来源：HsbA represses stationary phase biofilm formation in Pseudomonas putida（Microbiological Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
生物被膜是细菌在固相表面聚集形成的群落结构，其形成与解散受环二鸟苷酸（c-di-GMP）信号精密调控。本研究通过转录组学发现，恶臭假单胞菌中（p）ppGpp严紧反应信号通过RpoS依赖性途径诱导hsbAR-hptB基因簇及cfcR表达，并揭示HsbA蛋白通过与二鸟苷酸环化酶CfcR形成复合物、抑制c-di-GMP合成来阻止稳定期生物被膜形成的新机制。该发现拓展了对营养胁迫下生物被膜解散调控网络的认识。
研究背景
许多细菌的生命周期以浮游状态与固着状态交替为特征，后者形成高度结构化的表面相关群落——生物被膜。由于生物被膜表型赋予细菌对多种环境胁迫的高度耐受性，生物被膜形成常被视为一种应激反应，旨在抵御包括宿主防御和抗菌药物在内的有害条件。然而，生物被膜生长也可作为定殖有利生态位的有效手段，为群落成员提供滋养环境并促进积极互作。生物被膜形成是一种协调的集体行为，被视为多细胞发育的进化前体。细菌生物被膜发育依次经历附着、增殖和成熟阶段，最终通过程序性解散回归浮游生活方式。大量生物被膜调控研究强调了环二鸟苷酸介导的信号在生物被膜生活方式的确立、维持和终止中的重要性。c-di-GMP由二鸟苷酸环化酶合成，其浓度变化直接影响生物被膜的形成与解散决策。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本工作所用菌株列于表S1。大肠杆菌和恶臭假单胞菌液体培养物常规使用溶菌肉汤培养基，分别于37°C和30°C、180 rpm振荡条件下培养。基础培养基按已报道方法配制，含丁二酸钠（25 mM）和氯化铵（1000 mg L⁻¹）作为唯一碳源和氮源。固体培养基加入美国细菌学琼脂至终浓度15 g L⁻¹。需要时，抗生素及其他化合物按以下浓度添加：氨苄青霉素（100 mg L⁻¹）、羧苄青霉素（500 mg L⁻¹）、氯霉素（15 mg L⁻¹）、利福平（20 mg L⁻¹）、庆大霉素（10 mg L⁻¹）、卡那霉素（25 mg L⁻¹）、3-甲基苯甲酸（3 mM）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷（X-gal）（25 mg L⁻¹）、水杨酸钠（2 mM）、刚果红（40 mg L⁻¹）和DL-丝氨酸氧肟酸（SHX）（0.8 mM）。所有试剂购自Sigma-Aldrich。
【数据】培养基：LB/基础培养基；温度：37°C（E. coli）/30°C（P. putida）；转速：180 rpm；碳源：丁二酸钠25 mM；氮源：氯化铵1000 mg L⁻¹；抗生素浓度：氨苄青霉素100 mg L⁻¹、羧苄青霉素500 mg L⁻¹、氯霉素15 mg L⁻¹、利福平20 mg L⁻¹、庆大霉素10 mg L⁻¹、卡那霉素25 mg L⁻¹；诱导物：3MB 3 mM、水杨酸钠2 mM、SHX 0.8 mM；琼脂：15 g L⁻¹
2.2 质粒与菌株构建
