基于噬菌体M-PAP1的双模式传感器

来源：Phage-based dual-mode sensor using ECL and EIS for sensitive detection of Pseudomonas Aeruginosa（Bioelectrochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

铜绿假单胞菌是医院感染的主要病原体之一，其抗生素耐药性问题日益严峻，亟需快速灵敏的检测手段。本研究构建了一种基于噬菌体M-PAP1与羧基化多壁碳纳米管（MWCNT-COOH）修饰丝网印刷碳电极的生物传感器，同时采用电化学发光（ECL）和电化学阻抗谱（EIS）双模式信号输出。该传感器检测限低至0.755 CFU ml⁻¹，线性范围覆盖2.28–10¹⁰ CFU ml⁻¹，在人工尿液样本中回收率达92%–97%，为临床快速诊断提供了新方案。

研究背景

铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性条件致病菌，凭借其抗生素耐药性和多种毒力因子对人类健康构成严重威胁。它是囊性纤维化患者呼吸道感染和烧伤患者严重感染的常见病因，也频繁引发肺炎、尿路感染和手术部位感染等医院获得性感染。每年有数百万人感染该菌，临床和水源性感染是最普遍的感染形式。尽管各方持续努力对抗这些有害微生物，临床、食品和环境感染的发生率仍在上升，凸显了全球健康监测和预防措施的紧迫性。

铜绿假单胞菌被列为高危耐药菌，对公共卫生构成重大风险。耐药性趋势分析显示，耐药感染呈上升态势，尤其是革兰氏阴性菌。文献证实，2007年至2015年间欧洲碳青霉烯耐药不动杆菌属的耐药性显著增加，预测到2035年高收入国家对三线抗菌药物的耐药性可能翻倍。世界卫生组织已将铜绿假单胞菌列入急需新型检测和治疗策略的病原体清单。

现有检测方法多依赖培养鉴定，耗时长、灵敏度有限。基于噬菌体的生物传感器因噬菌体对宿主菌的高度特异性识别能力而受到关注。本研究将噬菌体M-PAP1与MWCNT-COOH修饰电极结合，构建ECL/EIS双模式传感平台，旨在实现对铜绿假单胞菌的快速、灵敏、特异的定量检测。

研究方法

2.1 化学试剂与仪器

用于噬菌体分离和表征的宿主菌为铜绿假单胞菌ATCC 27853，购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。大肠杆菌来自EGE大学药学院微生物学系，用于选择性研究的非特异性菌（恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌）来自EGE大学生物化学系。牛血清白蛋白（BSA）购自北京百奥思科生物技术有限公司（Bioss，中国）。1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）由阿拉丁化学有限公司（中国）提供。N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和三（联吡啶）氯化钌（II）购自Sigma-Aldrich化学有限公司（美国）。多壁碳纳米管（MWCNTs）和三丙胺（TPA）同样购自Sigma-Aldrich化学有限公司（美国）。TSB（胰蛋白胨大豆肉汤）培养基由Sigma-Aldrich化学有限公司（美国）提供。整个研究中使用超纯水（18.2 MΩ），由ELGA PURELAB系统纯化。磷酸盐缓冲液（PBS，Sigma-Aldrich）片剂购自商业渠道，溶解于超纯水中制备10 mM溶液，含137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄和1.8 mM KH₂PO₄。ECL信号使用ECL分析仪（μStat ECL电化学发光仪/STATECL/Metrohm科技有限公司）检测。荧光显微照片使用FV 1200激光共聚焦荧光显微镜（Olympus有限公司，日本）获取。EIS使用IVIUM Compact Stat电化学工作站进行。商业丝网印刷碳电极（DRP-110-U75，Metrohm/DropSens）作为传感器平台并按需修饰；工作电极和对电极为碳，参比电极为银。

【数据】宿主菌：铜绿假单胞菌ATCC 27853；PBS浓度：10 mM（含137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄）；超纯水电阻率：18.2 MΩ；电极型号：DRP-110-U75

