来源：A transcription factor-based bacterial biosensor system and its application for on-site detection of explosives（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
地雷污染是全球长期面临的安全与环境难题。本研究从恶臭假单胞菌中鉴定出MexT转录因子作为核心传感元件，构建了可检测1,3-二硝基苯（1,3-DNB）的大肠杆菌全细胞生物传感器。通过解析MexT对下游基因的正调控机制，优化传感器基因回路，并集成便携式检测仪器与图像处理软件，形成了完整的“中国天眼”（CEE）爆炸物检测系统。该系统在沙土中检测灵敏度达0.5 mg/kg，实现了现场、大范围及埋藏爆炸物的定位检测。
研究背景
地雷因其廉价便捷被广泛用于战争，导致冲突区域遗留数百万枚未爆炸地雷。传统检测方法包括金属探测器、动物嗅探、探地雷达、光谱测量及化学分析等，但普遍存在误报率高、灵敏度低、效率差、耗费人力且对排雷人员构成严重威胁等缺陷。近年来，全细胞生物传感器因其便携、操作简单、灵敏度高及可远程检测的优势，成为爆炸物检测的新兴技术方向。已有研究聚焦于检测TNT基爆炸物释放的关键挥发性组分2,4-二硝基甲苯（2,4-DNT），以色列团队开发了发光细菌生物传感器及配套装置。然而，针对1,3-DNB——TNT制造过程中的基础副产物——的生物传感器研究尚属空白。本研究旨在开发一种基于转录因子的新型大肠杆菌生物传感器，实现对1,3-DNB的安全高效检测。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株列于补充表S1。大肠杆菌BW25113作为设计全细胞生物传感器的宿主菌株，大肠杆菌DH5α用于质粒克隆。所有大肠杆菌菌株均在补充葡萄糖（2%）、MgSO₄（1 mM）及相应抗生素的M9培养基中，于37°C、180 rpm摇床振荡好氧培养。恶臭假单胞菌用于RT-qPCR和EMSA等实验，以阐明MexT调控蛋白对下游基因的调控机制。传感元件通过提取恶臭假单胞菌KT2440基因组遗传物质获得，该菌株在LB培养基中于30°C、180 rpm条件下培养。培养基中添加适当抗生素：50 μg/mL卡那霉素（Km）用于质粒pET28a和pK18 mobsacB，100 μg/mL氨苄青霉素（Amp）用于质粒pBR-C55-luxPleio及突变株筛选标记。所有抗生素购自Sigma-Aldrich。
【数据】培养基：M9（葡萄糖2%、MgSO₄ 1 mM）/LB；温度：37°C（大肠杆菌）、30°C（恶臭假单胞菌）；转速：180 rpm；抗生素：50 μg/mL Km、100 μg/mL Amp
2.2 mexT敲除突变株构建与实时定量PCR
通过PCR扩增目标基因的上、下游同源臂，构建恶臭假单胞菌KT2440的mexT敲除突变株。将两个片段克隆至pK18 mobsacB自杀载体的Sal I克隆位点。质粒转化至大肠杆菌S17-1后，以大肠杆菌S17-1为供体、恶臭假单胞菌为受体进行接合转移，实现自杀质粒从大肠杆菌S17-1向恶臭假单胞菌的转移，从而获得恶臭假单胞菌（ΔmexT）。恶臭假单胞菌和恶臭假单胞菌（ΔmexT）在LB中于30°C培养至OD600为0.2，随后加入0.5 mM 1,3-DNB孵育3小时，以评估mexT基因缺失对1,3-DNB检测的影响。孵育后收集细胞，使用Trizol试剂（Takara Co.）从恶臭假单胞菌和恶臭假单胞菌（ΔmexT）中提取总RNA。随后使用HiScript III 1st strand cDNA合成试剂盒（含gDNA wiper）按制造商说明书（Vazyme Biotech）从RNA合成cDNA。将400 ng cDNA加入SYBR qPCR预混液（Vazyme Biotech）及0.4 μL各特异性引物（表S2），总体积20 μL。使用实时PCR仪（qTOWER3；Analytic Jena）进行PCR，条件如下：95°C 3分钟；40个循环：95°C 10秒、60°C 30秒、72°C 30秒。所有反应以看家基因rpoD为内参进行归一化，所有实验设三个独立重复。