本工作所用菌株、质粒和寡核苷酸汇总于表S1。所有DNA操作均按标准方案进行。限制性和修饰酶按制造商说明书使用。PCR扩增使用Q5®高保真DNA聚合酶进行克隆，使用DreamTaq™ DNA聚合酶验证质粒构建和染色体操作。大肠杆菌DH5α用作克隆宿主菌。涉及PCR的克隆步骤通过商业Sanger测序验证。质粒DNA通过转化导入大肠杆菌，通过三亲本接合或电穿孔导入恶臭假单胞菌。miniTn7衍生元件的位点特异性整合按已报道方法进行并经PCR验证。质粒和菌株构建的具体细节见补充材料与方法。
【数据】PCR酶：Q5® High-Fidelity DNA Polymerase（克隆）、DreamTaq™ DNA Polymerase（验证）；宿主菌：E. coli DH5α；转移方法：转化/三亲本接合/电穿孔；整合系统：miniTn7
2.3 RNA操作（qRT-PCR与RNA-seq）
从恶臭假单胞菌指数期（OD600为0.4，用于qRT-PCR）或稳定期（OD600为4.0，用于RNA-seq）液体培养物中分离总RNA。qRT-PCR实验中，使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit将2 µg总RNA逆转录为cDNA。使用CFX Connect Real-Time PCR Detection System和FastGene® IC Green qPCR Universal kit进行实时定量PCR，所用寡核苷酸详见表S1。RNA-seq样品在CABIMER基因组学设施处理。
【数据】RNA提取菌浓：OD600=0.4（qRT-PCR）/OD600=4.0（RNA-seq）；逆转录模板量：2 µg；qPCR仪器：CFX Connect Real-Time PCR Detection System；试剂盒：FastGene® IC Green qPCR Universal kit
2.4 SDS-PAGE、Western-blot分析与免疫共沉淀
为评估蛋白表达和稳定性，SDS-PAGE和Western-blot分析按已报道方法进行并略作修改。从携带相应miniTn7衍生元件的野生型菌株稳定期培养物（OD600约4–5.0）中取1毫升等分试样离心收集。细胞悬浮于PAGE上样缓冲液（80 mM Tris-HCl，pH 6.8；10%甘油；2% SDS；0.05%溴酚蓝），煮沸5分钟并短暂离心。可溶性蛋白在10% SDS-PAGE凝胶上分离。封闭的硝酸纤维素膜与兔抗GFP抗血清（SAB4301138，Sigma-Aldrich，1:5000稀释）在4°C孵育过夜，HRP偶联的抗兔二抗（31460，Thermo Fischer，1:10000稀释）作为二抗。为鉴定HsbA、HsbA S56A和HsbA S56D的互作蛋白，使用携带miniTn7转座子的菌株从PhsbA启动子产生GFP标记的诱饵蛋白，或以组成型PA1/04/03启动子单独表达GFP作为阴性对照。随后使用GFP-Trap®琼脂糖珠进行免疫共沉淀测定。蛋白提取、免疫沉淀、蛋白鉴定和数据分析的详细方案见补充材料与方法。
【数据】菌浓：OD600约4–5.0；上样缓冲液：80 mM Tris-HCl pH 6.8、10%甘油、2% SDS、0.05%溴酚蓝；煮沸：5 min；SDS-PAGE：10%凝胶；一抗：抗GFP 1:5000；二抗：HRP-抗兔 1:10000；孵育：4°C过夜
2.5 体内基因表达测定
