来源：AI-2 type quorum-sensing signal enhances mercury resistance and adsorption in thermotolerant Bacillus subtilis（Journal of Hazardous Materials）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
沿海沉积物中的重金属污染对微生物群落构成持续选择压力。本研究从深圳湾沉积物中分离到一株耐热枯草芽孢杆菌G4，发现汞胁迫可选择性激活luxS相关的AI-2群体感应信号产生。外源添加AI-2前体DPD后，菌株在汞与热双重胁迫下的存活率显著提高，胞内活性氧降低、抗氧化酶活性升高、生物膜形成增强、汞吸附能力提升。沉积物微宇宙实验证实，菌株G4联合AI-2处理24小时后可溶性汞降低29.6%，为汞污染生物修复提供了新的机制见解。
研究背景
沿海沉积环境是陆源污染物的关键汇集区，也是海洋物质循环的重要节点。深圳湾作为珠江口西岸的半封闭浅水湾，长期受工业废水、城市径流和 domestic 排放影响，沉积物中积累了高浓度重金属和有机污染物。其中，汞因其高毒性、持久性及沿食物链生物富集和生物放大效应而备受关注。沉积物中汞以多种形态存在，包括元素汞（Hg⁰）、无机二价汞（Hg²⁺）和有机甲基汞（MeHg），后者神经毒性最强且最易被生物利用。沉积物中汞的生物地球化学循环主要由微生物驱动，因此微生物群落结构和功能既是汞生态风险的决定因素，也是其指示指标。此外，太阳辐射使深圳湾沉积物表层温度升高，尤其在夏季，本地微生物必须同时耐受金属毒性和高温，这可能推动耐热菌株的进化。目前关于群体感应信号——特别是AI-2——在汞抗性和固定化中的作用仍不清楚。
研究方法
2.1 样品采集、重金属分析与生态风险评估
沿深圳湾七个站位采集表层沉积物样品，采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定As、Hg和Cd浓度，用于后续生态风险评估。详细方案见补充信息S1。
【数据】采样站位：7个；检测元素：As、Hg、Cd；仪器：ICP-MS
2.2 耐汞菌株的分离、筛选与鉴定
从受风险影响的沉积物中，通过50°C梯度筛选分离高耐汞菌株，采用16S rRNA基因测序和邻接法系统发育分析进行鉴定。菌株分离、分子鉴定及后续生理和转录分析（如生长曲线、抗氧化测定和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR））的详细方案见补充信息S2。
【数据】筛选温度：50°C；鉴定方法：16S rRNA基因测序、邻接法系统发育分析
2.3 筛选菌株的生长曲线与抗氧化酶活性
使用自动微生物生长曲线分析仪（MGC−500，宁波新芝生物科技股份有限公司，中国宁波）监测不同温度和汞浓度下细菌在600 nm光密度（OD₆₀₀）的变化。使用Scientz-IID超声波破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司，中国宁波）破碎细菌细胞以获得均质悬浮液。超声破碎后，使用商业检测试剂盒（苏州格瑞斯生物科技有限公司）测定枯草芽孢杆菌G4中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性。菌株筛选、培养条件和酶学测定的详细信息见补充信息S3。
【数据】生长监测波长：OD₆₀₀；仪器：MGC−500生长曲线分析仪、Scientz-IID超声破碎仪；检测酶：SOD、CAT、GPx；试剂盒来源：苏州格瑞斯生物科技有限公司
2.4 RT-qPCR分析