【数据】诱导浓度：0.5 mM 1,3-DNB；孵育时间：3h；cDNA用量：400 ng；引物体积：0.4 μL；反应体系：20 μL；PCR条件：95°C 3min，40循环（95°C 10s、60°C 30s、72°C 30s）；OD600：0.2
2.3 MexT蛋白纯化与EMSA
mexT基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化，方法参照先前报道（Ni et al., 2016）。使用mexT-F和mexT-R引物（见表S3）通过PCR扩增mexT片段，经Hind III和Nde I双酶切后，插入经相同限制性内切酶预切的pET-28a载体，获得重组质粒pET-mexT。构建产物经测序确认后转化至大肠杆菌BL21(DE3)。转化菌株在LB培养基中于37°C培养至OD600为0.6，随后加入0.2 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）于25°C诱导8小时。收集细胞，用预冷PBS缓冲液（137 mM NaCl₂、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、2 mM KH₂PO₄，pH 7.4）洗涤并超声破碎。裂解液于4°C、12,000×g离心20分钟，收集上清液上样至HisTrap™ HP（GE Healthcare）柱。使用咪唑浓度梯度洗脱纯化的6×His标签MexT蛋白。合并含MexT的组分，用10-kDa Amicon超滤管过滤，蛋白质浓度用Bradford法测定。
电泳迁移率变动分析（EMSA）用于评估MexT转录因子与P PP_2827和P mexE启动子片段的体外结合能力。P PP_2827和P mexE启动子片段通过PCR扩增获得（引物见表S3），并使用PCR纯化试剂盒（Vazyme）纯化。EMSA实验中，MexT蛋白以递增用量（0 pmol、1.5 pmol、3 pmol、6 pmol、9 pmol、12 pmol和15 pmol）与1.5 μL 10×结合缓冲液（500 mM KCl、100 mM Tris-HCl、10 mM二硫苏糖醇，pH 7.5）在室温孵育20分钟。加入50 ng DNA探针后继续孵育20分钟，终体积15 μL。孵育结束后，每样品加入3 μL DNA上样缓冲液并混匀。随后在预冷的0.25×TBE缓冲液中，于6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶上以120 V电泳90分钟。凝胶用SuperRed染色，室温、50 rpm摇床染色30分钟，去离子水冲洗两次，然后用凝胶成像系统观察。
【数据】IPTG浓度：0.2 mM；诱导温度：25°C；诱导时间：8h；离心：12,000×g、4°C、20min；MexT用量：0-15 pmol；DNA探针：50 ng；结合缓冲液：500 mM KCl、100 mM Tris-HCl、10 mM DTT、pH 7.5；凝胶：6.5%非变性PAGE；电泳：120V、90min
2.4 生物传感器基因回路构建
本研究使用表S1所列质粒和菌株构建多种生物传感器基因回路，表S3列出了重组所用引物。重组使用2×Multif Seamless Assembly Mix（ABclonal，武汉，中国）进行。基于lux的无启动子载体pBR-luxPleio（pBR）以pBR-C55-luxPleio为模板，用引物pBR-F/R扩增作为传感系统的主框架。lux基因（luxCDABEG）源自发光杆菌Photobacterium leiognathi（Belkin, 2003）。启动子（P PP_2827和P mexE）及基因P mexT-mexT从恶臭假单胞菌基因组扩增。两个启动子分别克隆至pBR，生成质粒pBR-P PP_2827-luxPleio和pBR-P mexE-luxPleio。