携带gfp-lacZ转录融合体的过夜LB培养物在3 mL含相应抗生素的培养基中稀释至A600为0.01，需要时加入2 mM水杨酸钠或0.8 mM SHX，于30°C、180 rpm振荡培养至OD600达0.5（指数期）或5.0（稳定期）。β-半乳糖苷酶活性从十二烷基硫酸钠和氯仿透化的细胞中测定。终点荧光测量使用Tecan Spark 10 M微板读数器。c-di-GMP间接定量中，携带PcdrA-gfp转录融合体的菌株荧光沿浮游生长曲线监测，具体修改如下：（i）过夜LB培养物在1/10强度LB培养基中500倍稀释，需要时加入适当抗生素和水杨酸钠；（ii）平板于30°C、180 rpm振荡孵育；（iii）A600和GFP荧光在23小时内以15分钟间隔监测。
【数据】起始A600：0.01；指数期OD600：0.5；稳定期OD600：5.0；温度：30°C；转速：180 rpm；SHX浓度：0.8 mM；水杨酸钠：2 mM；监测时长：23 h；监测间隔：15 min；稀释倍数：500倍
2.6 最低抑制浓度分析
为确定抑制细胞生长所需的最低SHX浓度，过夜LB培养物在基础培养基中500倍稀释，150 µL细胞悬液分装至Costar® 96孔聚苯乙烯板（Corning，Ref: 3585）孔中。平板在Tecan Spark 10 M微板读数器中于30°C、180 rpm振荡孵育，OD600在23小时内以15分钟间隔监测。当培养物达到OD600为0.4时，向孔中加入不同浓度的SHX。
【数据】稀释倍数：500倍；样品量：150 µL/孔；温度：30°C；转速：180 rpm；监测时长：23 h；监测间隔：15 min；SHX添加时机：OD600=0.4
2.7 浮膜形成测定
为评估空气-液体界面浮膜的形成，新鲜菌落接种于含5 mL LB培养基的15 mL玻璃管中，于30°C、180 rpm振荡孵育。需要时向培养基中加入水杨酸钠。24小时和48小时后通过数码摄影记录玻璃附着浮膜的存在。
【数据】培养基体积：5 mL LB/15 mL玻璃管；温度：30°C；转速：180 rpm；观察时间：24 h和48 h
2.8 刚果红染色
为评估细胞外聚合基质组成的变化，平板刚果红吸附测定按已报道方法进行并略作修改。10 µL过夜LB培养物点滴于补充刚果红的T-培养基琼脂平板（1% Bacto™ Tryptone，1% Bacto™ Agar）表面。需要时向培养基中加入水杨酸钠。平板于30°C孵育48小时，通过数码摄影记录菌落形态。
【数据】点滴量：10 µL；培养基：T-培养基琼脂（1% Bacto™ Tryptone，1% Bacto™ Agar）；刚果红：40 mg L⁻¹；温度：30°C；时间：48 h
2.9 基于连续稀释的生物被膜生长曲线
基于连续稀释的微板生物被膜生长测定按已报道方法进行。平板孵育20小时或30小时，适当时向培养基中加入水杨酸钠。每个菌株至少测定三个生物学重复，每个重复六次技术重复。
【数据】孵育时间：20 h或30 h；生物学重复：≥3；技术重复：6
2.10 泳动能力测定
泳动测定改编自Parkinson方法。含0.3% Bacto™ Agar的胰蛋白胨-琼脂平板用牙签接种新鲜菌落，于30°C孵育12小时。适当时加入水杨酸钠或SHX。拍摄数码图像并测量泳动晕圈直径。
【数据】琼脂浓度：0.3% Bacto™ Agar；温度：30°C；时间：12 h
研究结果
3.1 hsbAR-hptB基因簇受严紧反应和通用应激反应调控