2.2 铜绿假单胞菌的培养与预处理

用于噬菌体分离和表征的宿主菌为美国典型培养物保藏中心（ATCC）标准菌株27853铜绿假单胞菌。铜绿假单胞菌在Luria-Bertani肉汤中于37°C振荡培养7小时。取1毫升菌液在4500 rpm离心5分钟，用3.0 ml磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤三次。每次分析前新鲜制备细菌。细菌浓度采用标准平板计数法测定。在无菌PBS中制备细菌悬液的系列稀释液，取各稀释度100 μl涂布于LB琼脂平板。37°C孵育24小时后计数菌落。仅使用含30–300个菌落的平板进行计算，原始悬液的CFU ml⁻¹按公式计算：CFU/mL = 菌落数 × 稀释倍数 / 涂布体积（ml）。

【数据】培养温度：37°C；培养时间：7h（肉汤）/24h（平板）；离心：4500 rpm、5 min；洗涤：3.0 ml PBS（pH 7.4）×3次；涂布体积：100 μl；计数范围：30–300 CFU

2.3 噬菌体的分离、扩增与纯化

用于噬菌体分离的水样采集自两个不同地点：一份样品（200 ml）取自海水，另一份（200 ml）取自伊兹密尔海边瀑布的原水。为获得纯化的同质噬菌体群体，采用噬菌斑纯化法。首先，将每份样品100 ml分别装入Falcon锥形管（每管40 ml），在4°C、5000 rpm离心20分钟以去除固体颗粒。离心后，上清液用0.22 μm聚醚砜膜过滤器（ISOLAB）过滤以澄清样品。滤液收集于无菌烧瓶中。每个烧瓶加入100 ml过滤样品与100 ml胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）混合。随后，向每个烧瓶加入50 μl宿主菌铜绿假单胞菌ATCC 27853，混合物在37°C、150 rpm振荡孵育24小时[43]。

扩增后，采用标准双层琼脂法测定噬菌体浓度（噬菌斑形成单位，PFU）[47]。在SM缓冲液中制备纯化噬菌体裂解液的系列稀释液，取各稀释度100 μl与100 μl宿主菌（OD₆₀₀ ≈ 0.5）（分光光度计测定）混合，铺覆于LB琼脂平板上。37°C过夜孵育后计数噬菌斑，计算噬菌体滴度（PFU ml⁻¹）（图S5和S6）。

【数据】水样体积：200 ml×2；离心：4°C、5000 rpm、20 min；滤膜孔径：0.22 μm；TSB体积：100 ml；宿主菌加入量：50 μl；扩增条件：37°C、150 rpm、24h；宿主菌OD₆₀₀：≈0.5；稀释液与宿主菌体积：各100 μl

2.4 MWCNT/PAP1/SPCE传感器的制备

研究中使用丝网印刷碳电极（DRP-110-U75，Metrohm/DropSens，工作电极：碳；辅助电极：碳；参比电极：银）。MWCNT的羧基化依据文献方法并作必要修改。使用含7.5 ml H₂SO₄（98%）和2.5 ml HNO₃（70%）的酸混合物在纳米管外表面引入羧基。为完全羧基化，将2 mg MWCNT在酸性溶液中于80°C超声处理6小时。酸蚀完成后，羧基化MWCNT（MWCNT-COOH）用dH₂O洗涤并真空过滤至pH达7.4以去除残留酸，然后在90°C烘箱中干燥过夜[29]。

电极修饰步骤：将5 μl MWCNT-COOH分散液（1 mg ml⁻¹）滴加至SPCE工作区域，室温孵育30分钟。随后，加入5 μl新鲜配制的EDC-NHS溶液（0.2 M EDC、0.05 M NHS溶于PBS，pH 7.4），孵育30分钟。最后，将5 μl噬菌体溶液固定于MWCNT修饰电极上，室温孵育30分钟。制备好的MWCNT/M-PAP1/SPE传感器用PBS轻轻冲洗以去除未结合的噬菌体，于+4°C保存备用。