将这两个启动子与P mexT-mexT分别克隆至pBR，生成质粒pBR-mexT-P mexT-P PP_2827-luxPleio和pBR-mexT-P mexT-P mexE-luxPleio。此外，将基因mexT、启动子P PP_2827与组成型启动子Pc（103/114/115/118/101/100）组合，生成质粒pBR-mexT-P103-P PP_2827-luxPleio、pBR-mexT-P114-P PP_2827-luxPleio、pBR-mexT-P115-P PP_2827-luxPleio、pBR-mexT-P118-P PP_2827-luxPleio、pBR-mexT-P101-P PP_2827-luxPleio、pBR-mexT-P100-P PP_2827-luxPleio。另外，将基因mexT与启动子P mexT、P PP_2827及启动子P mexT(PP_2827)组合，获得pBR-P mexT-mexT-P PP_2827-luxPleio和pBR-mexT-P mexT(PP_2827)-luxPleio。阳性克隆经测序确认后转化至大肠杆菌BW25113。
【数据】重组酶：2×Multif Seamless Assembly Mix；模板：pBR-C55-luxPleio；来源菌株：恶臭假单胞菌KT2440、Photobacterium leiognathi；启动子：P PP_2827、P mexE、P mexT、Pc（103/114/115/118/101/100）
2.5 生物报告菌株在液体培养基中对1,3-DNB的响应
所有生物报告菌株对1,3-DNB的发光响应强度按先前描述的方法（Shemer et al., 2020a）进行定量。生物报告菌株单菌落于37°C、200 rpm在含100 mg/L氨苄青霉素的LB中过夜培养。培养物用M9培养基稀释后在相同条件下重新培养至OD600达到0.2。将90 μL细菌等分试样转移至黑色底透96孔板（Excell Bio，北京，中国）的各孔中，孔内已含10 μL不同浓度的1,3-DNB（溶于0.2%乙醇），终浓度分别为0、0.1、1、10和40 μg/mL。用透明密封膜封板后于30°C孵育。使用Cytation 1细胞成像多功能读板仪（BioTek，佛蒙特州，美国）测量细菌等分试样的600 nm吸光度（OD600）和生物发光（400-800 nm发射），每次读数前振荡确保充分混匀。发光数据以仪器的任意相对光单位（RLU）或响应比（即加诱导物的发光值除以未加诱导物的发光值）表示。每个实验设三次重复。1,3-DNB的检测灵敏度由EC200值确定（代表发光强度达到未诱导对照200%时的1,3-DNB浓度）。
【数据】氨苄青霉素：100 mg/L；OD600：0.2；菌液量：90 μL；1,3-DNB浓度：0、0.1、1、10、40 μg/mL；孵育温度：30°C；转速：200 rpm
研究结果
3.1 MexT调控机制的解析
MexT是一种LysR型转录调控因子，已有报道称其是某些假单胞菌属中MexEF-OprN外排泵的正调控因子（Jin et al., 2011; Kim et al., 2019; Uwate et al., 2013）。mexT基因和mex操纵子也存在于恶臭假单胞菌中。与mexT相邻、方向相反的是PP_2827基因，两者之间有一段206 bp的间隔序列，命名为P mexT(PP_2827)（图2A）。该间隔序列是位于两个转录方向相反的相邻基因（mexT和PP_2827）之间的双向启动子。也就是说，其转录起始所需的具体碱基位于相对DNA链上。正向驱动mexT表达的启动子命名为P mexT，反向驱动PP_2827表达的启动子命名为P PP_2827。
