来源：Enhanced surfactant detection using microbial biosensor: new applications of conducting polymers and their nanocomposites（Measurement）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
表面活性剂年全球消耗量超1500万吨，约60%最终进入水环境，对生态系统构成威胁。本研究系统比较了五种导电聚合物与七种微生物的组合方案，筛选出聚中性红（pNR）与恶臭假单胞菌VKM B-973的最佳搭配，并通过单壁碳纳米管（SWCNT）修饰电极，将检出限降至0.061 mg/dm³，传感器可稳定工作15天。该平台在河水实际样品中验证了与传统方法无显著差异的检测结果。
研究背景
表面活性剂通过降低相间表面张力发挥作用，广泛用于工业生产、农业、医药、科研及日用化学品领域。全球年消耗量超过1500万吨，约60%最终进入水环境。阴离子表面活性剂（ANS）在自然水体中频繁检出——水中ANS浓度超过2 mg/L时，会加速生化耗氧速率，影响水生生物生存；5–15 mg/L的浓度可导致约50%的鱼类幼体及甲壳类动物死亡。发展可靠的ANS分析方法对生态安全至关重要。
研究方法
2.1 试剂与材料
微生物培养使用葡萄糖、胰蛋白胨、蛋白胨（Panreac，西班牙）、酵母提取物（Helicon，俄罗斯）、氯化钠、甘油、NaH₂PO₄、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、K₂HPO₄、亮氨酸（Dia-m，俄罗斯）、琼脂（Panreac，西班牙）。工作电极由石墨粉（Fluka，德国；粒径75 µm，纯度99.997%）、矿物油（Fluka，德国）作为粘合剂、透析膜（Roth，德国；截留分子量14 kDa）作为密封层组成。其他试剂包括二茂铁（Aldrich，德国）、硫堇（TN）（Dia-m，俄罗斯）、中性红（NR）（Dia-m，俄罗斯）、PEDOT:PSS（Krasnaya Zvezda Trading House，俄罗斯）、苯胺（99%，Lenreactive，俄罗斯）、过硫酸铵（98%，Krasnaya Zvezda Trading House，俄罗斯）和吡咯（99%，Krasnaya Zvezda Trading House，俄罗斯）。纳米材料包括氧化石墨烯（NanoTechCenter LLC，莫斯科坦波夫，俄罗斯）、单壁碳纳米管（SWCNT）（Carbon Black，俄罗斯，管长1–10 µm，直径1.5 nm，外比表面积450 m²/g）、多层碳纳米管（MWCNTs）（NanoTechCenter，俄罗斯，管长1–10 µm，直径8–30 nm，外比表面积约270 m²/g）。缓冲体系为33 mM钠-钾磷酸盐溶液（pH 6.8），由KH₂PO₄和Na₂HPO₄（Dia-m，俄罗斯）配制。KBr（OOO Dia-m，俄罗斯）用于制备红外光谱压片。
【数据】石墨粉粒径：75 µm；纯度：99.997%；透析膜截留：14 kDa；SWCNT管长：1–10 µm，直径：1.5 nm，比表面积：450 m²/g；MWCNT管长：1–10 µm，直径：8–30 nm，比表面积：270 m²/g；缓冲液：33 mM磷酸盐，pH 6.8
2.2 微生物培养
菌株Acinetobacter baumannii VKM B-3190、Comamonas testosteroni VKM B-124、Pseudomonas sp. VKM B-96、Pseudomonas putida VKM B-973由全俄微生物保藏中心IBFM RAS提供。Paracoccus yeei VKM B-3302由研究团队从污水处理厂活性污泥中分离并描述于文献[55]。Pseudarthrobacter scleromae VKM Ac-2995和Arthobacter halodurans VKM Ac-2997从污水处理厂活性污泥中分离[56]。微生物培养在ES-20/60摇床培养箱（BioSan，拉脱维亚）中进行，参数为28°C、180 rpm、18–20 h。生长培养基含1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.05%酵母提取物。随后用TG16WS离心机（Polycom LTD，俄罗斯）在7000 rpm离心10 min收集菌体。所得菌体沉淀用30 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.8）洗涤，储存于−4°C微离心管中。样品制备过程中还使用了Mini Spinplus离心机（Eppendorf，俄罗斯）。
