来源：Genetic programming of catalytic Pseudomonas putida biofilms for boosting biodegradation of haloalkanes（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
生物膜在全细胞生物催化中优于浮游态细胞。本研究利用恶臭假单胞菌KT2440中c-di-GMP信号网络，构建了受环己酮调控的遗传装置，可人为控制细菌生物膜的形成与解离。通过异源表达E. coli的YedQ二鸟苷酸环化酶或YhjH磷酸二酯酶，实现了对生物膜形态的编程控制，并成功将合成操纵子AHDO导入该菌株，用于1-氯丁烷的生物降解。研究表明，添加环己酮后，工程菌形成具有高脱卤酶活性的生物膜，为合成形态学应用于生物催化提供了首个实例。
研究背景
恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）是一种广泛定殖于土壤的环境革兰氏阴性菌，能够代谢多种天然及合成有机化合物。凭借其突出的污染物降解能力，该菌被广泛研究用于工业和环境应用。特别是KT2440菌株——甲苯降解野生型菌株mt-2的衍生物——具有在多种难降解化合物上生长、耐受溶剂/抗生素/重金属以及高还原力可用性等优良特性，使其成为工程化苛刻氧化还原反应的优选平台。
然而，KT2440生物膜形成能力较弱且难以预测，这在一定程度上限制了其生物技术应用。细菌浮游态与生物膜态之间的转变受控于一个调节网络，该网络管理着触发信号c-di-GMP的水平。本研究利用这一特性，设计了一个遗传装置，可人为干预c-di-GMP的合成或降解，从而按需控制生物膜的形成。研究进一步将合成操纵子导入工程菌株，测试其在1-氯丁烷生物降解中的表现。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株列于表1。E. coli HB101携带质粒pRK600，作为三亲本杂交的辅助菌，常规培养于LB培养基中。P. putida于30°C在M9基本培养基中培养，添加2mM MgSO₄，以0.4%（w/v）葡萄糖或琥珀酸作为唯一碳源。根据需要向培养基中添加卡那霉素（Km，50μg ml⁻¹）、链霉素（Sm，80μg ml⁻¹）、氯霉素（Cm，30μg ml⁻¹）、庆大霉素（Gm，10μg ml⁻¹）和/或四环素（Tc，15μg ml⁻¹）。卤代烷烃脱卤酶活性测定中，细胞在低氯化物M9基本培养基（M9C培养基）中培养，该培养基以(NH₄)₂SO₄替代NH₄Cl、以Na₂SO₄替代NaCl。生长情况通过测量600nm处光密度（OD₆₀₀）估算，必要时对培养液进行稀释。摇瓶培养在125ml锥形瓶中进行，培养基体积不超过瓶标称体积的五分之一。静态培养不摇动，摇瓶培养在170rpm下振荡。除非文中另有说明，环己酮和异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）分别以1mM浓度添加至培养物中，用于诱导ChnR和LacI^Q为基础的表达系统。
【数据】培养基：LB/M9基本培养基；温度：30°C；MgSO₄浓度：2mM；碳源：0.4%（w/v）葡萄糖或琥珀酸；抗生素浓度：Km 50μg ml⁻¹、Sm 80μg ml⁻¹、Cm 30μg ml⁻¹、Gm 10μg ml⁻¹、Tc 15μg ml⁻¹；振荡转速：170rpm；诱导剂浓度：环己酮/IPTG各1mM
2.2 刚果红培养基平板上菌落形态评估
所选P. putida重组菌株的菌落形态在刚果红平板上评估，即M9基本培养基含0.4%（w/v）葡萄糖、1%（w/v）琼脂、40μg ml⁻¹刚果红和20μg ml⁻¹考马斯亮蓝G-250。测定时，携带文本所述质粒的P. putida细胞在含0.4%（w/v）葡萄糖并添加Km的M9基本培养基中生长18小时。将过夜培养物通过离心和重悬洗涤，最终在新鲜M9基本培养基（不含任何碳源）中稀释至OD₆₀₀为0.05，取各细菌悬液5μl点样至新鲜刚果红平板上。环己酮以饱和蒸汽形式提供——将充满环己酮的枪头置于培养皿盖上。菌株在30°C下生长5天，直至肉眼可见聚集菌落形成。使用配备微分干涉对比光学系统的Leica DMR™宽场显微镜（Leica Microsystems GmbH，韦茨拉尔，德国），在25×和500×放大倍数下获取单个菌落图像，并配备Leica Twain™软件。图像用ImageJ 1.46r软件处理。