采用−2ΔΔCt方法通过RT-qPCR定量关键基因的表达水平，RNA提取、cDNA合成和引物验证的详细方案见补充信息S4。
【数据】定量方法：−2ΔΔCt法
2.5 转录组测序与分析
菌株G4在非胁迫条件下或10 µM HgCl₂胁迫下培养4小时。随后收集细菌细胞（每个条件三个生物学重复），迅速液氮冷冻并保存至分析。总RNA提取、质量控制和文库构建由广州IGE生物科技有限公司完成。测序在Illumina NovaSeq 6000平台（PE150）上进行。过滤原始数据后，使用HISAT2将clean reads比对到参考基因组。基因表达水平以FPKM值量化。差异表达基因（DEGs）的筛选标准为|log₂倍数变化（FC）| ≥ 1且FDR校正P值 < 0.05。使用clusterProfiler R包对DEGs进行基因本体（GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。
【数据】HgCl₂浓度：10 µM；处理时间：4h；生物学重复：3个；测序平台：Illumina NovaSeq 6000（PE150）；DEGs标准：|log₂FC| ≥ 1，FDR校正P < 0.05
2.6 AI−2信号分子的检测与功能验证
#### 2.6.1 AI−2活性检测
AI−2活性检测参照先前描述的方法进行。简言之，哈维弧菌BB170在AB培养基（2 mM MgSO₄，0.4%甘油，1%蛋白胨）中于30°C过夜培养作为报告菌种子培养物。测试样品（高密度G4培养物的无细胞上清液或10 µM合成DPD标准品——DPD作为AI−2前体，可自发环化形成活性信号分子）经0.22 µm过滤制备，随后在100°C热处理15分钟以消除潜在的蛋白质介导效应。处理后的样品与新鲜AB培养基以1:9比例混合。该混合物再与等体积的OD₆₀₀ ≈ 0.5的BB170报告菌培养物混合。在30°C振荡培养3小时后，取200 µL混合物转移至黑色96孔板（耐思生物科技有限公司，无锡，中国），使用多功能酶标仪（Tecan Spark）测量化学发光信号（积分时间1秒）。新鲜AB培养基作为阴性对照（约200 RLU），10 µM DPD作为阳性对照（约20,000 RLU）。发光值以原始相对光单位（RLU）报告，因为所有测量均在相同条件下进行，报告菌密度和孵育时间一致。为排除残留汞或培养基成分的可能干扰，所有测试样品在测定前均经离心和过滤，并设置无细胞空白对照以考虑任何非生物效应。RLU值高于阴性对照10倍以上的样品视为AI−2阳性。
【数据】报告菌：Vibrio harveyi BB170；AB培养基成分：2 mM MgSO₄、0.4%甘油、1%蛋白胨；培养温度：30°C；过滤孔径：0.22 µm；热处理：100°C、15min；混合比例：1:9；报告菌OD₆₀₀：≈0.5；孵育时间：3h；检测体积：200 µL；阴性对照：约200 RLU；阳性对照：约20,000 RLU；阳性判定：RLU > 阴性对照10倍
#### 2.6.2 外源DPD添加与表型分析
设置三个实验条件：（1）低细胞密度（LCD）对照；（2）LCD + 胁迫（55°C + 10 µM Hg²⁺）；（3）LCD + 胁迫 + 10 µM DPD（Cayman Chemical）作为AI−2前体；在条件（3）中，DPD与两种胁迫因子同时添加。选择55°C是因为菌株G4在该温度下仍保持显著生长（图2A），代表其耐热性上限，因此构成有意义的温度胁迫，与深圳湾沉积物夏季潮间带条件相关。存活率通过平板菌落计数法测定。胞内ROS水平使用活性氧检测试剂盒（Biolight ROK001，广州百奥亮生物科技有限公司）测定，荧光强度在激发/发射波长488/525 nm处检测。生物膜定量采用结晶紫染色法，测定OD₅₉₀。汞吸附实验中，细菌细胞经收集、洗涤后重悬于含汞培养基中，所有处理组标准化初始细胞密度（OD₆₀₀ = 1.0）。样品处理和ICP-MS测量方法见2.1节。
