载体系统，以及基于R. jostii RHA1的pTipQC-II载体系统。所用引物列于表1。在线工具Phobius（http://phobius.sbc.su.se/）和SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）鉴定出这些基因中存在信号肽序列。因此，在大肠杆菌中表达时设计了两组引物，一组包含预测的信号肽序列，另一组排除该序列。用于R. jostii系统表达的引物在正向和反向引物中分别含有NdeI和HindIII限制性酶切位点。此外，这些引物的PCR产物含有TEV识别序列。对于R. jostii的克隆，使用FastDigest限制酶（Thermo Scientific）按照制造商说明对PCR产物和pTipQC-II载体进行限制性酶切和T4 DNA连接。所得载体转化入Top10大肠杆菌化学感受态细胞用于质粒维持，以及R. jostii感受态细胞用于蛋白表达。R. jostii感受态细胞通过电穿孔法转化：将50 μL感受态细胞与6 μL含有目的基因的pTipQC-II质粒混合于电穿孔杯中，使用脉冲电穿孔仪施加1.8 V电压5 s。反应产物与200 μL Luria Bertani培养基在30°C孵育1 h，然后涂布于补充氯霉素（25 μg/mL）的Luria Bertani琼脂平板上。来自伯克霍尔德氏菌（Burkholderia xenovorans）的两个CopC编码基因copC-bx1和copC-bx2由Genscript公司合成。合成基因设计为在C端带有His6标签，并直接克隆到表达载体pET28b+中，限制性位点为：5′端NcoI，3′端XhoI。所得载体转化入TOP10大肠杆菌感受态细胞用于质粒维持，以及BL21大肠杆菌感受态细胞用于蛋白表达，操作按照Champion™ pET Directional TOPO® Expression Kit（Invitrogen）方案进行。所有质粒送GATC生物技术公司测序，确认克隆基因的结构和完整性。

【数据】菌株：恶臭假单胞菌KT2440、荧光假单胞菌PF-5、叶杆菌属MH924843/MH924844、伯克霍尔德氏菌LB400；载体：pET151/pTipQC-II/pET28b+；抗生素：氨苄青霉素100 μg/mL、氯霉素25 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL；电穿孔：1.8 V、5 s；孵育：30°C、1 h

2.2 重组CopA和CopC的蛋白表达与纯化

用于蛋白表达的抗生素根据生物体和目的蛋白而不同，具体如下：来自恶臭假单胞菌的Pp-CopA、来自荧光假单胞菌的Pf-CopA，以及来自叶杆菌属的CopC886和CopC1032，均在大肠杆菌中表达，使用氨苄青霉素（100 μg/mL）；来自叶杆菌属的CopC886和CopC1032在R. jostii中表达，使用氯霉素（25 μg/mL）；来自伯克霍尔德氏菌的CopC-Bx1和CopC-Bx2在大肠杆菌中表达，使用卡那霉素（50 μg/mL）。将含有目的基因载体的微生物10 mL培养物作为起始培养物，接种至1 L补充相应抗生素的Luria Bertani培养基中。大肠杆菌在37°C培养，R. jostii在30°C培养，直至OD达到约0.6（大肠杆菌约4 h，R. jostii约24 h），然后加入诱导剂：pET载体（用于大肠杆菌细胞的载体）使用IPTG 1 mM，pTipQC-II载体（用于R. jostii的载体）使用硫链丝菌素（1 μg/mL）。此时，向培养物中补充CuSO₄（80 μM），并在15°C、200 rpm振荡下过夜培养。细胞收集通过6000×g离心完成，然后将细胞重悬于15 mL裂解缓冲液（50 mM磷酸钠、300 mM NaCl、10 mM咪唑，pH 8.0）中，用细胞破碎仪在21 kpsi压力下裂解，随后细胞裂解液在15000×g离心30 min。重组蛋白带有His6标签，因此将上清液上样至镍亲和柱进行IMAC纯化。弃去流穿液，用洗涤缓冲液（50 mM磷酸钠、300 mM NaCl、20 mM咪唑，pH 8.0）洗涤柱子。最后用5 mL洗脱缓冲液（50 mM磷酸钠、300 mM NaCl、250 mM咪唑，pH 8.0）从柱上洗脱蛋白。Pp-CopA和Pf-CopA进一步用TEV蛋白酶切割His6标签，再进行第二次IMAC以去除TEV酶。含有无标签Pp-CopA和Pf-CopA的蛋白溶液使用PD10柱脱盐，并转移至20 mM Hepes、100 mM NaCl缓冲液（pH 7.0）中。蛋白质量通过SDS/PAGE评估（图1，A）。