此前工作表明，hsbA、hsbR和hptB是参考菌株恶臭假单胞菌KT2440中hsbAR-hptB-fliKLMNOPQR-flhB操纵子的组成部分。该操纵子的转录由PhsbA驱动，后者被FliA适度激活，另有PfliK和PfliL两个依赖σ54、由FleQ激活的启动子。在一项旨在鉴定严紧反应相关警报素（p）ppGpp全基因组调控靶标的RNA-seq实验中，与不产生该警报素的对照∆relA∆spoT菌株（即ppGpp0突变体）相比，野生型菌株稳定期hsbA、hsbR和hptB的转录分别增加17.3倍、13.3倍和3.4倍（图1A）。操纵子下游基因或鞭毛基因簇中的任何其他基因均未显示类似响应，表明内部PfliK和PfliL启动子的较强转录可能掩盖了这一调控。
虽然严紧反应在稳定期营养耗尽时自然诱导，也可通过添加氨基酸类似物如丝氨酸氧肟酸在指数期实验性诱导。SHX结合并干扰丝氨酰-tRNA合成酶，导致蛋白质合成停滞，且SHX添加已被证明可在恶臭假单胞菌指数期培养物中触发（p）ppGpp积累，导致生长抑制。事实上，恶臭假单胞菌KT2440在基础培养基中的指数生长在添加SHX后以浓度依赖性方式减慢，并在0.8 mM SHX下完全抑制。我们使用qRT-PCR评估了0.8 mM SHX添加对野生型菌株KT2440、其同基因ppGpp0突变体以及KT2442（本实验室常规用作参考菌株的KT2440利福平抗性衍生物）中hsbA、hsbR和hptB转录水平的影响（图1B）。SHX处理的KT2440细胞中hsbA、hsbR和hptB的转录相对于未处理对照分别增加2.5倍、7.5倍和3.5倍。ppGpp0突变体中三个转录本的水平非常低，且添加SHX后未增加。这表明SHX通过促进恶臭假单胞菌中（p）ppGpp积累来诱导hsbAR-hptB表达。KT2442获得的结果与KT2440在SHX处理和未处理细胞中均相当。因此，KT2442此后被用作参考野生型菌株。
对hsbA上游基因间区的分析揭示了一个与载有替代σ因子RpoS的RNA聚合酶结合基序高度相似的序列，其中判别性的-13C、-9C和-5A位置完全保守。RpoS是大肠杆菌和其他细菌中通用应激反应的中心调控因子。为检验RpoS对hsbAR-hptB转录的影响，我们将PhsbA启动子与双报告基因gfpmut3-lacZ的质粒融合体引入野生型KT2442及其同基因∆rpoS突变体MRB193，并评估指数期和稳定期该融合体衍生的β-半乳糖苷酶活性（图1C）。野生型菌株中PhsbA表达在指数期较低，稳定期大幅（10倍）诱导。∆rpoS突变体中的表达在指数期和稳定期分别低2倍和6倍，尽管在该背景下仍观察到残余的4倍稳定期诱导。综合来看，我们的结果表明hsbAR-hptB基因簇的转录受到严紧反应和通用应激反应的双重调控。
【数据】RNA-seq倍数变化：hsbA 17.3倍、hsbR 13.3倍、hptB 3.4倍（WT vs ppGpp0）；qRT-PCR倍数变化（SHX处理）：hsbA 2.5倍、hsbR 7.5倍、hptB 3.5倍；SHX完全抑制浓度：0.8 mM；PhsbA稳定期诱导倍数：10倍；∆rpoS中表达降低：指数期2倍、稳定期6倍；残余诱导：4倍
3.2 HsbA是生物被膜形成的负调控因子
由于HsbA是铜绿假单胞菌中生物被膜形成的正调控因子，我们着手检验HsbA对恶臭假单胞菌生物被膜形成的影响。为此，我们构建了KT2442的∆hsbA突变体衍生物MRB171。qRT-PCR证实hsbA的缺失未对下游基因hsbR和hptB造成转录极性效应。接下来，我们在野生型和∆hsbA突变体衍生物MRB171中测量了浸没式生物被膜生长、中空气界面生物被膜形成以及在含刚果红琼脂平板上的菌落形态（图2）。
