来源：Genomic insights into the biotechnological potential of Bacillus subtilis DW-2 for enhanced recovery of heavy oil（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
重油黏度高、流动性差，传统开采技术成本高且易造成环境风险。本研究从新疆克拉玛依油田重油样品中分离到一株具有高效降解与产表面活性剂能力的枯草芽孢杆菌DW-2，30天内实现重油降解率34.2%、黏度降低33.7%，并通过全基因组测序揭示了其降解重油组分的核心基因与代谢通路。该菌株为微生物强化采油（MEOR）提供了具有应用潜力的候选菌株。
研究背景
随着全球能源消费持续增长和常规轻质原油供应日益紧张，重油开采受到广泛关注。重油占全球石油资源的70%以上，属于战略性能源资源。然而，重油中树脂、沥青质、杂原子和重金属的存在导致其密度大（>920 kg/m³）、黏度高（>100 mPa·s）、API重度低（<20°），严重阻碍了油藏和井筒中的原油流动。现有冷采和热采技术成本高昂、操作复杂，且存在储层损伤和二次污染风险。微生物强化采油（MEOR）利用微生物及其代谢产物提高重油采收率，已被证明是一种有效的替代策略。
研究方法
2.1 油样与培养基
重质原油（用于菌株分离和生物降解试验）和普通重油（用于生物表面活性剂生产试验）均采自中国新疆克拉玛依油田。两种油样黏度不同（50°C下分别为19,235 mPa·s和381 mPa·s）。采用Liu等（2023）报道的方法配制无机盐培养基（MSM）。向MSM中添加重油（20.00 g·L⁻¹）制备富集培养基。菌株分离、纯化、发酵和保藏采用牛肉膏-蛋白胨（BEP）培养基（Cheng and Xue, 2012）。筛选重油降解菌时，MSM中补充重油（20 g·L⁻¹）和琼脂糖（10 g·L⁻¹）。生物降解培养基含MSM中的重油（20 g·L⁻¹），并以葡萄糖和酵母提取物（各2 g·L⁻¹）作为共底物。所有培养基（pH 7.0）在使用前于121°C高压灭菌30分钟。
【数据】油样黏度：19,235 vs. 381 mPa·s（50°C）；重油浓度：20.00 g·L⁻¹（富集/降解培养基）；琼脂糖：10 g·L⁻¹；共底物：葡萄糖和酵母提取物各2 g·L⁻¹；pH：7.0；灭菌：121°C，30 min
2.2 重油降解菌的分离、筛选与鉴定
#### 2.2.1 菌株分离与纯化
按照Ke等（2019）描述的方法，使用重油富集和分离重油降解菌。将10 g油样加入富集培养基（1:10，w/v），然后在摇床（100 rpm，30°C）上孵育。三天后，将富集培养物转移至新鲜培养基中，连续传代培养三次。随后，取第三次传代培养物（10⁻⁴–10⁻⁶稀释度）50 μL涂布于BEP平板上，于30°C培养3天。无菌挑取生长快速、直径大、形态明显（如颜色、形状）的细菌菌落，并在BEP平板上反复划线纯化。使用BEP斜面在–4°C保藏细菌分离株。
【数据】油样量：10 g；富集比例：1:10（w/v）；摇床转速：100 rpm；温度：30°C；传代次数：3次；涂布量：50 μL；稀释度：10⁻⁴–10⁻⁶；培养时间：3天；保藏温度：–4°C
#### 2.2.2 细菌筛选与鉴定
将纯化的细菌分离株接种到含重油的琼脂平板上，于30°C培养一周。选择菌落生长优异的分离株作为潜在重油降解菌。随后，根据菌落周围透明圈直径进行油铺展试验，初步筛选生物表面活性剂产生菌（Raouf et al., 2024）。将每株重油降解菌接种到BEP培养基中，摇床培养（100 rpm，30°C）72小时获得种子液。将种子液（10⁸ CFU·mL⁻¹）按1:10（w/v）加入新鲜BEP培养基，在相同条件下培养一周以产生次生代谢产物。离心（12,000 × g，4°C，10 min）后弃去细胞沉淀，收集含生物表面活性剂的无细胞上清液进行油铺展试验。选择具有油铺展活性的菌株，并按照Raouf等（2024）的方法通过测量表面张力进行二次筛选。根据高油铺展活性、显著表面张力降低和良好的生物降解能力，获得一株候选菌株用于后续实验。通过目视检查和显微镜观察形态（Al-Dhabaan, 2019），结合16S rDNA测序（Wang et al., 2024）对候选菌株进行鉴定。将所得序列在GenBank数据库中进行BLAST比对获取物种信息。使用MEGA v11.0和ClustalX v2.0构建邻接树（Wang et al., 2024）。
【数据】培养温度：30°C；种子液制备时间：72 h；接种量：10⁸ CFU·mL⁻¹，1:10（w/v）；次生代谢产物培养时间：1周；离心：12,000 × g，4°C，10 min；筛选时间：1周
2.3 生物降解试验