【数据】培养基：Luria Bertani；诱导剂：IPTG 1 mM/硫链丝菌素1 μg/mL；CuSO₄：80 μM；温度：15°C（诱导后）；转速：200 rpm；裂解压力：21 kpsi；离心：6000×g、15000×g 30 min；缓冲液：50 mM磷酸钠/300 mM NaCl/10-250 mM咪唑/pH 8.0

2.3 铜重构

Pp-CopA和Pf-CopA在充分通气条件下以脱辅基酶形式产生。在微需氧条件（诱导后 agitation 0 rpm）下进行表达以产生载铜蛋白[34]。此外，这些蛋白纯化后，用Centricon管浓缩Pp-CopA和Pf-CopA，然后向各蛋白溶液（约1 mg/mL）中加入3 μL无菌CuSO₄ 400 mM。混合物在室温下孵育过夜，然后用PD10柱两次交换缓冲液至20 mM Hepes、100 mM NaCl缓冲液（pH 7.0），以去除过量铜离子。

【数据】CuSO₄：400 mM、3 μL；蛋白浓度：约1 mg/mL；孵育：室温过夜；缓冲液：20 mM Hepes/100 mM NaCl/pH 7.0

2.4 酶活性与生化表征

漆酶底物2,2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS，λ 420 nm，ε 36,000 M⁻¹ cm⁻¹）；丁香醛连氮（SGZ，λ 530 nm，ε 65,000 M⁻¹ cm⁻¹）；愈创木酚（λ 436 nm，ε 26,600 M⁻¹ cm⁻¹）；2,6-二甲氧基苯酚（DMP，λ 468 nm，ε 49,600 M⁻¹ cm⁻¹）和2,4-二氯苯酚（DCP，λ 510 nm，ε 18,000 M⁻¹ cm⁻¹，在4-氨基安替比林存在下），用于CopA活性测定。底物终浓度为1 mM，SGZ除外，其浓度为0.05 mM。酶促反应混合物包含底物、缓冲液（ABTS和DMP使用50 mM醋酸钠缓冲液，pH 4.0；SGZ、DCP和愈创木酚使用50 mM Hepes缓冲液，pH 7.0）、酶（0.05 mg/mL）和CuSO₄（0.5 mM）。通过分光光度法测定相应底物波长处吸光度的变化来确定活性。对ABTS、SGZ和DMP建立了动力学参数。一个活性单位定义为……

【数据】底物：ABTS/SGZ/愈创木酚/DMP/DCP；底物浓度：1 mM（SGZ为0.05 mM）；酶量：0.05 mg/mL；CuSO₄：0.5 mM；缓冲液：50 mM醋酸钠pH 4.0或50 mM Hepes pH 7.0

研究结果

3.1 copA和copC基因的鉴定与遗传背景

分析了一些细菌木质素降解菌的基因组序列，以鉴定推定的copA和copC基因。恶臭假单胞菌KT2440含有两个不同的copA序列，命名为copA-I和copA-II。基因copA-II位于基因组核苷酸6,131,843至6,133,852处。copA-II附近有先前报道为铜抗性操纵子组成部分的推定基因：copB-II、copR-II和copS[31,32]；以及铜和银外排系统：cusA、cusB和cusF[37]。基因copA-I位于基因组核苷酸2,510,006至2,511,730处，与推定copB-I基因相邻。该基因附近未发现其他与铜抗性相关的推定基因。在恶臭假单胞菌KT2440中未发现copC基因。关于荧光假单胞菌PF-5，发现一个推定copA基因，位于基因组核苷酸3,237,717至3,239,456处。该基因附近仅发现推定copB基因与铜抗性相关。在荧光假单胞菌PF-5中发现推定copC基因，虽不在copA附近，但位于基因组核苷酸2,814,512至2,814,880处，与copD基因相邻。在细菌木质素降解菌叶杆菌属和伯克霍尔德氏菌的基因组中发现了推定copC基因。除CopC外，这些基因组中仅发现CopD推定基因作为铜抗性操纵子的组成部分。预测的CopC蛋白缺乏参与铜结合的富甲硫氨酸区域，该区域在丁香假单胞菌番茄致病变种CopC中已有报道[38,39]。叶杆菌属含有两个copC基因，命名为copC886和copC1032。基因copC886（登录号MH924843）与二氢硫辛酰胺脱氢酶基因相邻，而copC1032（登录号MH924844）位于DyP型过氧化物酶基因附近；这两个基因家族均与木质素降解有关[40,41]。多氯联苯降解菌伯克霍尔德氏菌LB400的基因组含有两个copC基因，命名为copC-bx1和copC-bx2，附近没有其他铜抗性基因。