为确认MexT在恶臭假单胞菌中的调控机制，构建了mexT无痕缺失突变株，并通过RT-qPCR比较了mexT缺失株与野生型菌株中PP_2827、mexE、mexF和oprN的差异表达。结果显示，与野生型相比，mexT缺失株中这些基因的转录水平均下调（图S1），表明MexT通过结合其启动子区域直接激活PP_2827及mexEF-oprN三个独立基因的转录。MexT与启动子区域的相互作用通过电泳迁移率变动分析（EMSA）验证。EMSA实验中，随着加入蛋白量的增加，MexT的结合量增加，导致其与P PP_2827和P mexE片段的结合发生显著迁移（图2B）。这一发现与先前关于MexT通过结合mexE启动子区域正调控mexEF-oprN转录的假设和报道一致（Henriquez et al., 2020; Kim et al., 2019）。因此，本研究首次证明MexT通过调控正向激活恶臭假单胞菌中的P PP_2827。
值得注意的是，先前研究表明PP_2827和mexEF-oprN在TNT（爆炸物最关键组分）存在时均上调表达（Fernandez et al., 2009）。据此推测MexT可能对1,3-DNB有响应，因为1,3-DNB是TNT的基础制造副产物。为探索这一可能性，我们比较了PP_2827和mexE基因在有无1,3-DNB条件下的转录差异。结果显示，添加1,3-DNB后，野生型菌株中PP_2827和mexE显著上调，变化幅度接近10倍和100倍。相比之下，缺失mexT的突变株中未观察到显著变化（图2C）。这些发现表明，MexT在恶臭假单胞菌中能够响应1,3-DNB并增强PP_2827和mexE的转录（图2A），提示MexT作为传感元件开发1,3-DNB生物传感器的潜力。在无1,3-DNB时，MexT蛋白处于非活性状态，生物传感器处于“OFF”状态。在1,3-DNB存在时，MexT被激活并增强诱导型启动子控制基因（PP_2827）的表达，使生物传感器处于“ON”状态。
【数据】间隔序列长度：206 bp；PP_2827上调倍数：约10倍；mexE上调倍数：约100倍
3.2 1,3-DNB生物传感器的构建与优化
全细胞生物传感器的构建涉及基础诱导启动子元件的选择和调控元件的重构（图3A）。如上所述，MexT是一种响应1,3-DNB的转录因子，在1,3-DNB存在时促进PP_2827和mexE基因的转录。根据mex操纵子的调控机制，选择P PP_2827和P mexE启动子在MexT响应1,3-DNB时启动luxCDABEG报告基因盒的表达。如图3A所示，MR2和MR4两个基因回路结构相似，P PP_2827和P mexE与P mexT背靠背排列。它们分别利用P PP_2827和P mexE通过MexT与启动子的相互作用激活lux报告基因的转录。MR1和MR3用于研究MexT在有无1,3-DNB条件下对下游基因转录的影响。
将四种生物传感器应用于含10 μg/mL 1,3-DNB的液体溶液中检测目标物。结果显示，在缺乏MexT的情况下（MR1和MR3），启动子无法驱动荧光素酶表达；而含有MexT的MR2和MR4中荧光素酶能够表达（图3B）。MR2的发光强度比MR4高73.5倍，MR2的响应比达到3.0，而MR4仅为1.2。因此，当MexT激活P PP_2827启动子时，触发Lux报告基因盒的表达，实现对1,3-DNB的检测。然而，MR4对1,3-DNB无响应。这一结果与3.1节中RT-qPCR实验结果不一致。原因之一是mRNA的高表达水平在特定时间与蛋白质表达水平不一致——mRNA可能在翻译过程中受到其他因素的负调控；另一个原因是两种情况所用的宿主不同，可能导致同一基因的表达水平存在差异。也可能是MexT依赖的其他因子触发了P mexE。总体而言，结果表明P PP_2827是构建1,3-DNB生物传感器的有效启动子。
我们以MR2基因回路为基础，通过调节mexT的表达来提升生物传感器的性能。利用Anderson启动子库（http://parts.igem.org/Promoters/Catalog/Anderson）中六个强度不同的组成型启动子（P 103/114/115/118/101/100）驱动mexT表达。P 101、P 114和P 115为相对较弱的启动子，而P 118、P 101和P 100相对较强。然而，结果显示含这六个启动子的生物传感器在感应1,3-DNB时的发光强度均显著低于原始P mexT启动子（图S2）。这些发现表明，与来自恶臭假单胞菌的天然P mexT启动子相比，这些来自大肠杆菌的组成型启动子不适合驱动mexT表达，可能是由于大肠杆菌和恶臭假单胞菌的转录和表达机制不同，导致启动子在不同菌株中的表达强度存在差异。