【数据】胁迫条件：55°C + 10 µM Hg²⁺；DPD浓度：10 µM；ROS检测：488/525 nm激发/发射波长；生物膜定量：结晶紫染色法，OD₅₉₀；初始细胞密度：OD₆₀₀ = 1.0
2.7 扫描电子显微镜（SEM）观察
样品预处理如上所述。固定后的细菌细胞用0.1 M磷酸盐缓冲液洗涤三次，然后通过梯度乙醇系列（30%、50%、70%、90%、100%）脱水，每步15分钟。脱水样品使用Leica EM CPD300系统进行临界点干燥。样品粘贴在导电胶上，使用离子溅射镀膜仪（Hitachi MC1000）喷镀5 nm铂层。使用场发射扫描电子显微镜（Hitachi SU8010）在5 kV加速电压下观察。
【数据】洗涤缓冲液：0.1 M PBS；乙醇梯度：30%、50%、70%、90%、100%；每步时间：15min；镀膜：5nm铂层；加速电压：5kV；仪器：Leica EM CPD300、Hitachi MC1000、Hitachi SU8010
2.8 沉积物微宇宙验证汞固定化
为评估AI−2相关的汞固定化效应是否能在纯培养系统之外观察到，使用含汞沉积物浆液建立沉积物微宇宙，保留其原生微生物群落（即沉积物未经高压灭菌或灭菌处理）。这一设计旨在保持环境真实性，因为灭菌沉积物会消除原生微生物活性并改变沉积物理化性质。设置四个处理组：Hg、Hg + DPD、Hg + G4和Hg + G4 + DPD。微宇宙在Luria-Bertani（LB）培养基（Coolaber科技有限公司，北京，中国）中培养24小时，在0、12和24小时收集样品。离心后收集上清液用于可溶性汞分析，而含有沉积物颗粒、细菌生物量和细胞外基质的沉淀部分在操作上定义为沉积物/生物质结合汞组分。可溶性汞去除效率根据0至24小时可溶性汞的减少量计算。luxS、merA、merT、epsA、epsB和epsC的相对表达水平通过RT-qPCR定量。
【数据】处理组：4个（Hg、Hg+D PD、Hg+G4、Hg+G4+DPD）；培养基：LB；培养时间：24h；取样时间点：0、12、24h
研究结果
3.1 沿海沉积物重金属分布特征与微生物筛选
沿深圳湾海岸从七个代表性沉积物站位（S1–S7）采集样品（图1A）。能谱X射线检测在沉积物中检测到砷（As）、汞（Hg）和镉（Cd）的明显特征峰（图1B），表明三种主要重金属富集。定量分析显示，As含量最高（约15–30 µg g⁻¹），其次是Cd（0.8–2.4 µg g⁻¹）和Hg（0.5–1.8 µg g⁻¹）（图1C）。然而，七个站位的金属浓度差异显著，其中S5站位的总金属负荷最高。为评估金属富集的潜在生态风险，计算了富集指数（Ei）和风险指数（RI）（图1D–E）。结果表明深圳湾各采样点金属风险水平存在明显的空间差异。S6站位的Ei和RI值最高（RI > 300），被归类为高生态风险区域，主要受As和Hg积累的影响。这些位点As和Hg的特别富集对底栖微生态环境构成威胁。特别是，可生物利用形态的汞对沉积物微生物群落施加强烈的选择压力，通常抑制微生物多样性，同时选择具有特定抗性机制的菌株。基于S6站位显著的金属富集特征、相对最高的污染负荷和生态风险（RI > 300，可能因其靠近工业排放源），选择该位置的沉积物筛选耐金属菌株。在筛选的目标菌株中，几种耐热分离株表现出强汞抗性。16S rRNA基因测序和系统发育分析显示，这些菌株主要属于芽孢杆菌属，包括枯草芽孢杆菌、borstelensis短芽孢杆菌和嗜热脂肪地芽孢杆菌等（图S1A）。芽孢杆菌属微生物以其强大的环境适应性著称，能够形成高抗性内生孢子以耐受高温、辐射和化学毒素等各种极端条件。更重要的是，许多芽孢杆菌物种已被报道具有多种重金属抗性机制，包括通过外排泵（如CadA、ZntA）排出金属离子、通过EPS螯合和固定重金属，以及表达特定还原酶（如汞还原酶MerA）将高价有毒金属转化为低毒或挥发性形态。因此，芽孢杆菌物种在S6站位高胁迫生境中的优势是其固有生理性状与环境选择压力共同作用的结果。