【数据】培养温度：28°C；转速：180 rpm；时间：18–20 h；培养基：1%葡萄糖+0.5%蛋白胨+0.05%酵母提取物；离心：7000 rpm，10 min；洗涤缓冲液：30 mM磷酸盐，pH 6.8；储存温度：−4°C
2.3 pTN和pNR的合成
导电聚合物通过电化学沉积方式修饰到石墨糊电极（GPE）表面。聚合前，工作电极在0.1 M KNO₃溶液中通过循环电位扫描（0.0至+1.0 V，vs. Ag/AgCl）稳定10圈，直至获得稳定的伏安响应。pTN的合成在含1 mM TN和0.1 M KNO₃的0.025 M四硼酸钠缓冲液（pH 9.0）中进行。电聚合在−1.0至+1.0 V电位范围、50 mV s⁻¹扫描速率下循环30圈。pNR的形成则在含0.001 M NR和0.1 M KNO₃的0.05 M磷酸钾钠缓冲液（pH 5.6）中，同一电位范围（−1.0至+1.0 V）、50 mV s⁻¹下循环20圈。所得pTN和pNR薄膜的分子结构见图2（B、C）。
【数据】pTN合成：1 mM TN，0.1 M KNO₃，0.025 M四硼酸钠缓冲液，pH 9.0，30圈循环，−1.0至+1.0 V，50 mV s⁻¹；pNR合成：0.001 M NR，0.1 M KNO₃，0.05 M磷酸钾钠缓冲液，pH 5.6，20圈循环，−1.0至+1.0 V，50 mV s⁻¹
2.4 PPy的合成
将0.1 g吡咯溶于25 cm³双蒸水，另将0.513 g过硫酸铵溶于25 cm³双蒸水。两种溶液混合后静置24 h。所得聚合物产物经真空泵抽滤，依次用三份25 cm³的5%碳酸钠水溶液洗涤，再用25 cm³双蒸水洗涤。样品在干燥箱中50°C干燥。所得聚合物结构见图2D。
【数据】吡咯用量：0.1 g/25 cm³水；过硫酸铵：0.513 g/25 cm³水；反应时间：24 h；洗涤：3×25 cm³ 5% Na₂CO₃ + 25 cm³双蒸水；干燥：50°C
2.5 PANI的合成
将苯胺（0.05 mol）溶于20 cm³浓度为1 mol/dm³的盐酸中。在搅拌下向所得溶液加入20 cm³的0.05 mol过硫酸铵水溶液。结果形成深绿色沉淀，经滤纸过滤，依次用丙酮和蒸馏水洗涤。PANI结构见图2E。
【数据】苯胺：0.05 mol/20 cm³ 1 mol/dm³ HCl；过硫酸铵：0.05 mol/20 cm³水
2.6 微生物工作电极制备
工作电极为GPE，固定化微生物和二茂铁介体。制备过程：将90 mg石墨粉与一定体积的二茂铁丙酮溶液（10 mg二茂铁溶于500 µL丙酮）混合。丙酮蒸发后加入40 µL矿物油，充分揉捏成均匀糊状。将此糊状物填充到塑料注射器筒体中，工作面积为6.3 mm²。基于PPy、PANI和PEDOT:PSS的电极通过向GPE表面施加10 µl导电聚合物溶液制备。干燥后，将10 µl细菌悬液施加到表面，干燥后用透析膜覆盖。pNR和pTN基电极的制备：将10 µl细菌悬液施加到电聚合GPE聚合物表面，干燥后覆盖透析膜。
【数据】石墨粉：90 mg；二茂铁：10 mg/500 µL丙酮；矿物油：40 µL；工作面积：6.3 mm²；聚合物用量：10 µl；菌液用量：10 µl
2.7 碳纳米材料修饰电极
电极用氧化石墨烯、SWCNT和MWCNT等纳米材料修饰，可显著改善电化学特性。修饰时将10 µl纳米材料悬液（预先超声分散）施加到电极表面，之后再施加导电聚合物和微生物。
【数据】纳米材料悬液用量：10 µl；超声预分散
2.8 电流-电压依赖关系记录
所有伏安测量均采用三电极配置，连接Corrtest恒电位仪（Corrtest，武汉，中国）。电解池由固定化细菌的GPE工作电极、铂丝对电极和饱和Ag/AgCl参比电极组成。所有电位均参照该Ag/AgCl电极。分析在含0.15 M磷酸盐缓冲液（pH 6.8）的25 cm³电化学池中、20°C条件下进行。