浸没式生物被膜生长通过微板中基于连续稀释的生长曲线评估（图2A）。在这些条件下，野生型菌株在指数期形成生物被膜并在稳定期发生解散，与此前报道一致。∆hsbA突变体也在指数期形成生物被膜并在早期稳定期以与野生型相似的动力学启动解散。然而，解散被中断，生物被膜形成在晚期稳定期恢复。延长孵育时间从20小时至30小时，导致∆hsbA突变体进一步生长生物被膜且无解散迹象，而野生型菌株未恢复生物被膜生长。在中空气界面生物被膜形成测定中，野生型菌株在富培养基中孵育24小时后形成薄浮膜，48小时时不再存在。相比之下，∆hsbA突变体表现出厚浮膜，48小时时仍然明显。最后，野生型菌株在刚果红琼脂上形成光滑无色菌落（图2C），而∆hsbA突变体的菌落被染成红色，形态无明显变化。综合来看，这些结果强烈表明在我们的实验生长条件下，HsbA是一个负调控因子，阻止稳定期浸没式生物被膜的形成、抵抗解散的稳健中空气界面生物被膜的产生以及琼脂平板上可被刚果红染色的细胞外聚合基质组分的合成。
由于生物被膜形成和刚果红吸附通常与细胞内高浓度c-di-GMP相关，我们接下来评估了野生型和∆hsbA菌株中c-di-GMP积累动态。pCdrA::gfp质粒是基于铜绿假单胞菌中受FleQ抑制且被c-di-GMP诱导的PcdrA启动子的荧光c-di-GMP报告基因家族。在FleQ⁺背景下，荧光水平反映细胞内c-di-GMP浓度。这些质粒已广泛用于假单胞菌属，作为直接测量c-di-GMP的便捷替代方案。为避免GFP高稳定性导致的过度荧光积累，我们使用了质粒pCdrA::gfp(ASV)C，其中PcdrA驱动不稳定的GFP(ASV)变体的合成。携带pCdrA::gfp(ASV)C的野生型菌株的归一化荧光水平在指数生长期间下降，可能是由于生长稀释抵消了荧光积累，并在进入稳定期生长停止时增加。∆hsbA突变体的行为相似，但稳定期荧光信号以更高速率增加，表明∆hsbA突变体细胞在此阶段比野生型细胞具有更高的细胞内c-di-GMP浓度。这些结果强烈表明HsbA通过阻止c-di-GMP积累来抑制稳定期生物被膜形成。
【数据】孵育时间：20 h/30 h；浮膜观察：24 h/48 h；刚果红染色：∆hsbA阳性/WT阴性；c-di-GMP报告基因：pCdrA::gfp(ASV)C；∆hsbA稳定期荧光增加速率高于WT
3.3 HsbA通过二鸟苷酸环化酶CfcR抑制c-di-GMP合成
在铜绿假单胞菌中，HsbA通过与DGC HsbD相互作用刺激c-di-GMP合成。相反，我们的结果表明恶臭假单胞菌HsbA阻止c-di-GMP合成或促进其降解。为鉴定参与该过程的DGC，我们分析了恶臭假单胞菌KT2440基因组中所有注释的含GGDEF结构域蛋白的基因，并筛选了与hsbA共调控的候选基因。RNA-seq数据显示，编码含GGDEF结构域蛋白的cfcR基因在野生型菌株中相对于ppGpp0突变体在稳定期转录增加4.1倍。cfcR位于编码传感器激酶CfcA的基因下游，两者构成一个双组分系统。我们通过qRT-PCR验证了cfcR的（p）ppGpp依赖性表达，并确认其表达也依赖RpoS。
为检验CfcR是否参与HsbA介导的生物被膜抑制，我们构建了∆cfcR和∆cfcA单突变体以及∆hsbA∆cfcR和∆hsbA∆cfcA双突变体，并测定了这些菌株的生物被膜相关表型（图3）。
在基于连续稀释的生长曲线测定中，∆cfcR和∆cfcA单突变体的生物被膜形成与野生型相似。然而，∆hsbA∆cfcR双突变体的生物被膜形成表型与∆hsbA单突变体不同——双突变体在晚期稳定期不再恢复生物被膜形成，其行为与野生型相似。这证实CfcR的DGC活性是∆hsbA突变体在稳定期恢复生物被膜形成所必需的。在刚果红平板上，∆cfcR和∆cfcA单突变体形成与野生型相似的无色菌落，而∆hsbA∆cfcR和∆hsbA∆cfcA双突变体的菌落与∆hsbA突变体一样被染成红色。这表明CfcR的DGC活性并非∆hsbA突变体刚果红吸附表型所必需，或者存在其他DGC在该背景下补偿CfcR的功能。
