来源：Modulation of Bacillus subtilis anti-Listeria activity via the ComQXPA quorum sensing system（Microbiological Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
单核细胞增生李斯特菌是引发李斯特菌病的重要食源性病原体，在食品环境中形成顽固生物被膜，对人类健康构成严重威胁。本研究以产表面活性素的枯草芽孢杆菌PS-216为对象，系统解析了其ComQXPA群体感应系统调控抗李斯特菌活性的分子机制。研究发现，该菌株通过协调产生表面活性素（surfactin）和杆菌溶素（bacilysin）两种抗菌化合物，对单核细胞增生李斯特菌和李斯特氏菌分别实现5.9和6.7个对数级的强效杀灭，并显著抑制生物被膜形成。该发现为食品加工环境中李斯特菌的绿色防控提供了新策略。
研究背景
单核细胞增生李斯特菌是一种革兰氏阳性人畜共患病原体，引起的李斯特菌病在欧盟食源性疾病中发病率排名第五，却拥有最高的住院率（96.5%）和死亡率（20%）。临床上，李斯特菌病可表现为自限性胃肠炎或侵袭性疾病，包括败血症、神经李斯特菌病和妊娠并发症。该病原体在食品加工环境中形成持久生物被膜，能在极端温度（1–45°C）、宽pH范围、低氧、高盐（高达30% NaCl）等恶劣条件下存活。由于单核细胞增生李斯特菌需要BSL2生物安全等级设施，限制了研究可及性，许多实验室采用非致病性的英诺克李斯特菌作为替代模型。已有研究表明，英诺克李斯特菌能有效模拟单核细胞增生李斯特菌对消毒剂、热、酸等处理的响应。
枯草芽孢杆菌PS-216是已证实的表面活性素产生菌，对革兰氏阴性病原体具有抗菌活性，但其对革兰氏阳性病原体的效果及机制尚不清楚。本研究旨在解析该菌株对李斯特菌的拮抗作用及其ComQXPA群体感应系统的调控机制。
研究方法
2.1 菌株构建与培养
本研究使用模式菌株英诺克李斯特菌ATCC33090、单核细胞增生李斯特菌ATCC7644及土壤分离株枯草芽孢杆菌PS-216作为野生型。使用PS-216衍生的敲除突变株ΔcomQ、ΔcomA、ΔsrfAA、ΔbacA及双突变株ΔsrfAAΔbacA（补充表S1），评估各基因在枯草芽孢杆菌与英诺克李斯特菌和单核细胞增生李斯特菌共培养相互作用中的参与情况。此外，使用在comQ（PcomQ-yfp）、srfAA（PsrfAA-yfp）和bacA（PbacA-yfp）启动子下表达黄色荧光蛋白（YFP）的PS-216菌株，以及组成型表达红色荧光蛋白mKate2的PS-216-mKate2菌株（补充表S1），评估共培养与单培养条件下的表达差异。本研究使用的所有枯草芽孢杆菌菌株、质粒和寡核苷酸分别列于补充表S1和S2。
BM1878（PsrfAA-yfp mKate）突变菌株通过将质粒DNA pEM1106（补充表S2）转化至枯草芽孢杆菌BM1097菌株（Stefanic et al., 2015）获得。BM1938菌株通过将质粒DNA pEM1109（补充表S2）转化至枯草芽孢杆菌BM1629菌株（Špacapan et al., 2020）获得。为制备携带sacA::PsrfAA-yfp的pEM1106质粒，使用引物对PsrfAA-EcoRI（5' CGGAATTCGCTATATGGAATTGATTGATATCG 3'（Danevčič et al., 2023）/oDR78 5' GCCGGATCCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC 3'（Fujita and Losick, 2002））从枯草芽孢杆菌DL722基因组DNA（López et al., 2009）PCR扩增PsrfAA-yfp区域。片段经EcoRI和BamHI双酶切后，连接至pSac-Kan（Middleton and Hofmeister, 2004）的EcoRI和BamHI位点。为制备携带amyE::PbacA-yfp的pEM1109质粒，使用引物对PbacA-F（5' GCGGAATTCACAAAGTTTCTAAATTCCTAT 3'）/PbacA-R（5' CCCAAGCTTGAGCACCAACCAATCTTTTAA 3'）（本研究设计）从枯草芽孢杆菌PS-216基因组DNA（Stefanic and Mandic-Mulec, 2009）PCR扩增PbacA区域。片段经EcoRI和HindIII双酶切后，连接至pKM3（Doan et al., 2005）的EcoRI和HindIII位点。
