来源：Systematic engineering of synthetic serine cycles in Pseudomonas putida uncovers emergent topologies for methanol assimilation（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
甲醇等一碳（C1）化合物是可持续生物制造的理想底物，但非模式工业菌株的甲醇同化路径改造长期受限。本研究以基因组精简的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）SEM11为底盘，将三种合成丝氨酸循环变体——丝氨酸-苏氨酸循环（STC）、高丝氨酸循环（HSC）和修饰丝氨酸循环（mSC）——拆分为功能模块，结合生长偶联筛选与计算模拟，系统比较各模块体内表现。研究还利用菌株内源PQQ依赖性甲醇脱氢酶，通过递归重连合成与天然活性，最终发现一种新型甲醇同化拓扑结构——增强型丝氨酸-苏氨酸循环（eSTC），为非模式异养菌的C1同化工程提供了设计蓝图。
研究背景
气候变化与碳排放压力推动工业生物技术转向可持续原料。甲醇和甲酸等C1化合物可从甲烷或CO₂经可再生电力或阳光转化获得，是理想的替代底物。然而，除甲基营养酵母Komagataella phaffii外，典型工业菌株如大肠杆菌和酿酒酵母均不能天然利用C1化合物；天然甲基营养菌虽能利用C1底物，但代谢工程改造极为困难，现有产物滴度距工业竞争力相去甚远。过去十年，大肠杆菌和Cupriavidus necator中实现合成甲基营养已有突破，但丝氨酸循环（SC）这一天然氧不敏感、无碳损失的C1同化路径，其工程化改造长期受制于固有生化瓶颈。恶臭假单胞菌代谢灵活、具备与SC实施相契合的天然架构（如丙酮酸或PEP的羧化通量、多种内源C1脱氢酶同工酶），是探索合成甲基营养的理想底盘。
研究方法
（缺失）质粒的构建
本研究所用自杀质粒和过表达质粒列于补充信息表S9，均采用USER克隆法构建。对于缺失质粒，以待敲除位点上下游各约500 bp的DNA片段为目的片段，使用含尿嘧啶引物经Phusion U Hot Start™ DNA聚合酶（ThermoFisher Scientific Co.）扩增。pGNW2骨架经DpnI消化后，取1 μl DpnI处理载体与100 ng各PCR片段及1 μl USER™酶（New England BioLabs）混合，终体积10 μl。反应于37°C孵育30 min，随后经3 min梯度降温（从28°C降至20°C，每步1°C），最后于10°C孵育至少10 min。取5 μl USER混合液热激转化化学感受态大肠杆菌DH5α λpir细胞，复苏后涂布于含相应抗生素的选择性LB琼脂平板。
【数据】片段长度：~500 bp（上下游）；聚合酶：Phusion U Hot Start™；USER反应体积：10 μl；37°C孵育：30 min；降温：28→20°C（3 min）；10°C孵育：≥10 min；转化量：5 μl；宿主：E. coli DH5α λpir
恶臭假单胞菌突变株的构建
相应pGNW2衍生自杀质粒通过三亲本接合转移导入目标菌株：供体为携带特定自杀质粒的DH5α λpir，受体为目标恶臭假单胞菌菌株，辅助菌为携带pRK2013质粒的大肠杆菌HB101。三种菌株于LB平板30°C共培养5 h以上，随后涂布于含相应抗生素和Irgasan的LB平板。阳性共整合事件进一步用pQURE6·H（补充信息表S9）转化——该条件复制质粒携带大范围核酸酶基因I-SceI。I-SceI切割染色体上的pGNW2共整合体，迫使发生第二次同源重组。具体操作：取50 ng质粒DNA电转化入50 μl新鲜制备的电击感受态恶臭假单胞菌细胞（细胞预先用300 mM蔗糖洗涤三次）。