【数据】刚果红浓度：40μg ml⁻¹；考马斯亮蓝G-250浓度：20μg ml⁻¹；过夜培养时间：18h；稀释OD₆₀₀：0.05；点样量：5μl；培养时间：5天；温度：30°C
2.3 DNA技术与质粒构建
本研究所用全部质粒列于表1。PCR扩增DNA、限制性内切酶消化、连接及其他标准克隆操作均遵循成熟方案及制造商具体说明。所有质粒构建物通过Sanger DNA测序确认。
【数据】测序方法：Sanger DNA测序
#### 2.3.1 用于调控E. coli二鸟苷酸环化酶和磷酸二酯酶基因表达的质粒构建
用于严格调控生物膜形成相关基因表达的质粒构建如下。编码YedQ环化酶的基因以pYedQ质粒为模板PCR扩增，引物为yedQ-F [5′-AAA CCT AGG TTA GGA GGA AAA ACA CGT GCA GCA CGA GAC AAA AAT G-3′，AvrII识别位点加下划线，合成Shine-Dalgarno（SD）序列用斜体表示]和yedQ-R（5′-AAA GAA TTC TTA AGC GTT ATC GCT CGC-3′，EcoRI识别位点加下划线），以AvrII/EcoRI片段克隆至pSEVA2311，获得质粒pSYedQ。编码YhjH磷酸二酯酶的基因以pYhjH质粒为模板PCR扩增，引物为yhjH-F（5′-AAA GAG CTC TTA GGA GGA AAA ACA TAT GAT AAG GCA GGT TAT CC-3′，SacI识别位点加下划线，合成SD序列用斜体表示）和yhjH-R（5′-AAA GGA TCC TTA TAG CGC CAG AAC CG-3′，BamHI识别位点加下划线），以SacI/BamHI片段克隆至pSEVA2311和pSEVA424，分别获得质粒pSYhjH和pSLacH。
【数据】模板质粒：pYedQ、pYhjH；限制性内切酶：AvrII/EcoRI、SacI/BamHI；载体：pSEVA2311、pSEVA424
#### 2.3.2 用于烷基卤化物降解的合成操纵子构建
合成操纵子AHDO（Alkyl Halide Degradation Operon）涵盖来自Pseudomonas pavonaceae 170菌株的DhaA和CaaD1/2卤代烷烃脱卤酶编码基因。dhaA、caaD1和caaD2的组成型表达通过将表达质粒pAHDO中的KpnI/HindIII DNA片段转移至携带组成型合成P_EM7启动子的pSEVA4413中实现，获得质粒pSAHDO。在pSAHDO中，dhaA、caaD1和caaD2的表达受P_EM7启动子的转录控制，以确保重组菌中具有足够高的脱卤酶活性。
【数据】限制性内切酶：KpnI/HindIII；载体：pSEVA4413；启动子：P_EM7（组成型合成启动子）
#### 2.3.3 用于体内c-di-GMP评估的报告菌株构建
P. putida KT-BG-PelA（表1）作为分析胞内c-di-GMP含量的全细胞生物传感器，构建过程如下：已知响应胞内c-di-GMP浓度的Pseudomonas aeruginosa PAO1的P_pelA启动子，以AvrII/PacI扩增子克隆至mini-Tn7载体pBG中，获得质粒pBG-PelA。该质粒中携带P_pelA-BCD2-msf•GFP转录融合的合成Tn7转座子，通过四亲本杂交 mobil化 至野生型P. putida KT2440染色体中，获得P. putida KT-BG-PelA。为通过P_pelA启动子活性定性估计胞内c-di-GMP浓度，将质粒pSEVA2311、pSYedQ和pSYhjH通过三亲本杂交转移至P. putida KT-BG-PelA。重组菌在补充Km、0.4%（w/v）葡萄糖和1mM环己酮的M9基本培养基中于30°C静态过夜培养。msf•GFP信号通过将摇瓶置于Safe Imager™ 2.0蓝光透射照明器上检测。图像在明场或荧光模式下用Nikon D60相机获取。
【数据】载体：mini-Tn7载体pBG；启动子：P_pelA（铜绿假单胞菌PAO1）；荧光蛋白：msf•GFP；温度：30°C；环己酮浓度：1mM；葡萄糖：0.4%（w/v）
2.4 流式细胞术单细胞分析