所有细菌菌株保存在−80°C，保存液为80% LB肉汤（Lennox，Condalab，马德里，西班牙）和20%甘油（Honeywell，Riedel-de Haën，泽尔策，德国）。李斯特菌属培养物在含ALOA富集选择性补充剂的ALOA琼脂（Biolife，米兰，意大利）上复苏，枯草芽孢杆菌PS-216野生型在LB琼脂上培养，枯草芽孢杆菌突变株在含相应抗生素的LB琼脂（Lennox，Condalab，马德里，西班牙）上培养（红霉素20 mg/L（Carl Roth，卡尔斯鲁厄，德国）、壮观霉素100 mg/L（Sigma Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）、卡那霉素100 mg/L（Carl Roth，卡尔斯鲁厄，德国）和氯霉素4 mg/L（Sigma Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国））。过夜培养物在Mueller Hinton肉汤（MHB，Oxoid，Thermo Fisher Diagnostics，兰斯米尔，荷兰）中、37°C、200 rpm振荡条件下制备。
【数据】保存条件：−80°C，80% LB肉汤+20%甘油；抗生素浓度：红霉素20 mg/L、壮观霉素100 mg/L、卡那霉素100 mg/L、氯霉素4 mg/L；培养条件：MHB培养基，37°C，200 rpm
2.2 共培养实验
过夜培养物首先在MHB培养基中稀释至OD600nm = 0.2（枯草芽孢杆菌为5×10⁶ CFU/mL，英诺克李斯特菌/单核细胞增生李斯特菌为5×10⁷ CFU/mL）。共培养及相应单培养通过将枯草芽孢杆菌和李斯特菌进一步100倍稀释制备，使枯草芽孢杆菌：李斯特菌的比例为1:10（5×10⁴：5×10⁵ CFU/mL）。单培养和共培养在培养起始时（0 h）和37°C静置条件下培养24 h后取样。培养物通过剧烈吹打均质化，系列稀释后分别涂布于选择性ALOA琼脂用于李斯特菌计数，以及含适当抗生素的LB琼脂用于枯草芽孢杆菌计数，以CFU/mL表示。细菌浓度经log10转换，以平均log CFU/mL ± 标准差表示，标准差由至少三个生物学重复计算。
【数据】初始OD600nm = 0.2；接种比例：枯草芽孢杆菌:李斯特菌 = 1:10（5×10⁴:5×10⁵ CFU/mL）；培养条件：37°C静置24 h；计数方法：ALOA琼脂（李斯特菌）、含抗生素LB琼脂（枯草芽孢杆菌）
2.3 群体培养和单细胞水平的comQ、srfAA和bacA表达分析
通过测量comQ（PcomQ-yfp）、srfAA（PsrfAA-yfp）和bacA（PbacA-yfp）启动子下的黄色荧光蛋白（YFP）荧光强度，以及组成型表达红色荧光蛋白mKate2的枯草芽孢杆菌PS-216-mKate2（补充表S1），在群体培养和单细胞水平测定枯草芽孢杆菌PS-216野生型菌株中comQ、srfAA和bacA的表达。培养物按"共培养"部分所述方法制备，取200 μL样品转移至黑色底透明的96孔聚苯乙烯微孔板（Cellstar，Greiner Bio-One，奥地利）。微孔板用微孔胶带密封以减少蒸发。
群体培养表达分析中，板在Cytation 5成像读取仪（BioTek，美国）中37°C静置孵育24 h。YFP（激发λₑₓ = 500 nm，发射λₑₘ = 530 nm，增益 = 80）和RFP（激发λₑₓ = 570 nm，发射λₑₘ = 620 nm，增益 = 100）强度每30分钟测量一次。单培养的最高RFP荧光强度设为最大值（1），其余RFP强度归一化以获得单培养和共培养的相对组成型荧光强度（cRFP）。启动子活性通过YFP荧光强度除以cRFP归一化至生物量。数据以YFP/cRFP平均值 ± 标准差表示，标准差由至少三个生物学重复计算。