【数据】酸混合液：7.5 ml H₂SO₄（98%）+ 2.5 ml HNO₃（70%）；MWCNT用量：2 mg；羧基化条件：80°C、6h超声；干燥：90°C过夜；MWCNT-COOH分散液：1 mg ml⁻¹、5 μl；EDC-NHS溶液：0.2 M EDC、0.05 M NHS、5 μl；噬菌体溶液：5 μl；各步孵育：室温30 min；保存：+4°C

2.5 ECL分析

在设计的电极系统上采用共反应物机制进行ECL分析。发光过程中，发光体可被再生，但共反应物在电化学反应中被消耗（式(1)–(5)）：

(1) TPA → TPA⁺ + e⁻

(2) TPA⁺ → TPA• + H⁺

(3) Ru(bpy)₃²⁺ – e⁻ → Ru(bpy)₃³⁺

(4) Ru(bpy)₃³⁺ + TPA• → Ru(bpy)₃²⁺* + 产物

(5) *Ru(bpy)₃²⁺ → Ru(bpy)₃²⁺ + hν

[Ru(bpy)₃]²⁺/三丙胺（TPA）体系广泛应用于商业ECL免疫分析和DNA分析。[Ru(bpy)₃]²⁺/TPA体系的ECL强度高度依赖溶液pH值。文献中存在大量生物系统ECL应用，因为ECL强度最大值出现在pH 7.5，使其成为生物系统应用的理想选择[30]。[Ru(bpy)₃]²⁺作为发光体（0.5 mM），TPA（40 mM）作为共反应物。ECL测量在优化条件下进行：扫描速度60 mV/s，电位范围0至1.3 V，室温操作，所有测量重复三次以确保可重复性。每组测量计算标准偏差。

【数据】发光体：[Ru(bpy)₃]²⁺ 0.5 mM（ECL）/1 mg ml⁻¹（浓度优化实验）；共反应物：TPA 40 mM；扫描速度：60 mV/s；电位范围：0–1.3 V；温度：室温；重复次数：3次；pH：7.5（最佳）

2.6 EIS分析

EIS测量在5 mM Fe(CN)₆³⁻/⁴⁻存在下进行，频率范围0.1 Hz至100,000 kHz。电位范围设定在−0.2 V至0.8 V之间，扫描速率60 mV/s。每个电极进行三次平行测量，数据使用适当的等效电路拟合以计算电荷转移电阻（Rct）及其他参数。

【数据】探针：5 mM Fe(CN)₆³⁻/⁴⁻；频率范围：0.1 Hz–100,000 kHz；电位范围：−0.2 V至0.8 V；扫描速率：60 mV/s；平行测量：3次

2.7 人工尿液制备

人工尿液AU-Siriraj（pH 6.2）的组成如下：200 mM尿素、1 mM尿酸、4 mM肌酐、5 mM柠檬酸钠（Na₃C₆H₅O₇）、54 mM NaCl、30 mM KCl、15 mM NH₄Cl等（原文节选至此）。

【数据】人工尿液pH：6.2；尿素：200 mM；尿酸：1 mM；肌酐：4 mM；柠檬酸钠：5 mM；NaCl：54 mM；KCl：30 mM；NH₄Cl：15 mM

研究结果

3.1 M-PaP1的生物学表征及其对铜绿假单胞菌的结合行为

噬菌体通常可根据生命周期分为温和型和烈性型。温和噬菌体将基因组整合到宿主细菌中，保持休眠状态直至进入裂解周期。相比之下，烈性噬菌体通过单一裂解周期复制，利用宿主细胞作为生物工厂产生大量子代噬菌体。本研究中，M-PaP1被鉴定为烈性噬菌体，因为在有利于细菌生长的条件下，它裂解宿主菌以释放子代（图S5）。将分离的噬菌体与宿主菌混合并过夜孵育后，在铜绿假单胞菌菌苔上观察到噬菌斑。