使用MACSQuant™ VYB细胞仪进行msf•GFP分析和定量。采用二极管泵浦固态Ar激光器，在488nm激发msf•GFP，荧光信号通过525±40nm带通滤波器收集。为通过P_pelA启动子活性定量估计胞内c-di-GMP浓度，将质粒pSEVA2311、pSYedQ和pSYhjH通过三亲本杂交转移至P. putida KT-BG-PelA。重组菌在补充Km、0.4%（w/v）葡萄糖和1mM环己酮的M9基本培养基中于30°C静态过夜培养。取过夜培养物1ml，用过滤的1×磷酸盐缓冲液（1× PBS；8g l⁻¹ NaCl、0.2g l⁻¹ KCl、1.4g l⁻¹ Na₂HPO₄和0.2g l⁻¹ KH₂PO₄，pH 7.4）洗涤三次，用1× PBS重悬后进行流式细胞术分析。每个样品至少分析20,000个细胞，数据用FlowJo v. 9.6.2软件处理。
【数据】激发波长：488nm；发射滤光片：525±40nm；PBS成分：8g l⁻¹ NaCl、0.2g l⁻¹ KCl、1.4g l⁻¹ Na₂HPO₄、0.2g l⁻¹ KH₂PO₄，pH 7.4；分析细胞数：≥20,000个/样品
2.5 生物膜测定与荧光显微镜
生物膜形成通过结晶紫测定法定量。细胞在96孔微量滴定板中培养。
【数据】测定方法：结晶紫法；培养容器：96孔微量滴定板
研究结果
3.1 利用环己酮响应表达系统操控*P. putida* KT2440的生物膜形成与解离
P. putida KT2440虽是工程化多种生物转化的通用宿主，但该菌株生物膜形成能力弱且难以预测，这种情况可能对生物技术应用构成不利因素。本研究旨在控制P. putida细胞对固体表面的附着，以提升其催化能力并便于在整合生物过程中操作。为此，我们开发并植入了一个遗传插件装置，接管P. putida决定c-di-GMP合成与降解的内源转录和代谢子网络。如此，该第二信使的胞内水平（以及细菌形成生物膜的能力）便受控于外源信号（如化学诱导剂）的人为添加。
所用载体为pSEVA2311质粒，其中来自Acinetobacter johnsonii的环己酮响应ChnR调节子和P_chnB启动子已根据SEVA（标准欧洲载体架构）规则标准化。ChnR/P_chnB表达系统的输出已在E. coli中用荧光报告子进行了参数化。为改善P. putida的生物膜形成能力，我们将E. coli的yedQ克隆至pSEVA2311中，获得质粒pSYedQ。同时，同一表达系统用于驱动E. coli yhjH编码的磷酸二酯酶YhjH的表达，克隆至pSEVA2311获得pSYhjH。这两种酶控制c-di-GMP的周转，允许使用者随意改变该第二信使的水平。具体而言，含GGDEF结构域的YedQ驱动GTP形成c-di-GMP；而含EAL结构域的YhjH催化c-di-GMP分解为5′-磷酸鸟苷酰-(3′→5′)-鸟苷（pGpG），最终生成GMP。
我们将质粒（pSEVA2311作为对照、pSYedQ和pSYhjH）通过三亲本杂交转移至P. putida KT2440，并通过抗生素筛选和限制性酶切质粒DNA确认其存在。初步评估YedQ功能时，P. putida KT2440/pSYedQ在含葡萄糖的M9基本培养基中生长，静态孵育24小时后，附着细胞用结晶紫染色以定性观察生物膜形成。该简单试验显示，携带YedQ的重组菌形成的生物膜量比对照菌株更丰富，且在添加环己酮的培养物中生物膜形成更为明显。
为定量评估新质粒构建物的功能，我们在糖酵解或糖异生生长条件下测定了各菌株的生物膜形成。携带pSYedQ或pSEVA2311的P. putida细胞在含葡萄糖或琥珀酸的M9基本培养基中于多孔板中静态生长24小时。细胞在无诱导剂或暴露于不同浓度环己酮的条件下培养。生物膜形成用结晶紫法定量。结果表明，携带pSYedQ的P. putida KT2440在所有测试条件下均比携带空载体的对照菌株形成更多生物膜，且生物膜产生水平与诱导剂浓度成正比。琥珀酸培养物中的生物膜形成略高于葡萄糖培养物。在本实验使用的最高环己酮浓度（5mM）下，P. putida KT2440/pSYedQ在葡萄糖和琥珀酸培养物中的生物膜指数分别比未诱导培养物高1.8倍和2.1倍。值得注意的是，携带空pSEVA2311载体的对照P. putida菌株与未诱导的表达yedQ重组菌形成相同量的生物膜，这进一步表明ChnR/P_chnB表达系统的渗漏表达水平很低。