单细胞水平分析中，培养物在早期指数期（孵育4 h后）和稳定期（孵育24 h后）取样，使用BD FACSMelody细胞分选仪（BD Biosciences，Becton Dickinson）分析。YFP（蓝色激光滤光片BP 527/32和LP 507/5）和RFP（黄绿色激光滤光片BP 613/18，LP 605/10）荧光强度每个样品测量100,000个事件，至少三个生物学重复。流式细胞术数据使用FlowJo 10.10.0软件（BD Biosciences，美国）分析。每个100,000事件样品确定中位荧光强度，通过Student's t检验分析单培养和共培养之间的差异。计算单培养和共培养之间表达差异的log2倍数变化（L2FC）。
【数据】测量体积：200 μL/孔；YFP参数：激发500 nm/发射530 nm/增益80；RFP参数：激发570 nm/发射620 nm/增益100；测量间隔：30 min；培养时间：24 h；温度：37°C；单细胞分析时间点：4 h和24 h；流式事件数：100,000/样品
2.4 黏附与生物被膜形成实验的培养物制备
为检测枯草芽孢杆菌胞外化合物对英诺克李斯特菌黏附和生物被膜形成的影响，从枯草芽孢杆菌PS-216野生型和突变株ΔcomQ、ΔcomA、ΔsrfAA、ΔbacA及ΔsrfAAΔbacA制备无细胞上清液（CFS）。CFS通过在MHB培养基中37°C、200 rpm振荡培养的过夜培养物经滤器灭菌（0.2 μm滤膜，Chromafil，Macherey-Nagel，迪伦，德国）获得。此外，制备英诺克李斯特菌在MHB培养基中过夜培养的CFS。
黏附和生物被膜形成实验中，英诺克李斯特菌培养物在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB，Condalab，Laboratorios Conda S.A.，马德里，西班牙）中37°C、200 rpm振荡培养16 h作为稳定期培养物。取100 μL培养物转移至黑色底透明的96孔聚苯乙烯微孔板用于生物被膜成像，以及透明96孔聚苯乙烯微孔板（VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州，美国）用于黏附测定。将等体积（100 μL）的枯草芽孢杆菌PS-216野生型和突变株CFS、英诺克李斯特菌CFS（营养耗竭对照）、生理盐水（Ss，0.9% NaCl，无营养对照）和新鲜MHB培养基（高营养对照）加入含英诺克李斯特菌稳定期TSB培养物的孔中。微孔板在37°C静置条件下孵育24 h。孵育后，取各孔含处理过的稳定期浮游李斯特菌的上清液样品，测定剩余浮游细胞浓度作为实验对照，以排除枯草芽孢杆菌CFS对制备的李斯特菌培养物的细胞毒性效应。板用于后续黏附和生物被膜成像分析。
【数据】CFS制备：0.2 μm滤膜过滤；培养条件：MHB培养基，37°C，200 rpm；TSB培养时间：16 h；处理体积：100 μL培养物+100 μL CFS/对照；孵育条件：37°C静置24 h；生理盐水浓度：0.9% NaCl
2.5 聚苯乙烯表面的黏附分析
（原文该部分在此处截断，后续步骤未在节选中完整呈现）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 枯草芽孢杆菌PS-216在共培养中的抗李斯特菌效应受ComQXPA QS系统调控，并通过表面活性素和杆菌溶素发挥作用
共培养实验揭示了枯草芽孢杆菌PS-216对单核细胞增生李斯特菌及其替代菌株英诺克李斯特菌的强效拮抗活性。两种李斯特菌在MHB培养基中24 h孵育后，单培养生长模式相似，但与枯草芽孢杆菌PS-216共培养时生长受到显著抑制（图1A）。英诺克李斯特菌对PS-216的拮抗作用比单核细胞增生李斯特菌更敏感，最终细胞密度分别为1.18 log CFU/mL和2.21 log CFU/mL（p = 0.0007）。枯草芽孢杆菌PS-216菌株（包括野生型（图1B）和所有测试的突变株（补充图S1））的生长不受与任一李斯特菌共培养的影响。