【数据】电解池体积：25 cm³；缓冲液：0.15 M磷酸盐，pH 6.8；温度：20°C；参比电极：饱和Ag/AgCl
2.9 电化学阻抗谱
电化学阻抗谱（EIS）同样采用三电极体系。不同修饰GPE作为工作电极，铂辅助电极和饱和Ag/AgCl参比电极。使用CS310M恒电位仪（Corrtest，武汉，中国）在15 mL电解池、20°C下记录阻抗谱。支持电解质为33 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.8）。EIS测量在掺入氧化还原介体的正式电位下进行，频率扫描范围40 kHz至0.2 Hz，交流振幅10 mV。阻抗数据用ZView软件（中国）分析并建立等效电路模型。
【数据】电解池体积：15 mL；温度：20°C；缓冲液：33 mM磷酸钾，pH 6.8；频率范围：40 kHz–0.2 Hz；AC振幅：10 mV
2.10 安培型生物传感器测量
生物传感器信号通过电化学恒电位仪转换器记录电流强度对时间的关系——使用CS310M恒电位仪（Corrtest，武汉，中国）连接电极。测量电位由伏安图确定。测量在浸入5.0 cm³分析池的两电极体系中进行，池内含磷酸盐缓冲液（pH = 6.8），磁力搅拌器持续搅拌，测量温度为——
【数据】分析池体积：5.0 cm³；缓冲液：磷酸盐，pH 6.8；搅拌：磁力搅拌器持续搅拌
研究结果
3.1 表面活性剂测量方法的选择
使用微生物生物传感器检测表面活性剂时，采用经恶臭假单胞菌VKM B-973和具有介体性质的pNR导电聚合物修饰的工作电极（图3）。电极与银氯化银参比电极一同连接至恒电位仪。在0.2 V电位下产生电流。加入SDS后，SDS分子吸附并预浓缩到pNR聚合物表面，使待测物靠近固定化微生物细胞。随后，被吸附的十二烷基硫酸酯被细菌烷基硫酸酯酶水解为十二醇。后者扩散通过细胞膜，引起细胞呼吸活性变化。表面活性剂氧化产生的电子将氧化态聚合物（pNROx）还原为还原态（pNRRed）。还原态介体随后在SWCNT修饰的电极表面重新氧化，产生可测量的阳极电流。生物传感器响应的幅度取决于注入SDS的浓度[61,62]。
现有生物传感器在检测表面活性剂时面临干扰、生物污染和信号稳定性等问题[63,64]。表面活性剂与导电聚合物在电极表面的相互作用应导致其在表面富集，从而提高灵敏度。然而，聚集体的形成可能影响信号重现性[65]。尽管表面活性剂具有在界面（即溶液表面）富集的特性，但灵敏检测仍然可行。这一特性带来了开发和应用生物传感器技术时必须考虑的若干挑战。
磁力搅拌器的混合速率影响生物传感器检测表面活性剂的效果（图4）。处理乳液时，改变混合速率会影响液滴尺寸。不同速率下液滴的大小和稳定性可能不同。此外，磁场强度可根据被搅拌物质调整。使用磁力混合器时，保持一致的旋转速率至关重要[66]。为确认生物传感器检测表面活性剂的可行性，进行了混合对分析池中表面活性剂浓度影响的实验（图4）。结果表明，混合时可以实现表面活性剂在分析池体积中的均匀分布。从图4的曲线可以看出，混合速率在使用微生物生物传感器测定表面活性剂时起重要作用。在最佳混合速度下，表面活性剂在溶液中分布更均匀，有助于与位于分析池中心的生物传感器受体元件更准确地相互作用。平均混合速度的增加增加了微生物与分析物之间的接触，可提高传感器灵敏度。低混合速率导致表面活性剂在分析池表面积累，导致分析结果不正确。过快的速度可能对传感器稳定性产生不利影响，并加速电活性组分从电极扩散离开，因此所有后续测量均在选定的1300 RPM混合速率下进行。
【数据】工作电位：0.2 V；混合速率：1300 RPM；SDS水解产物：十二醇
3.2 用于构建生物分析系统的微生物筛选
为构建生物传感器，使用了7株微生物：Comamonas testosteroni VKM B-1241、Pseudomonas sp. VKM B-96、Arthobacter halodurans VKM Ac-2995、Pseudarthrobacter scleromae VKM Ac-2995、Acinetobacter baumannii VKM B-3190、Pseudomonas putida VKM B-973和Paracoccus yeei VKM B-3302。据文献报道，这些细菌能够代谢表面活性剂，可用于其检测[36,56,67,68]。本研究使用二茂铁作为介体，主要因为其氧化还原电位在电化学反应中不受介质pH影响而保持稳定，且在水中仅微溶[69]。在250 mV工作电位下获得清晰的生物传感器输出信号，证明所研究的微生物可以利用这种人工电子受体[70]。