【数据】cfcR RNA-seq倍数变化：4.1倍（WT vs ppGpp0）；∆hsbA∆cfcR双突变体：恢复WT生物被膜表型；刚果红：双突变体仍呈红色
3.4 CfcA、CfcR和HsbA的亚细胞定位
为探究HsbA、CfcR和CfcA之间的相互作用及其在细胞内的空间分布，我们构建了携带PcfcA-cfcA-gfp、PcfcR-cfcR-gfp、PhsbA-hsbA-gfp、PhsbA-hsbA S56A-gfp和PhsbA-hsbA S56D-gfp转座子的菌株，并通过共聚焦显微镜观察稳定期细胞（图4）。
在野生型背景下，CfcA-GFP呈现弥漫的细胞质分布，伴有明亮的聚焦点。CfcR-GFP也呈现细胞质分布，但聚焦点较少。HsbA-GFP呈现均匀的细胞质分布。在∆cfcR背景下，CfcA-GFP的分布发生改变，聚焦点消失，呈现更均匀的细胞质定位。在∆cfcA背景下，CfcR-GFP的分布也发生改变，聚焦点减少。在∆hsbA背景下，CfcR-GFP和CfcA-GFP的分布均发生改变。
磷酸化模拟变体HsbA S56D-GFP的定位与野生型HsbA-GFP相似，呈现细胞质分布。而非磷酸化变体HsbA S56A-GFP的定位则不同，在细胞膜附近出现明显的聚焦点。这表明HsbA的磷酸化状态影响其亚细胞分布。
【数据】定位模式：CfcA-GFP细胞质+聚焦点；CfcR-GFP细胞质+较少聚焦点；HsbA-GFP均匀细胞质；HsbA S56A-GFP膜附近聚焦点；HsbA S56D-GFP与WT相似
3.5 ∆hsbR和∆hptB突变体的生物被膜相关表型
为评估HptB和HsbR在HsbA调控生物被膜形成中的作用，我们构建了∆hsbR和∆hptB单突变体，并测定了其生物被膜相关表型（图5）。
在基于连续稀释的生长曲线测定中，∆hsbR和∆hptB单突变体的生物被膜形成与野生型相似，在指数期形成生物被膜并在稳定期解散。与∆hsbA突变体不同，∆hsbR和∆hptB突变体在晚期稳定期未恢复生物被膜形成。在刚果红平板上，∆hsbR和∆hptB突变体形成与野生型相似的无色菌落。这些结果表明，单独缺失hsbR或hptB不足以产生与∆hsbA突变体相似的生物被膜表型，HsbA对生物被膜形成的抑制作用可能不依赖于其通过HptB-HsbR的磷酸化状态。
【数据】∆hsbR/∆hptB：生物被膜表型与WT相似；刚果红：无色菌落
3.6 HsbA磷酸化状态对其功能的影响
为直接检验HsbA磷酸化状态对其抑制生物被膜形成能力的影响，我们在∆hsbA突变体中从Psal启动子表达了野生型HsbA、非磷酸化变体HsbA S56A和磷酸化模拟变体HsbA S56D，并在不存在或存在2 mM水杨酸盐的条件下测定了生物被膜相关表型（图6）。
在不存在水杨酸盐的条件下，表达野生型HsbA、HsbA S56A或HsbA S56D的∆hsbA突变体均表现出与∆hsbA突变体相似的生物被膜形成表型——在晚期稳定期恢复生物被膜形成。在存在2 mM水杨酸盐的条件下，Psal启动子被诱导，表达野生型HsbA的∆hsbA突变体的生物被膜形成受到抑制，不再在晚期稳定期恢复生物被膜形成。同样，表达HsbA S56A或HsbA S56D的∆hsbA突变体在水杨酸盐诱导下也表现出生物被膜形成受抑制。这些结果表明，无论HsbA的磷酸化状态如何，其均保留抑制生物被膜形成的能力。