为研究ComQXPA群体感应（QS）系统对观察到的拮抗活性的贡献，我们评估了关键QS组分缺陷的敲除突变株：ComQ异戊烯基转移酶（ΔcomQ）、ComA调节因子（ΔcomA）以及ComA调控的抗菌化合物表面活性素（ΔsrfAA）和杆菌溶素（ΔbacA）。所有测试的枯草芽孢杆菌菌株与单培养对照相比均显著降低两种李斯特菌的生长。然而，PS-216野生型菌株表现出最强的抑制效果，分别使英诺克李斯特菌和单核细胞增生李斯特菌的生长减少6.7 log CFU/mL和5.9 log CFU/mL（图1A，p < 0.0001）。此外，所有突变株的拮抗活性均显著低于野生型菌株。ΔcomA突变株和双突变株ΔsrfAAΔbacA表现出最弱的抑制效果，分别使英诺克李斯特菌生长减少3.3 log CFU/mL和2.7 log CFU/mL（图1C），使单核细胞增生李斯特菌生长减少1.3 log CFU/mL和1.7 log CFU/mL（图1D）。尽管与单突变株ΔsrfAA或ΔbacA相比效果降低，但ΔcomA和ΔsrfAAΔbacA突变株相对于单培养对照仍对两种李斯特菌表现出显著的抑制活性。
【数据】英诺克李斯特菌最终密度：1.18 log CFU/mL；单核细胞增生李斯特菌最终密度：2.21 log CFU/mL；p = 0.0007；野生型抑制效果：英诺克李斯特菌减少6.7 log CFU/mL、单核细胞增生李斯特菌减少5.9 log CFU/mL（p < 0.0001）；ΔcomA抑制效果：英诺克李斯特菌减少3.3 log CFU/mL、单核细胞增生李斯特菌减少1.3 log CFU/mL；ΔsrfAAΔbacA抑制效果：英诺克李斯特菌减少2.7 log CFU/mL、单核细胞增生李斯特菌减少1.7 log CFU/mL
3.2 基因表达分析
使用YFP报告基因融合体监测与英诺克李斯特菌共培养期间ComQXPA QS系统的活性，包括comQ（PcomQ-yfp）、srfAA（PsrfAA-yfp）和bacA（PbacA-yfp）启动子。表达分析在24 h内的群体培养水平以及孵育4 h（早期指数期）和24 h（晚期稳定期）的单细胞水平进行。
群体培养分析显示，PcomQ和PbacA的活性在单培养和共培养条件之间无统计学显著差异（图2A和2C）。然而，在11–14 h孵育期间，PsrfAA活性在单培养中显著高于共培养（图2B，p < 0.05）。
单细胞分析提供了QS系统调控的更详细见解。对于comQ表达，表达comQ-YFP的细胞百分比在共培养（15%）和单培养（16%）之间相似（图3A）。然而，共培养中4 h时的荧光强度显著增强（log₂倍数变化 = 0.37，p < 0.05）（图3D）。
srfAA表达在共培养期间表现出动态的时间调控。共培养中4 h时srfAA表达细胞的比例比单培养增加4.4倍，但24 h时下降6.4倍（图3B，补充图S2）。相反，每个表达细胞的荧光强度在4 h时显著降低（log₂倍数变化 = −1.34，p < 0.001），但在24 h时保持不变（图3E）。
bacA表达在共培养期间持续上调。共培养中两个时间点的bacA表达细胞百分比均显著增加：4 h时增加1.8倍（p = 0.032），24 h时增加3.3倍（p = 0.001）（图3C）。此外，每个表达细胞的荧光强度在共培养中4 h（log₂倍数变化 = 0.4，p < 0.001）和24 h（log₂倍数变化 = 0.9，p < 0.001）均较高（图3F，补充图S2）。
【数据】comQ表达细胞比例：共培养15%、单培养16%；comQ 4 h荧光强度L2FC = 0.37（p < 0.05）；srfAA表达细胞比例变化：4 h增加4.4倍、24 h下降6.4倍；srfAA 4 h荧光强度L2FC = −1.34（p < 0.001）；bacA表达细胞比例变化：4 h增加1.8倍（p = 0.032）、24 h增加3.3倍（p = 0.001）；bacA荧光强度L2FC：4 h = 0.4（p < 0.001）、24 h = 0.9（p < 0.001）
3.3 枯草芽孢杆菌PS-216无细胞上清液的抗李斯特菌生物被膜效应受ComQXPA QS系统控制且主要依赖表面活性素产生
为评估枯草芽孢杆菌胞外化合物的抗生物被膜活性及ComQXPA QS系统的作用，我们检测了在枯草芽孢杆菌PS-216野生型及其敲除突变株（ΔcomQ、ΔcomA、ΔsrfAA、ΔbacA和ΔsrfAAΔbacA）无细胞上清液（CFS）存在下英诺克李斯特菌的黏附和生物被膜形成。对照包括新鲜MHB培养基（富营养）、生理盐水（无营养）和英诺克李斯特菌CFS（营养耗竭）。黏附通过测量聚苯乙烯微孔板表面的黏附英诺克李斯特菌细胞密度（log CFU/mL）进行定量（图4A），生物被膜结构使用共聚焦显微镜可视化（图4B）。