【数据】As含量：约15–30 µg g⁻¹；Cd含量：0.8–2.4 µg g⁻¹；Hg含量：0.5–1.8 µg g⁻¹；最高风险站位：S6（RI > 300）
3.2 热与重金属联合胁迫下菌株的生长与抗性差异
为系统评估分离的耐热菌株的汞抗性，选择来自不同属的九个代表性分离株（编号G1–G9）进行进一步检测。首先测定其耐热性。如图2A所示，大多数菌株在45–50°C范围内生长最佳，OD₆₀₀值一般在1.0–1.6范围内，而在28°C时生长显著受抑（OD₆₀₀ < 0.5），证实了其嗜热特性。其中，枯草芽孢杆菌G4表现出最高的耐热性，即使在55°C下仍维持OD₆₀₀为0.96 ± 0.08，显著（P < 0.05）优于其他分离株，如Geobacillus sp.（G2，0.24 ± 0.05）和B. borstelensis（G3，0.13 ± 0.06）。接下来，在50°C（深圳湾沉积物夏季潮间带暴露期间通常达到的温度）下评估这些耐热菌株的汞抗性。在测试的不同汞浓度（0.5–10 µM HgCl₂）下，所有菌株均表现出浓度依赖性生长抑制。值得注意的是，在10 µM Hg²⁺暴露3天后，枯草芽孢杆菌G4维持OD₆₀₀为0.73 ± 0.04，显著高于其他菌株（0.28–0.45；P < 0.01）。平板稀释实验进一步证实，菌株G4在50°C、10 µM Hg²⁺条件下形成密集菌落，证明其在高温条件下的强汞抗性（图S2A）。基于这些比较筛选结果，选择枯草芽孢杆菌G4进行后续分析，因为它在九个分离株中表现出最强的耐热性和汞抗性组合。具体而言，G4在55°C下生长最好，且比其它菌株更能耐受10 µM Hg²⁺，后者在这些条件下均生长不良。鉴于这种强健的表型，进一步研究了观察到的胁迫抗性背后的机制。
在菌株G4中测定了关键抗氧化酶的活性（图2B–D）。随着Hg²⁺浓度升高和处理时间延长，SOD、CAT和GPx的活性显著增加。SOD活性在10 µM处理4小时时达到146.7 ± 8.6 U mg⁻¹，是对照的2倍（P < 0.01）；CAT活性增加至32.5 ± 1.1 U mg⁻¹，GPx活性增加至39.6 ± 1.4 nmol min⁻¹ mg⁻¹。重金属离子可通过Fenton反应或干扰电子传递链诱导ROS产生，导致蛋白质、脂质和DNA的氧化损伤。SOD、CAT和GPx构成胞内ROS清除的核心酶级联系统。它们的协同上调提供了细胞维持氧化还原稳态和抵抗氧化损伤的直接证据，表明G4通过增强其抗氧化酶系统来减轻Hg²⁺胁迫下的氧化压力。
RT-qPCR（图S2B）进一步显示，与对照相比，编码汞特异性还原酶（MerA）和转运蛋白（MerT）的merA和merT基因在汞处理4小时后的转录水平分别增加了6.3倍和5.1倍，而调控基因litR和sigB的表达水平增加了约3倍（P < 0.01）。24小时后，这些基因的表达水平下降但仍显著高于初始水平，表明对胁迫的快速早期响应。Mer系统是细菌抗无机汞的经典机制，涉及通过MerT摄取Hg²⁺，随后由MerA还原为挥发性元素汞（Hg⁰），从而实现解毒。因此，G4中merA和merT表达的快速诱导为其单细胞水平的高汞抗性提供了清晰的分子解释。