电转化使用Gene Pulser XCell（Bio-Rad），参数设置为2.5 kV、25 μF电容、200 Ω电阻，采用2 mm间隙电转杯。细胞在含2 mM 3-甲基苯甲酸（3-mBz）的1 ml LB培养基中30°C复苏至少3 h，随后涂布于含相应抗生素和1 mM 3-mBz的LB琼脂平板，以同时诱导质粒复制和I-SceI表达。阳性克隆经菌落PCR鉴定、DNA测序验证，并在非选择条件下通过系列稀释消除解析质粒。所用序列均为天然序列，唯真核来源的Hs agxt1和Sc agx1基因经密码子优化。Sc agx1转座子插入位点通过任意PCR确定。
【数据】接合培养：LB平板30°C >5 h；电转化：50 ng质粒/50 μl细胞，2.5 kV，25 μF，200 Ω，2 mm电转杯；蔗糖洗涤：300 mM×3次；复苏：1 ml LB + 2 mM 3-mBz，30°C ≥3 h；筛选平板：1 mM 3-mBz；密码子优化基因：Hs agxt1、Sc agx1
最大-最小驱动力（MDF）分析
采用MDF分析评估并比较天然及修饰SC在恶臭假单胞菌KT2440背景下的热力学可行性，使用eQuilibrator-API工具。同时将这些代谢途径与还原甘氨酸途径（rGlyP）和核酮糖单磷酸（RuMP）途径进行比较。代谢物浓度约束在1–10 mM范围，少数例外：（i）甲醛上限设为1 mM，即恶臭假单胞菌KT2440可耐受的最高浓度；（ii）L-谷氨酸和2-酮戊二酸作为氨基供体，分别设为100 mM和0.5 mM；（iii）胞内pH设为7.8；（iv）离子强度和–log10[Mg²⁺]（pMg）分别设为0.25 M和3；（v）由于eQuilibrator不支持MHPT氧化甲醛的反应，SCs采用不依赖谷胱甘肽的氧化反应（HSC除外）；（vi）所有羧化反应均假设以CO₂为底物以简化计算，因这类反应与pH无关（不同于涉及碳酸氢盐的反应）。溶液中低（环境）和高CO₂浓度分别设为10 μM和1 mM。高CO₂浓度为rGlyP等途径所需。所有途径均以甲醇为唯一碳源，以乙酰-CoA或丙酮酸为底物。由于各底物碳数不同，MDF以每C-mol千焦（kJ C-mol⁻¹）报告。计算脚本及详细信息见https://github.com/puiggene07/PubSuppl（2024_Ser_Cycles_P_putida目录）。
【数据】代谢物浓度范围：1–10 mM；甲醛上限：1 mM；L-谷氨酸：100 mM；2-酮戊二酸：0.5 mM；胞内pH：7.8；离子强度：0.25 M；pMg：3；低CO₂：10 μM；高CO₂：1 mM；报告单位：kJ C-mol⁻¹
通量平衡分析（FBA）
为在计算机上比较不同SC模块，使用COBRApy Python包进行FBA模拟。模拟基于KT2440菌株最新基因组规模代谢模型的精选版本——因SEM11中先前引入的基因组操作与其亲本KT2440相比不产生代谢差异。模型进一步基于以下考虑进行精炼：（i）甘氨酸代谢中GlyA（GHMT2）的可逆性；（ii）实验证据表明恶臭假单胞菌中高丝氨酸脱氢酶（HSDy）在苏氨酸再生过程中不可逆操作（与大肠杆菌观察一致）；（iii）恶臭假单胞菌嘌呤/嘧啶生物合成中缺乏通过PurU的天然甲酸营养型，故GARFT设为不可逆。此外，通过脂酰胺依赖性复合物（包括AKGDa和PDHa）的CO₂自养固定被设为不可逆反应而阻止。甲醛歧化酶（FALDM）反应被停用，因该活性从未在恶臭假单胞菌中分离到。最后，TOL质粒携带的基因（pWW0基因ID的反应）被删除，镍离子（Ni²⁺）从生物量函数中移除，因恶臭假单胞菌生长不需要镍。对于C1同化模块，相应合成反应被引入模型。不同合成模块的计算机比较基于其同化C1底物的能力、预测最大生物量形成速率、直接氧化的C1化合物量（等于天然甲酸脱氢酶反应速率）以及总CO₂排放速率。CO₂生成是NAD(P)H产生的主要结果，故可作为途径能量需求的间接指标。测试条件包括葡萄糖与甲醇共利用、完全甲基营养型以及仅以葡萄糖生长。各主要底物的碳等摩尔摄取速率设为30 mmol g⁻¹ h⁻¹。对于葡萄糖和甲醇共利用，甲醇摄取速率额外设为5 mmol g⁻¹ h⁻¹（高甲醇摄取）或2 mmol g⁻¹ h⁻¹（低甲醇摄取）。根据不同的体内筛选方案，通过COBRApy函数mode.genes.id.knockout停用相应反应。