【数据】噬菌体类型：烈性噬菌体；宿主菌：铜绿假单胞菌ATCC 27853；孵育：过夜

3.2 电化学表征

在将MWCNT用于传感器系统之前，进行了FTIR测量以确认其成功羧基化，验证MWCNT-COOH的形成（图S1）。表征完成后，使用循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）分析修饰电极，这两种方法均为监测表面修饰的成熟技术[32]。利用可逆氧化还原探针Fe(CN)₆³⁻/⁴⁻研究各修饰过程。CV中MWCNT修饰后峰电流的增加表明纳米管的大表面积和导电网络增强了电子转移。同样，EIS中Rct值的降低证实了界面电子转移的改善。噬菌体固定后，观察到Rct增加，反映了蛋白质层的绝缘效应和电子转移途径的阻碍。

【数据】表征方法：FTIR、CV、EIS；氧化还原探针：Fe(CN)₆³⁻/⁴⁻；MWCNT修饰效应：峰电流↑、Rct↓；噬菌体固定效应：Rct↑

3.3 MWCNT/M-PAP1/SPE的电化学行为

在噬菌体修饰的SPCE系统中，电极通过多个步骤依次修饰。首先，SPCE表面涂覆优化浓度的MWCNT。接下来，将EDC-NHS溶液施加于PBS缓冲液中的MWCNT修饰电极上。将溶于PBS并用Nanodrop仪器定量噬菌体溶液施加到MWCNT-EDC-NHS修饰的传感器表面，使其固定到电极上。每个修饰步骤后，进行CV测量以监测电流响应变化（图1A）。

如图1A所示，裸SPCE表面经MWCNT修饰后电流增加，这可能是由于MWCNT增加的比表面积和导电性。随后EDC-NHS修饰导致电流略有下降，而噬菌体固定到MWCNT-EDC-NHS表面导致更显著的电流下降，这归因于噬菌体的非导电性质。同样，在靶细菌存在下，修饰电极系统表现出显著的电流下降。这些CV结果证实传感器表面成功修饰了噬菌体，且与靶细菌的相互作用可通过可测量的电流下降来监测，证明了该系统在细菌检测方面的潜力。

表面修饰步骤进一步通过EIS分析得到印证，观察到电阻增加与电流下降平行发生（图1B），表明所有制备步骤均成功完成，获得了可用于靶细菌检测的功能性传感器表面。

3.4 MWCNT浓度对ECL信号的影响

采用共反应物ECL机制产生ECL信号[33]。[Ru(bpy)₃]²⁺在实验研究中作为发光体，三丙胺（TPA）作为共反应物。[Ru(bpy)₃]²⁺总浓度为1 mg ml⁻¹，TPA浓度为40 mM。研究旨在确定在修饰传感器表面上实现最高ECL信号的最佳MWCNT浓度。在MWCNT上引入羧基（-COOH）以促进其与电极表面的结合及后续噬菌体的固定。考察了不同MWCNT浓度（0.25、0.5、0.75、1.0和1.5 mg ml⁻¹）对ECL强度的影响（图2）。根据电子转移效率确定最佳浓度，在0.75 mg ml⁻¹时观察到最高ECL强度。较高MWCNT浓度（1.0–1.5 mg ml⁻¹）下ECL信号的下降归因于碳纳米管的聚集，这产生了空间位阻和芳香环间的π-π堆积相互作用，从而降低了电子转移效率。受限的电子转移减少了激发态[Ru(bpy)₃]²⁺的生成，导致ECL信号降低[44]。

【数据】[Ru(bpy)₃]²⁺浓度：1 mg ml⁻¹；TPA浓度：40 mM；MWCNT浓度梯度：0.25、0.5、0.75、1.0、1.5 mg ml⁻¹；最佳浓度：0.75 mg ml⁻¹；测试条件：10 mM PBS（pH 7.4）、0–1.3 V、60 mV/s

3.5 噬菌体浓度对ECL信号的影响

为实现高选择性和高灵敏度，对电极表面负载的噬菌体浓度进行了仔细优化。制备M-PaP1噬菌体储备悬液，其在适当培养基中复制的浓度用作储备液。使用储备液在10 mM PBS（pH 7.4）中制备六个不同浓度（10、20、30、40、50和100 PFU ml⁻¹）的噬菌体悬液。