SEM观察进一步揭示了细胞形态的变化（图2E）。在低浓度（0.5 µM Hg²⁺）下，细胞分散且表面相对光滑。在高浓度（10 µM Hg²⁺）下，细胞明显聚集，形成由粘性物质相互连接的致密簇。这种聚集现象表明，在高胁迫下细胞可能发生生理收缩以增强抗性。这种类生物膜形态的出现提示群体水平适应性策略的启动。细菌生物膜是微生物附着于表面并被自身产生的EPS包裹的群落生长状态。大量研究表明，生物膜形成可大大增强细菌群落对各种环境胁迫（包括抗生素和氧化应激）的抗性。其保护机制是多方面的：EPS基质可作为物理屏障，限制有害物质的扩散和渗透；其丰富的阴离子基团（如羧基、磷酸基）可有效螯合和固定金属阳离子，降低其生物利用度。此外，生物膜内的化学梯度和代谢异质性可使部分细胞进入低代谢状态的"休眠"模式，从而降低其对毒性物质的敏感性。
【数据】最适生长温度范围：45–50°C；G4在55°C的OD₆₀₀：0.96 ± 0.08；G2在55°C的OD₆₀₀：0.24 ± 0.05；G3在55°C的OD₆₀₀：0.13 ± 0.06；G4在10 µM Hg²⁺、3天的OD₆₀₀：0.73 ± 0.04；其他菌株OD₆₀₀范围：0.28–0.45；SOD活性：146.7 ± 8.6 U mg⁻¹（10 µM，4h，为对照2倍）；CAT活性：32.5 ± 1.1 U mg⁻¹；GPx活性：39.6 ± 1.4 nmol min⁻¹ mg⁻¹；merA表达增加：6.3倍；merT表达增加：5.1倍；litR和sigB表达增加：约3倍
3.3 转录组分析揭示汞胁迫下的差异表达基因与通路
【数据】原文未详述该图具体数值
3.4 AI−2信号在汞胁迫响应中的作用
【数据】原文未详述该图具体数值
3.5 AI−2对生物膜形成和汞吸附能力的影响
【数据】原文未详述该图具体数值
3.6 沉积物微宇宙验证AI−2增强汞固定化
【数据】原文未详述该图具体数值
讨论与解读
本研究证明AI−2信号可增强耐热枯草芽孢杆菌G4的汞胁迫抗性和固定化能力。在机制层面，AI−2协调胞内与胞外响应：胞内降低ROS积累并增强SOD、CAT和GPx活性，与硫代谢基因（如cysI）上调一致，支持谷胱甘肽合成和氧化还原稳态；胞外上调epsABC和tasA，促进生物膜形成，增加表面结合和沉淀结合汞组分，支持EPS在汞封存中的作用。综合来看，AI−2协调胞内解毒和胞外固定化，提供了一种群体水平的保护策略，在持续重金属胁迫下可能特别有利。这些发现为沿海沉积物中微生物辅助汞修复提供了理论基础。研究存在一定局限性，包括微宇宙验证的短期性、沉积物/生物质结合汞组分的操作性定义、需要鉴定AI−2信号的精确下游分子靶标，以及沉积物微宇宙中原生微生物群落对汞固定化的潜在贡献无法完全排除。未来研究应进一步考察长期汞形态转化、混合群落响应和现场规模性能。
编译者解读
该研究从环境样本出发，发现AI-2群体感应信号在汞胁迫中的双重调控角色——既激活胞内抗氧化防御，又促进胞外生物膜介导的汞固定化。这一发现拓展了群体感应在重金属生物修复中的功能认知，尤其对温度波动大的潮间带沉积物修复具有现实意义。方法上，从菌株筛选、转录组分析到微宇宙验证的递进设计值得借鉴。然而，AI-2下游具体分子靶点尚未明确，且微宇宙实验仅持续24小时，长期效果与复杂群落中的实际贡献仍需进一步验证。
参考来源
Han S. AI-2 type quorum-sensing signal enhances mercury resistance and adsorption in thermotolerant Bacillus subtilis. Journal of Hazardous Materials, 2026. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2026.143148
DOI: 10.1016/j.jhazmat.2026.143148