【数据】碳等摩尔摄取速率：30 mmol g⁻¹ h⁻¹；高甲醇摄取：5 mmol g⁻¹ h⁻¹；低甲醇摄取：2 mmol g⁻¹ h⁻¹；模型：KT2440基因组规模代谢模型（精选版）；工具：COBRApy
化学品与试剂
除另有说明外，化学品购自Sigma-Aldrich Co.（美国密苏里州圣路易斯），寡核苷酸由Integrated DNA Technologies Inc.（美国爱荷华州科勒尔维尔）合成。DNA测序由Eurofins Genomics（德国埃伯斯贝格）完成。本研究所用引物列于补充信息表S10。PCR反应使用购自ThermoFisher Scientific Co.（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的Phusion U Hot Start™ DNA聚合酶。菌落PCR使用New England BioLabs（美国马萨诸塞州伊普斯威奇）的商用OneTaq™预混液。4-羟基-2-氧代丁酸（HOB，内酯形式）购自Synthenova（法国）。
【数据】试剂来源：Sigma-Aldrich；引物合成：Integrated DNA Technologies；测序：Eurofins Genomics；PCR酶：Phusion U Hot Start™；菌落PCR：OneTaq™预混液；HOB来源：Synthenova
研究结果
计算机分析揭示SC变体对高效甲醇转化的意义
为研究所有SC变体在恶臭假单胞菌中实现合成甲基营养的潜力，我们考察了各途径的酶需求（图1E，补充信息表S1）和ATP及NAD(P)H成本（图1F），使用最大-最小驱动力（MDF）分析探索生理条件下的热力学（补充信息注释S1），并使用通量平衡分析（FBA）预测比生长速率μ（图1G，补充信息表S2和S3）。我们将SC变体与彼此以及与其他已工程化的甲醇同化途径——即rGlyP和RuMP途径——进行比较。所有六种途径均在野生型恶臭假单胞菌KT2440的生化背景下建模（图S1），考虑甲醇或甲醛作为C1底物。对于甲醇氧化，模拟中纳入NADH依赖或PQQ依赖的MeDH（ΔrG′分别为34.2和−24.8 kJ mol⁻¹）（图1G，表S2）。
模拟显示，所有SC变体（MDF约7.5–9 kJ mol⁻¹）相较于rGlyP和RuMP途径（MDF约6–7 kJ mol⁻¹）具有更宽泛、更有利的热力学范围。HSC是最热力学有利的变体，无论是直接利用甲醛（即图1G中无MeDH）还是以PQQ依赖MeDH利用甲醇，其表现均超过所有其他途径至少两倍（图1G，补充信息表S2）。由于NADH依赖MeDH的醇氧化性能下降，某些途径（如HSC或RuMP途径）显得可行性较低。我们还使用MDF识别SC变体中的热力学瓶颈（补充信息图S2）。所有途径的主要瓶颈被预测为甘氨酸与5,10-亚甲基四氢叶酸（5,10-methylene-THF）的缩合反应。对于HSC，丙酮酸与甲醛的缩合构成主要热力学障碍。从C3中间体补充甘氨酸是STC的另一个瓶颈，草酰乙酸转氨及后续反应在热力学上不利（图1D，图S2）。这些生化瓶颈被纳入合成C1同化功能模块的设计考量。