（原文节选至此，后续结果数据未在提供文本中完整呈现）

【数据】噬菌体浓度梯度：10、20、30、40、50、100 PFU ml⁻¹；缓冲液：10 mM PBS（pH 7.4）；测试条件：0–1.3 V、60 mV/s

3.6 铜绿假单胞菌的ECL检测

（原文此节内容未完整提供，基于摘要信息，ECL传感器检测限为0.755 CFU ml⁻¹，线性工作范围为2.28至10¹⁰ CFU ml⁻¹，R²为0.9981。）

【数据】检测限：0.755 CFU ml⁻¹；线性范围：2.28–10¹⁰ CFU ml⁻¹；R²：0.9981；测试条件：10 mM PBS（pH 7.4）、0–1.3 V、60 mV/s

3.7 选择性评价

（原文此节内容未完整提供，基于摘要信息，传感器对铜绿假单胞菌表现出优异的选择性，对大肠杆菌、恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌等非特异性菌的干扰极小。）

【数据】干扰菌：大肠杆菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌；测试浓度：10¹、10²、10³ CFU ml⁻¹；样本：尿液；测试条件：0–1.3 V、60 mV/s

3.8 人工尿液中的EIS检测

（原文此节内容未完整提供，基于图表清单信息，在人工尿液和PBS（pH 7.4）中使用EIS（0.1 Hz–100 kHz）对铜绿假单胞菌进行了检测比较。）

【数据】EIS频率范围：0.1 Hz–100 kHz；样本：人工尿液、PBS（pH 7.4）

3.9 EIS选择性

（原文此节内容未完整提供，基于图表清单信息，在尿液中使用EIS在0.1 Hz至100 kHz频率范围内评价了系统选择性，显示了不同菌种在10³ CFU ml⁻¹浓度下的回收率百分比。）

【数据】EIS频率范围：0.1 Hz–100 kHz；菌种浓度：10³ CFU ml⁻¹；样本：尿液

3.10 传感器重现性与稳定性

（原文此节内容未完整提供，基于图表清单信息，在优化条件下连续测量中记录了ECL强度（回收率%），并在+4°C避光保存的第1、3、7、10和15天测量了ECL强度变化。）

【数据】保存条件：+4°C避光；测量时间点：第1、3、7、10、15天；测试条件：10 mM PBS（pH 7.4）、40 mM TPA、0–1.3 V、60 mV/s

讨论与解读

本研究成功构建了基于噬菌体M-PAP1与MWCNT-COOH修饰丝网印刷碳电极的双模式传感平台，用于铜绿假单胞菌的灵敏检测。该系统在ECL和EIS两种模式下均表现出高选择性和良好的分析性能，有效减少了非特异性菌的干扰，证实了其在临床诊断中的适用性。ECL模式检测限低至0.755 CFU ml⁻¹，线性工作范围覆盖2.28至10¹⁰ CFU ml⁻¹（R²=0.9981），在人工尿液样本中回收率达92%–97%。双模式设计通过交叉验证检测信号显著增强了诊断准确性，为应对日益严峻的抗生素耐药性问题提供了快速监测铜绿假单胞菌的稳健平台。

编译者解读

该研究将噬菌体作为生物识别元件与纳米材料信号放大策略相结合，体现了合成生物学工具在诊断应用中的转化价值。噬菌体M-PAP1的烈性特性赋予传感器天然的特异性优势，而MWCNT的大比表面积有效提升了信号转换效率。双模式（ECL/EIS）设计在临床上意味着同一平台可提供互补的定量与验证信息，降低假阳性风险。值得注意的是，传感器在人工尿液复杂基质中仍保持92%–97%的回收率，显示出实际样本应用的潜力。未来若能实现噬菌体库的模块化扩展，该平台有望推广至其他耐药病原体的检测。

参考来源

Allahyari, M. (2026). Phage-based dual-mode sensor using ECL and EIS for sensitive detection of Pseudomonas Aeruginosa. Bioelectrochemistry. DOI: 10.1016/j.bioelechem.2025.109212

DOI: 10.1016/j.bioelechem.2025.109212