为确保生物传感器法测定表面活性剂的结果与标准方法高度相关，需保证所开发的生物传感器系统能检测尽可能窄范围的有机物质。有效生物传感器的选择基于受体对微生物介体的特异性。为实现表面活性剂测定的高准确度，测试了一系列氧化微生物和多种表面活性剂（图5A和5B）。表1和S1–S4提供了所有研究微生物的计量学和动力学数据。校准曲线分析表明，基于恶臭假单胞菌和睾丸酮丛毛单胞菌的生物传感器能够测定最低浓度的SDS，这对表面活性剂分析很有前景。
基于底物特异性数据可以得出结论：恶臭假单胞菌VKM B-973在所有细菌中氧化最少种类的有机物质（33种中仅13种）。对广谱有机化合物的低代谢活性是一个关键优势，因为它最大限度地减少了环境水样中常见有机杂质的潜在干扰，从而提高了生物传感器响应针对表面活性剂的选择性和可靠性。因此，这些微生物更适合环境监测中天然水系的表面活性剂检测。
【数据】工作电位：250 mV；恶臭假单胞菌氧化底物数：13/33
3.3 用于构建生物分析系统的纳米材料选择
GPE因其高导电性和化学稳定性而广泛用于电化学领域。然而，通过碳纳米材料（如氧化石墨烯、SWCNT和MWCNT，经不同基团功能化，如–COOH和–CH₂）修饰可显著改善其性能。这种修饰可创建纳米结构化表面，提高电极在电化学过程中的效率[58,71]。经不同纳米材料修饰的GPE表面形貌通过SEM表征，见图6。
纳米材料对所得电极电化学性能的影响通过线性电位扫描循环伏安法和电化学阻抗谱研究。基于三种不同电子传递介体存在下GPE电子传递速率的比较，选择了不同的纳米材料修饰方案。异相电子传递常数和电荷传递电阻作为纳米材料的选择标准，如我们前期工作所述[58,69,72]。结果见图7。
碳纳米材料修饰GPE是制造高效纳米结构电极的有前景方向。这类电极具有更高的异相电子传递速率常数和更低的电荷传递电阻，适用于现代电化学器件（如传感器）。与未修饰MWCNT相比，化学修饰MWCNT体系中异相电子传递常数较低，可归因于功能化后结构变化以及缺陷可能对纳米材料电子传输性能产生负面影响[73]。SWCNT修饰电极时观察到电荷传递电阻显著降低和异相速率常数增加，这可能归因于电极有效表面积的更大增加——
【数据】SWCNT修饰：电荷传递电阻显著降低，异相速率常数增加；MWCNT功能化后异相电子传递常数降低
讨论与解读
本研究开发的基于pNR聚合物和恶臭假单胞菌的高灵敏生物传感器能够检测水中低浓度表面活性剂。SWCNT的引入显著改善了电化学特性，提高了系统的灵敏度和稳定性。本研究首次证明了通过导电表面吸附和富集实现表面活性剂灵敏且可重现检测的可能性。实际测试证实了生物传感器的可靠性，与传统分析方法结果无显著差异。
需要指出的是，本研究验证的是实验室原型。面向现场应用的规模化仍需解决复杂基质中的长期稳定性、聚合物纳米复合材料的可重现制造工艺等问题。此外，当前生物传感器通过烷基硫酸酯酶活性靶向阴离子表面活性剂，未来可通过固定化不同微生物菌株，将"导电聚合物-纳米材料"平台拓展至其他污染物类别。
编译者解读
从合成生物学应用视角看，本研究的关键创新在于将"导电聚合物富集"与"微生物代谢转化"耦合，巧妙解决了表面活性剂检测中灵敏度与选择性的矛盾。pNR兼具富集与介体双重功能，SWCNT修饰进一步加速电子传递，这种"材料-生物"协同设计值得借鉴。局限在于实验室原型距离现场应用尚有距离，且当前平台仅覆盖阴离子表面活性剂。未来若能在聚合物合成中引入生物可识别元件，或利用合成生物学手段改造烷基硫酸酯酶的表达与底物谱，有望实现多类别污染物的同时检测。
参考来源
Medvedeva A. Enhanced surfactant detection using microbial biosensor: new applications of conducting polymers and their nanocomposites. Measurement, 2026. DOI: 10.1016/j.measurement.2026.120420
DOI: 10.1016/j.measurement.2026.120420