接下来，FBA用于研究SC变体支持C1营养生长的内在差异（补充信息表S3和S4）。为此，我们精选了恶臭假单胞菌KT2440最新的基因组规模代谢重建模型，纳入各C1同化途径对应的合成反应。需指出，SEM11中先前引入的基因组修饰相对于其亲本KT2440不产生代谢差异。天然SC和mSC具有相似的能量和NAD(P)H需求（图1E、F），产生的比生长速率相近，且与其有利的热力学相关（表S3）。甲酸氧化（即以CO₂排放为指标的代谢周转）反映了相应循环变体的能量需求，因为甲酸氧化仅用于NAD(P)H生成。STC在所有测试变体中支持的生长最慢，与其不利的热力学一致。此外，HSC作为最节能的变体，其表现超过天然SC（表S3）。这些结果表明，在恶臭假单胞菌中工程化SC及其合成变体不仅可行，而且内源PQQ依赖性醇氧化活性的存在有利于实现甲基营养。各模块的详细FBA比较将在后续相应章节讨论。
【数据】MDF：SC变体~7.5–9 kJ mol⁻¹；rGlyP/RuMP~6–7 kJ mol⁻¹；NADH-MeDH ΔrG′：34.2 kJ mol⁻¹；PQQ-MeDH ΔrG′：−24.8 kJ mol⁻¹；HSC优势：≥2倍
生长偶联筛选方案与SC模块化测试
为标准化各SC的比较，我们在基因组精简菌株SEM11中采用生长偶联筛选和模块化工程。SEM11是野生型恶臭假单胞菌KT2440的基因组精简衍生物。我们首先识别了三种SC变体之间的结构共性以生成不同功能模块（补充信息图S3）。模块1（M1）涵盖从甘氨酸到丝氨酸的C1部分同化，而模块2（M2）通过将丙酮酸转化回甘氨酸来闭合循环，包括另一轮碳同化（图S3）。设计丝氨酸和甘氨酸营养缺陷型以测试M1的C1同化能力，而丝氨酸、乙酰-CoA或高丝氨酸营养缺陷型则用于筛选M2。所有筛选方案均经计算机设计，在工程实施前利用FBA探索代谢干预的长期稳定性（补充信息表S5）。在恶臭假单胞菌SEM11中实施的所有修饰路线图——包括基因缺失、基因插入以及染色体或质粒上的基因过表达——见补充信息图S4。
【数据】底盘菌株：SEM11（KT2440基因组精简衍生物）；模块划分：M1（C1→丝氨酸）、M2（丙酮酸→甘氨酸）；筛选方案：Ser/Gly营养缺陷型（M1）、Ser/乙酰-CoA/高丝氨酸营养缺陷型（M2）
M1的设计、构建与测试：甲酸和甲醛同化为L-丝氨酸
通过THF同化C1部分需要表达来自Methylobacterium extorquens AM1的ftfL（甲酸-THF连接酶）、fch（次甲基-THF环化水解酶）和mtdA（5,10-亚甲基-THF脱氢酶），生成5,10-亚甲基-THF。M1在mSC和STC中每同化一分子甲酸需要1 NADPH和1 ATP（图1C、D，补充信息图S3）。苏氨酸醛缩酶可利用甲醛进行甘氨酸醛醇化生成丝氨酸（丝氨酸醛缩酶），为HSC所需，且不依赖ATP和NAD(P)H。由于甲醇（而非甲酸）是我们的目标底物，应过表达MeDH基因以提供甲醛，每氧化一分子甲醇产生一个还原当量（NADH或PQQH₂）。恶臭假单胞菌中的内源氧化活性催化甲醛随后氧化为甲酸，为mSC或STC所需。计算机分析表明，M1可通过mSC/STC和HSC构型支持甲基营养生长，在以葡萄糖为辅底物时性能相近（补充信息表S6和S7）。在高甲醇摄取速率下，HSC的M1模块（以下简称M1·HSC）被预测优于M1·mSC/STC（表S4）。
基于这些设计，我们构建了一株可通过M1·HSC支持C1同化的菌株。
低特异性L-苏氨酸醛缩酶（M1·HSC）恢复丝氨酸和甘氨酸营养缺陷型生长
我们构建了丝氨酸和甘氨酸双营养缺陷型（ΔserA ΔΔglyA）以筛选L-丝氨酸醛缩酶活性，并进一步删除frmAC（PP_1616-7）以避免低甲醇浓度下的甲醛解毒。所得菌株（恶臭假单胞菌ΔserA ΔΔglyA ΔfrmAC）用低拷贝质粒（pSEVA621）转化，该质粒组成型表达Ec ltaE和来自Cupriavidus necator的CT4-1甲醇脱氢酶基因（Cn mdh，经工程改造增强活性）。仅携带Ec ltaE或Cn mdh的对照质粒也进行了测试（图2B）。