在刚果红平板上，表达野生型HsbA、HsbA S56A或HsbA S56D的∆hsbA突变体在水杨酸盐存在下均形成无色菌落，与野生型相似。这进一步证实HsbA抑制生物被膜形成的能力不依赖于其磷酸化状态。
【数据】水杨酸盐浓度：2 mM；Psal启动子诱导；表达HsbA/HsbA S56A/HsbA S56D均恢复抑制功能
3.7 鞭毛运动性和鞭毛基因表达分析
由于hsbAR-hptB基因簇与鞭毛基因簇相关联，我们检测了∆hsbA、∆hsbR和∆hptB突变体的泳动运动性，以及携带PhsbA-hsbA（S56）、PhsbA-hsbA S56A（S56A）或PhsbA-hsbA S56D（S56D）转座子的∆hsbA突变体在不存在或存在0.8 mM SHX条件下的泳动运动性（图7）。
∆hsbA、∆hsbR和∆hptB突变体的相对泳动晕圈直径与野生型相比无显著差异。携带PhsbA-hsbA、PhsbA-hsbA S56A或PhsbA-hsbA S56D转座子的∆hsbA突变体的泳动运动性与野生型也相似。在存在0.8 mM SHX的条件下，所有菌株的泳动运动性均降低，但菌株之间的相对差异保持不变。这些结果表明，HsbA及其磷酸化状态不影响鞭毛介导的运动性。
【数据】SHX浓度：0.8 mM；泳动晕圈直径：∆hsbA/∆hsbR/∆hptB与WT无显著差异
讨论与解读
本研究揭示了恶臭假单胞菌中HsbA作为生物被膜形成负调控因子的新功能，这与铜绿假单胞菌中HsbA作为正调控因子的作用形成鲜明对比。在恶臭假单胞菌中，hsbAR-hptB基因簇的转录受（p）ppGpp和RpoS双重调控，在营养胁迫条件下被诱导。HsbA通过抑制CfcR的二鸟苷酸环化酶活性来阻止c-di-GMP合成，从而在稳定期抑制生物被膜形成。HsbA的磷酸化状态影响其与CfcR和CfcA的相互作用及亚细胞分布，但无论磷酸化状态如何，HsbA均保留抑制生物被膜形成的能力。该调控通路在营养饥饿期间通过阻断新c-di-GMP合成而促进生物被膜解散，同时可能允许在定殖新位点或生物被膜成熟过程中快速恢复生物被膜表型。
作者提出了一个工作模型（图8）：HsbA与CfcR形成复合物，以不依赖磷酸化状态的方式抑制其DGC活性。当HsbA去磷酸化后，该复合物被CfcA招募至细胞膜，增强抑制效果。
编译者解读：该研究揭示了HsbA在假单胞菌属中的功能分化——同一蛋白在不同物种中分别充当生物被膜的正、负调控因子，这为合成生物学中正交调控元件的设计提供了有趣的进化视角。通过（p）ppGpp-RpoS-HsbA-CfcR信号轴将营养胁迫感知与c-di-GMP代谢直接偶联，该机制有望被工程化改造为环境响应型生物被膜调控开关。然而，HsbA的膜招募增强抑制效应的结构基础尚待解析，且磷酸化状态如何精确调控蛋白-蛋白互作亲和力仍是未解之谜。未来若能将此调控模块移植到工业菌株中，或可实现对生物被膜形成与解散的时序精确控制。
参考来源
Pulido-Sánchez M. HsbA represses stationary phase biofilm formation in Pseudomonas putida. Microbiological Research, 2026. DOI: 10.1016/j.micres.2025.128428
DOI: 10.1016/j.micres.2025.128428