【数据】copA-II位置：6,131,843-6,133,852；copA-I位置：2,510,006-2,511,730；Pf-5 copA位置：3,237,717-3,239,456；copC位置：2,814,512-2,814,880

3.2 重组CopA和CopC的表达与纯化

选择恶臭假单胞菌KT2440 copA-II、荧光假单胞菌Pf-5 copA、叶杆菌属copC885和copC1032，以及伯克霍尔德氏菌copC-bx1和copC-bx2进行克隆和蛋白表达。编码恶臭假单胞菌CopA-II（Pp-CopA）和荧光假单胞菌CopA（Pf-CopA）的基因从染色体DNA扩增，排除了预测的TAT信号肽序列。扩增产物克隆至表达载体pET151中。重组蛋白在大肠杆菌中以N端His6融合蛋白形式表达，用1 mM IPTG诱导，在补充80 μM CuSO₄和氨苄青霉素的Luria Bertani培养基中生长。重组蛋白通过固定化金属离子亲和色谱（IMAC）纯化，Pp-CopA和Pf-CopA分别得到预期大小70.8 kDa和60.4 kDa的蛋白条带（图1，A）。然后用TEV蛋白酶通过蛋白水解消化去除His6融合标签，再进行第二次IMAC进一步纯化，获得无杂质的重组蛋白。每升培养物获得约25 mg Pp-CopA和约3 mg Pf-CopA。纯化后的蛋白无色，即使在铜重构后也是如此，这与来自Ochrobactrum的多铜氧化酶CueO[23]形成鲜明对比，后者呈蓝色（图1，B）。发现两种蛋白的活性依赖于外源Cu²⁺盐；然而，在微需氧条件[34]下表达并经铜重构后，酶在不添加外源铜的情况下具有活性。尽管有活性，它们仍保持无色，未显示漆酶典型的UV/vis光谱（λ max 612 nm，见图1，C）。尝试结晶Pp-CopA和Pf-CopA未获成功。通过电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）分析纯化酶，Pp-CopA的化学计量为每摩尔蛋白9.1 ± 1.5 mol Cu；Pf-CopA为每摩尔蛋白8.7 ± 1.3 mol Cu；这与丁香假单胞菌CopA报道的每蛋白10.9 ± 1.2个铜原子的含量相似[31]。叶杆菌属copC885和copC1032从染色体DNA扩增并克隆至pET151载体，但无论是在大肠杆菌中还是在革兰氏阳性宿主R. jostii RHA1中（使用表达载体pTipQC-II）尝试在一系列条件下表达重组蛋白均未成功。来自革兰氏阴性菌伯克霍尔德氏菌LB400的合成密码子优化基因copC-bx1和copC-bx2克隆至表达质粒pET-28b(+)中，并在大肠杆菌BL21中表达。使用补充150 μM CuSO₄和卡那霉素的Luria Bertani培养基进行重组蛋白表达，用1 mM IPTG诱导。细胞收集后，通过固定化金属离子亲和色谱（IMAC）纯化重组蛋白，CopC-bx1和CopC-bx2均在10-15 kDa处出现预期蛋白条带，同时在30-40 kDa处出现蛋白条带（见支持信息图S1），但产量相对较低，每种蛋白每升培养物约0.3 mg。通过胰蛋白酶消化和电喷雾质谱确认了纯化的CopC-bx1和CopC-bx2的身份：蛋白CopC-Bx1（UniProt代码Q13UF7）覆盖率49%，蛋白CopC-Bx2（I2IK44）覆盖率68%。

【数据】Pp-CopA分子量：70.8 kDa；Pf-CopA分子量：60.4 kDa；产量：Pp-CopA约25 mg/L、Pf-CopA约3 mg/L；铜含量：Pp-CopA 9.1±1.5 mol/mol、Pf-CopA 8.7±1.3 mol/mol；CopC产量：约0.3 mg/L