野生型枯草芽孢杆菌PS-216 CFS对英诺克李斯特菌表现出强效抗黏附活性。与英诺克李斯特菌CFS相比，黏附减少0.9 log CFU/mL；与MHB培养基相比，黏附减少2.5 log CFU/mL。这种抑制效果在ComQXPA系统突变株（ΔcomQ、ΔcomA）中显著减弱。总体而言，暴露于ΔcomQ、ΔcomA、ΔsrfAA、ΔbacA和ΔsrfAAΔbacA突变株CFS的英诺克李斯特菌黏附也较PS-216野生型CFS处理组抑制更少，且与营养贫乏对照（生理盐水、英诺克李斯特菌CFS）的水平相当（图4A）。
然而，枯草芽孢杆菌PS-216野生型CFS在这些条件下对稳定期浮游李斯特菌未显示细胞毒性效应（补充图S3）。虽然ΔcomQ CFS的上清液中浮游李斯特菌细胞浓度显著低于富营养对照（仅MHB）和ΔcomA CFS，但与其他对照和枯草芽孢杆菌突变株CFS相比，ΔcomQ CFS中李斯特菌存活率无显著差异（补充图S3）。此外，黏附与浮游李斯特菌浓度之间未观察到显著相关性（来自对照和CFS处理样品）（Spearman r = 0.550，p = 0.1328）。另外，用枯草芽孢杆菌野生型CFS处理的李斯特菌的黏附指数（log 黏附李斯特菌 / log 总李斯特菌（黏附+浮游））仅与用ΔsrfAA CFS处理的李斯特菌相比有统计学差异（补充图S4）。
这些结果表明，在这些条件下，枯草芽孢杆菌CFS抑制聚苯乙烯表面的黏附独立于浮游李斯特菌浓度，且表面活性素在该观察到的效应中起主要作用。
共聚焦显微镜定性观察揭示了不同培养条件下的不同生物被膜形态。在MHB培养基、生理盐水和英诺克李斯特菌CFS中，英诺克李斯特菌形成覆盖聚苯乙烯表面的典型草坪型生物被膜。然而，当暴露于枯草芽孢杆菌PS-216野生型CFS时，英诺克李斯特菌生物被膜形成被严重破坏，形成孤立聚集体，无连续草坪形成，其他测试的突变株CFS也呈现该特征。来自表面活性素缺陷突变株（ΔsrfAA）的CFS允许英诺克李斯特菌形成聚集体和薄草坪型生物被膜结构，表明表面活性素在破坏李斯特菌生物被膜形成中具有特定作用。相比之下，ΔcomQ和ΔcomA CFS处理相比野生型CFS促进了更明显的聚集体形成，同时减少了草坪型生物被膜覆盖。ΔbacA和ΔsrfAAΔbacA CFS均影响草坪型生物被膜形成，留下中断的生物被膜斑块。
【数据】野生型CFS抗黏附效果：较李斯特菌CFS减少0.9 log CFU/mL、较MHB减少2.5 log CFU/mL；Spearman相关：r = 0.550，p = 0.1328；生物被膜形态：MHB/生理盐水/李斯特菌CFS为草坪型，野生型CFS为孤立聚集体，ΔsrfAA CFS为聚集体+薄草坪型，ΔcomQ/ΔcomA CFS为明显聚集体+减少草坪覆盖，ΔbacA/ΔsrfAAΔbacA CFS为中断斑块
讨论与解读
枯草芽孢杆菌PS-216作为潜在益生菌，已被广泛研究其对革兰氏阴性食源性病原体空肠弯曲杆菌和肠道沙门氏菌的抗菌活性，显示出强益生潜力。然而，其对革兰氏阳性病原体的效果及机制尚不清楚。本研究证实，PS-216对单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌分别实现5.9和6.7个对数级的杀灭效果，超过了此前报道的对空肠弯曲杆菌（约4个对数级）和肠道沙门氏菌（约2个对数级）的效果。ComQXPA群体感应系统通过协调表面活性素和杆菌溶素的产生来集中调控抗李斯特菌活性，两种化合物对强效拮抗效果均不可或缺，共培养触发表达增强。此外，PS-216有效抑制李斯特菌生物被膜形成，表面活性素阻止草坪型生物被膜形成。单核细胞增生李斯特菌与英诺克李斯特菌相似的响应模式支持后者作为合适替代菌株，但存在物种特异性差异。
【编译者解读】 该研究将群体感应调控机制与抗菌代谢物功能解析有机结合，明确了ComQXPA系统作为"总开关"协调两种抗菌化合物的时序表达——这在合成生物学视角下具有重要设计价值：通过工程化改造群体感应回路，有望实现抗菌化合物的精准时序调控与产量优化。表面活性素在抗生物被膜中的核心作用也提示，靶向生物被膜形成的表面活性素类似物设计是食品防腐领域的可行方向。不过，研究主要基于共培养和体外模型，体内益生效果及复杂食品基质中的实际应用效果仍需进一步验证。
DOI: 10.1016/j.micres.2026.128483