此外，我们构建了MR5和MR6生物传感器，它们与MR2具有相同的传感元件（P mexT(PP_2827)、mexT），但元件排列方式不同（图3A）。MR5的基因回路类似于天然mex操纵子，利用双向启动子P mexT(PP_2827)同时驱动mexT和lux的表达。MR6中，mexT和lux以串联模式排列，分别由P mexT和P PP_2827驱动。MR5的发光强度比MR6高7.5倍，MR5的响应比比MR6高3.2，表明MR5在感应1,3-DNB方面优于MR6（图3C和D）。比较MR5与先前构建的MR2对1,3-DNB的响应性能，MR5的发光强度比MR2低1.8倍。然而，MR5的响应比比MR2高3.3（图3D）。响应比可以反映有无1,3-DNB时发光强度是否存在显著差异。MR2的发光强度高但响应比低，表明MR2在无1,3-DNB时也有一定程度的发光强度，这不利于爆炸物的检测。
3.3 “CEE”检测系统的集成与应用
（注：此节原文在提供的节选片段中被截断，以下内容基于前文摘要及讨论部分信息进行编译，具体实验细节以原文为准。）
研究进一步将优化后的MR5生物传感器整合到完整的检测装置中，形成“中国天眼”（CEE）检测系统。该系统包括基于CCD相机的发光检测仪器、相应的操作处理软件以及固定化生物传感器珠。固定化生物传感器珠通过海藻酸钙包埋制备，铺展于样品板上进行检测（图4）。软件操作界面实现了图像采集、数据分析与结果输出的自动化流程。
在LB固体琼脂上进行的检测实验中，CEE系统成功检测到琼脂上不同量的1,3-DNB（图5A）。固定在海藻酸钙珠中的MR5生物传感器的响应比如图5B所示。系统在5天、25天和40天时对琼脂上1,3-DNB的检测图像显示了传感器的长期稳定性（图5C）。
在沙土和土壤中的检测实验中，CEE系统实现了沙中不同量1,3-DNB的检测（图6A），固定化MR5生物传感器的响应比如图6B所示。系统还实现了对埋藏于土壤中的1,3-DNB的定位检测（图6C）。在沙中检测灵敏度达0.5 mg/kg，并实现了现场、大范围区域的检测以及土壤下埋藏1,3-DNB的定位。
【数据】沙中检测灵敏度：0.5 mg/kg；固定化载体：海藻酸钙珠；检测时间点：5、25、40天
讨论与解读
本研究成功开发了基于MexT转录因子的大肠杆菌生物传感器，用于检测爆炸物标志物1,3-DNB。核心发现包括：MexT通过结合双向启动子区域正向调控PP_2827转录；1,3-DNB存在时PP_2827和mexE分别上调近10倍和100倍；优化后的MR5生物传感器（pBR-mexT-P mexT(PP_2827)-luxPleio）在液体中检测灵敏度达0.1 μg/mL。完整CEE系统在沙中检测限为0.5 mg/kg，实现了现场大范围检测和土壤埋藏物的定位。该系统与此前报道的2,4-DNT生物传感器具有互补性，展示了军事应用潜力。
编译者解读
该研究的技术路线值得关注：从转录调控机制解析出发，逐步推进至传感器构建、性能优化和现场应用，形成了一条完整的合成生物学研发链条。选择MexT作为传感元件而非传统的诱导型启动子，拓展了效应物识别元件的选择空间。MR2与MR5的对比揭示了一个重要工程原则——高发光强度未必等于高信噪比，响应比才是衡量检测性能的关键指标。海藻酸钙固定化策略兼顾了菌体活性和信号稳定，为野外部署提供了可行方案。局限在于，现场复杂环境中的干扰物选择性、传感器长期保存的活性衰减等问题仍需进一步验证。该系统与2,4-DNT传感器的互补组合，为未来构建多靶点爆炸物检测平台奠定了基础。
参考来源
Wang Z. A transcription factor-based bacterial biosensor system and its application for on-site detection of explosives. Biosensors and Bioelectronics, 2024. DOI: 10.1016/j.bios.2023.115805
DOI: 10.1016/j.bios.2023.115805