3.3 Pp-CopA、Pf-CopA、CopC-bx1和CopC-bx2的动力学表征

所有表达的蛋白均用常规漆酶底物ABTS、SGZ、DCP、DMP和愈创木酚进行活性测定。Pp-CopA和Pf-CopA对所有底物均有活性，但仅在存在外源铜离子时才有活性。CopC-bx1和CopC-bx2均未显示任何底物活性，将CopC蛋白添加到Pp-CopA或Pf-CopA中也未增强其活性。对于Pp-CopA和Pf-CopA，铜重构蛋白和在微需氧条件下表达的酶在不添加外源Cu²⁺时具有活性，但比活性降低且纯化蛋白产量较低。添加过氧化氢未产生酶活性，表明CopA酶表现出氧依赖性氧化酶活性，而非过氧化物酶活性。由于两种酶均对SGZ有活性，且需要添加外源铜离子，这些蛋白可归类为假漆酶[6,20]。使用ABTS、SGZ和DMP作为底物测定了Pp-CopA和Pf-CopA的稳态动力学参数（表3），两种酶显示出相似的动力学参数，例如对于ABTS，Pp-CopA的kcat值为2.4 s⁻¹，Pf-CopA为2.2 s⁻¹。SGZ较低的KM值使这些酶对SGZ具有较高的催化效率。使用ABTS和SGZ作为底物测定了Pp-CopA和Pf-CopA的pH活性曲线（图2，A）。确定ABTS的最适pH值约为4，SGZ约为7.5。两种酶在ABTS存在下最适pH约为4.0，在SGZ存在下约为7.5。在50°C下评估了Pp-CopA的稳定性，并与市售真菌云芝漆酶（TvL）进行比较。两种蛋白在初始活性衰减后，结果显示Pp-CopA更耐热，能够在6 h以上保持残余活性，而TvL则不然（图2，B）。对Pp-CopA与市售真菌云芝漆酶（TvL）的相对活性（百分比）进行了比较。Pp-CopA对ABTS的比活性比TvL低13倍。然而，当使用SGZ作为底物时，这种关系发生了逆转，

【数据】kcat（ABTS）：Pp-CopA 2.4 s⁻¹、Pf-CopA 2.2 s⁻¹；最适pH：ABTS约4.0、SGZ约7.5；温度：50°C；稳定性：Pp-CopA >6 h；比活性：Pp-CopA对ABTS比TvL低13倍

图3显示木质素模型化合物与Pp-CopA和Pf-CopA反应后产物形成的UV-Vis色谱图。每张图的右上角小照片显示了每种酶与底物孵育后的实际反应。(A) GGE作为底物，无介体存在。(B) GGE……

图4显示Ca-木质素磺酸盐与Pp-CopA和Pf-CopA反应的UV-Vis色谱图，以及香草酸的形成。(A) 无介体存在时的反应。(B) 存在1 mM ABTS作为介体时的反应。

【数据】介体：ABTS 1 mM；产物：香草酸

讨论与解读

CopA在丁香假单胞菌中的功能此前已在铜抗性背景下研究过[31,32]。在该生物体中，copA基因作为操纵子的一部分，还包括copBCD基因和调节基因copRS。丁香假单胞菌CopA的提出功能涉及其氨基酸序列中的富甲硫氨酸区域，该区域可结合多个铜原子，防止有毒金属离子进入细胞质，从而将有毒离子保留在膜间空间中[31,32]。另一方面，通过检测木质素降解产物的生物传感器，从宏基因组fosmid文库中也鉴定出推定CopA，提示CopA在木质素降解中的作用[25]。这些蛋白可能表现出不止一种生物学功能，既在铜抗性中发挥作用，也作为氧化反应的催化剂。在多铜氧化酶中，T1铜位点的底物氧化被认为通过外球电子转移机制利用单电子Cu(II)/Cu(I)对进行，因此MCOs的底物特异性由与T1偶联的底物对接/氧化位点的性质决定。因此，这些蛋白可以催化广泛的底物，并可能具有其他细胞功能，许多此类酶被称为"兼职蛋白"[42,43]。CopA的氨基酸序列含有漆酶中作为4个铜配体的残基。

编译者解读

本研究通过异源表达和生化表征，将CopA从"铜抗性蛋白"的传统认知拓展到"木质素氧化酶"的新角色。方法上值得称道的是采用微需氧表达结合体外铜重构策略，成功获得了不依赖外源铜即有活性的酶，为含铜金属酶的表达提供了可借鉴的方案。动力学数据显示CopA对SGZ的催化效率优于ABTS，且热稳定性优于真菌漆酶TvL，这为其在工业木质素降解中的应用提供了潜在优势。值得注意的是，CopA氧化木质素磺酸钙生成香草酸这一发现，为木质素高值化利用提供了新的酶学工具。然而，CopA的比活性较真菌漆酶低13倍，且铜依赖性特性可能限制其实际应用，未来通过蛋白质工程提高催化效率将是值得探索的方向。

DOI: 10.1016/j.abb.2018.10.012