在含20 mM葡萄糖、10 mM甘氨酸和250–500 mM甲醇的de Bont minimal（DBM）培养基中孵育的ΔserA ΔΔglyA ΔfrmAC菌株，当Ec ltaE和Cn mdh过表达时，丝氨酸池得到补充（从而解除营养缺陷型），支持μ约0.3 h⁻¹的生长（图2C）。正如预期，单独pSEVA621·Cn mdh不能恢复原养型。单独表达Ec ltaE在供应丝氨酸时可支持生长（图2B），我们得出结论：Ec LtaE可将丝氨酸裂解为甘氨酸和甲醛。此外，单独过表达Ec ltaE在高甲醇浓度下促进生长（图2B、C），这归因于多种内源广谱醇脱氢酶活性。
【数据】菌株：P. putida ΔserA ΔΔglyA ΔfrmAC；培养基：DBM + 20 mM葡萄糖 + 10 mM甘氨酸 + 250–500 mM甲醇；μ：~0.3 h⁻¹；质粒：pSEVA621（低拷贝）；基因：Ec ltaE + Cn mdh（CT4-1，增强型）
通过yiaY过表达组成型激活内源PQQ依赖性醇脱氢酶基因
（此段原文未完整提供，根据上下文推断为关于ped簇组织和PQQ-MeDH激活策略的描述）
【数据】（原文未详述）
通过THF载体分子测试STC和mSC的同化模块1（M1·STC·mSC）
（此段原文未完整提供，根据上下文推断为利用ΔserA ΔΔgcvTHP菌株测试FtfL/Fch/MtdA介导的C1同化）
【数据】（原文未详述）
测试模块2（M2）：从C3和C4池生成丝氨酸
（此段原文未完整提供，根据上下文推断为基于天然活性测试STC模块化，ΔserA突变体在含20 mM葡萄糖的DBM培养基中的生长表现）
【数据】（原文未详述）
异源转氨作用及Mtk/Mcl表达挽救甘氨酸和丝氨酸营养缺陷型
（此段原文未完整提供，根据上下文推断为利用ΔserA菌株鉴定丙氨酸-乙醛酸转氨酶（Agt）候选基因，以及表达苹果酸硫激酶（Mtk）和苹果酰-CoA裂解酶（Mcl）的效果）
【数据】（原文未详述）
内源与异源活性组合激活STC及新型C1同化架构eSTC
（此段原文未完整提供，根据上下文推断为在M1·STC基础上进一步修饰ΔSGG-C1菌株过表达内源基因，最终组装出增强型STC（eSTC））
【数据】（原文未详述）
讨论与解读
丝氨酸循环是天然的氧不敏感途径，可从C1分子合成乙酰-CoA且无碳损失。对恶臭假单胞菌这类严格好氧菌而言，建立好氧生物过程至关重要，且能实现更广泛产品的生物合成。本研究系统探索了三种合成SC变体——STC、HSC和mSC，通过生长偶联筛选和模块化工程在基因组精简的恶臭假单胞菌菌株中进行了计算机与体内系统比较。恶臭假单胞菌代谢高度灵活，其天然架构与SC实施相契合——丙酮酸或PEP的大量羧化通量产生草酰乙酸并同化CO₂（即STC或mSC的M2），有利于这些合成C1模块的实施。此外，恶臭假单胞菌含有循环中大多数内源酶的多拷贝，包括三种丝氨酸脱氨酶同源物和多种C1脱氢酶。途径模块化对工程实施至关重要。
编译者解读
本研究的方法论亮点在于"计算指导—模块拆分—生长偶联筛选"的闭环策略：先用MDF和FBA预判各循环变体的热力学瓶颈与生长表现，再将复杂代谢网络拆为可独立测试的功能模块，以营养缺陷型为筛选压力逐模块验证。这种策略有效规避了整途径一步组装的高失败风险。尤其值得关注的是，研究意外发现内源PQQ依赖性醇脱氢酶可被招募用于甲醇氧化，并由此涌现出设计蓝图之外的eSTC拓扑——这提示合成生物学中"预设路径"与"底盘自组织"之间存在不可忽视的创造性张力。局限在于，当前结果仍以菌株生长为读数的概念验证为主，甲醇同化的实际碳流分配与产物合成效率尚需进一步量化。
DOI: 10.1016/j.tibtech.2025.06.001