当在携带pSYhjH（即表达磷酸二酯酶结构域）的P. putida KT2440培养物中测量生物膜形成时，观察到与YedQ相反的效果：随着诱导剂浓度增加（对应磷酸二酯酶活性逐渐升高），重组菌产生的生物膜减少。如前所述，所有受检菌株在琥珀酸作为碳源时具有更高的生物膜形成能力。P. putida KT2440中yhjH的过表达在最高环己酮浓度下，与未诱导对照条件相比，葡萄糖和琥珀酸培养物中的细胞附着分别降低了64%和53%。YhjH过表达对生物膜解离的效果似乎不如YedQ诱导细胞附着那样显著。可能的原因之一是某些磷酸二酯酶受产物积累（特别是pGpG）的已知抑制作用。
最后，为进一步评估ChnR/P_chnB表达系统在这些工作条件下的严密性，我们在这组实验中引入了一个额外对照——yhjH磷酸二酯酶的转录由常用的LacI^Q/P_trc表达系统控制（即质粒pSYLacH）。两种表达系统的并排比较显示，ChnR/P_chnB的基础表达低于LacI^Q/P_trc，特别是在琥珀酸培养物中。在这种情况下，P. putida KT2440/pSYLacH在无IPTG时生物膜形成下降了28%。除了已知的LacI^Q/P_trc表达系统渗漏外，越来越多的实验证据指向IPTG作为诱导剂时的毒性效应。有趣的是，即使环己酮以5mM作为ChnR/P_chnB表达系统的诱导剂添加，我们也没有观察到细菌生长的任何损害。
【数据】培养时间：24h；最高环己酮浓度：5mM；生物膜指数（葡萄糖）：1.8倍；生物膜指数（琥珀酸）：2.1倍；YhjH过表达细胞附着降低（葡萄糖）：64%；YhjH过表达细胞附着降低（琥珀酸）：53%；pSYLacH无IPTG时生物膜形成降低：28%
3.2 过表达yedQ的重组*P. putida* KT2440生物膜形成与菌落形态的显微镜分析
为通过显微镜分析生物膜结构，我们首先将pSYedQ或对照载体pSEVA2311通过三亲本杂交引入P. putida KT2440 Δall-Φ GFP。该菌株是无前噬菌体P. putida KT2440 Δall-Φ的衍生株，是多种代谢操作的稳健且更具活力的细菌底盘，通过染色体插入组成型表达gfp2——因此可在荧光显微镜实验中轻松可视化。在生物膜形成的内在能力方面，与亲本KT2440菌株相比未检测到重大差异。由于P. putida KT2440 Δall-Φ GFP在糖酵解条件下生长良好，我们采用了一种测定方案：将玻璃盖玻片置于补充葡萄糖和1mM环己酮的M9基本培养基中，接种稀释的P. putida KT2440 Δall-Φ GFP/pSYedQ培养物。
讨论与解读
虽然生物膜在临床环境中常被视为有害，但在工业和环境生物技术中具有重要价值。表面附着生物质的应用——如生物催化、有毒金属去除、微生物燃料电池产电——近年来受到广泛关注。这是因为生物膜能够以浓缩的物理形式递送目标活性，比液体悬浮中的细菌更易操作。然而，生物膜形成/解离的自然过程极为复杂，代谢工程几乎未曾考虑将这一特性纳入任何提高催化效率的遗传设计中。
本研究证明，无论Pseudomonas菌株天然产生生物膜的能力如何、也无论其多么不可预测，都可以通过人为接管管理胞内c-di-GMP水平的内源网络，将这一性状完全置于使用者的需求之下。我们通过使用一个可诱导且严格控制的遗传装置，异源表达二鸟苷酸环化酶和磷酸二酯酶基因实现了这一目标。据我们所知，上述工作是合成形态学用于生物催化的首个实例——所涉生物材料的物理形式已被有意编程，同时有目的地设计其生化活性。
编译者解读
本研究巧妙地将"形态工程"与"催化工程"合二为一——通过一个诱导型遗传插件同时控制生物膜的"有无"和降解酶的"表达"。选择c-di-GMP作为调控枢纽是明智之举，因为该信号分子在多种细菌中保守，策略具有可移植性。环己酮诱导系统相比IPTG系统展现出更低的渗漏表达，这对生物膜这种"开关型"性状尤为关键。局限在于，目前仅在模式底物1-氯丁烷上验证了功能，对更复杂的卤代污染物的降解效果尚待探索。从合成生物学应用角度看，这一"可按需开启的生物催化膜"概念，为连续流反应器中的固定化催化提供了新的设计思路。
参考来源
Benedetti, I. (2016). Genetic programming of catalytic Pseudomonas putida biofilms for boosting biodegradation of haloalkanes. Metabolic Engineering, 2016. DOI: 10.1016/j.ymben.2015.11.004
DOI: 10.1016/j.ymben.2015.11.004