在BEP培养基中制备候选菌株的72小时培养物，按10%（v/v）接种量加入生物降解培养基。对照组以相同方式制备但不接种，每个处理设三个重复。孵育30天（100 rpm，30°C）后，使用正己烷从培养液中萃取残余油。采用重量法测定重油生物降解效率。使用Al₂O₃柱色谱法进行饱和烃、芳香烃、胶质和沥青质（SARA）分析（Wei et al., 2018）。每个处理的三个重复样品等量混合，通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析残余油组成（Zhang et al., 2021）。每个处理进行三次独立试验，平均值来自三次重复测定。
【数据】接种量：10%（v/v）；孵育时间：30天；转速：100 rpm；温度：30°C；萃取溶剂：正己烷；分析方法：重量法、Al₂O₃柱色谱、GC-MS；重复数：3
2.4 原油黏度测定
为测试候选菌株降低重油黏度的能力，将72小时培养物（10%接种量，v/v）接种于生物降解培养基中。对照组不接种，每个处理设三个重复。孵育30天（30°C）后，将培养物置于4°C保持24小时，使重油与水相分离。收集油相并在6000 × g下离心5分钟以去除微量水分。使用旋转黏度计（NKY-25；上海方瑞，中国）在50°C下测定油黏度三次。油黏度降低百分比（Δμ%）计算公式为：
Δμ% = (μ_Ctrl − μ_s) / μ_Ctrl × 100
其中μ_Ctrl和μ_s分别代表对照组和处理组的油黏度。
【数据】接种量：10%（v/v）；孵育时间：30天；温度：30°C；分离条件：4°C，24 h；离心：6000 × g，5 min；黏度测定：50°C，3次；仪器：NKY-25旋转黏度计
2.5 生物表面活性剂生产试验
#### 2.5.1 细菌生长动力学与生物表面活性剂生产监测
在7天周期内通过测量生物量干重监测细菌生长动力学。通过测量表面张力、乳化指数（E24）和油铺展评估生物表面活性剂产量。将候选菌株（10%接种量，v/v）接种于BEP培养基中，于30°C、100 rpm摇床培养一周。每天通过离心（12,000 × g，4°C，10 min）收集培养样品。细胞生物量按照先前报道的方法定量（Akter et al., 2019）。培养上清液用于测定生物表面活性剂产量、表面张力和E24，以及生物表面活性剂的表征，采用Silva Faccioli等（2022）、Haddad等（2023）和Raouf等（2024）描述的方法。每个实验设三个重复。分析程序详情见补充方法。
【数据】监测周期：7天；接种量：10%（v/v）；温度：30°C；转速：100 rpm；离心：12,000 × g，4°C，10 min；重复数：3
#### 2.5.2 生物表面活性剂生产培养基优化
细菌的生物表面活性剂产量可通过优化关键营养因子（如碳源、氮源和氨基酸来源）来提高。采用单因素法优化碳源、氮源和氨基酸来源。首先，以可溶性淀粉、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖和红糖（10.0 g·L⁻¹）为碳源，以(NH₄)₂SO₄（3.0 g·L⁻¹）为氮源进行测试。接下来，以牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物、尿素、NH₄Cl和(NH₄)₂SO₄（3.0 g·L⁻¹）为氮源，以红糖（10.0 g·L⁻¹）为碳源进行评估。使用最优碳源和氮源，研究缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和天冬氨酸（5.0 g·L⁻¹）对生物表面活性剂产量的影响。将候选菌株的72小时培养物（10%接种量，v/v）接种到补充有特定碳源、氮源或氨基酸的生物降解培养基中。培养一周（100 rpm，30°C）后，测定干生物量、生物表面活性剂产量和表面张力，以确定最佳营养因子。每个处理组设三个重复。使用薄层色谱（TLC）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS/MS）进行生物表面活性剂表征（见补充方法）。
【数据】碳源浓度：10.0 g·L⁻¹；氮源浓度：3.0 g·L⁻¹；氨基酸浓度：5.0 g·L⁻¹；接种量：10%（v/v）；培养时间：1周；转速：100 rpm；温度：30°C；重复数：3
2.6 全基因组测序
通过全基因组测序分析候选菌株中石油烃降解基因的功能特征。将候选菌株的72小时培养物（10%接种量，v/v）接种于生物降解培养基中培养30天（100 rpm，30°C）。通过离心（12,000 × g，4°C，10 min）收集细胞沉淀。
【数据】接种量：10%（v/v）；培养时间：30天；转速：100 rpm；温度：30°C；离心：12,000 × g，4°C，10 min
研究结果
3.1 重油降解菌的表征
MEOR在重油油藏中的成功应用需要筛选具有高效石油烃降解和生物表面活性剂生产能力的细菌。本研究从重油样品中分离到四株细菌。其中两株（命名为DW-1和DW-2）在油平板上的生长优于其他两株（命名为DW-3和DW-4；图1c）。DW-1（79.3 mm）和DW-2（78.0 mm）的平均生长直径显著大于DW-3（70.7 mm）和DW-4（73.3 mm）（P < 0.05；图1a）。结果表明DW-1和DW-2利用重油的能力更优。随后，通过油铺展试验筛选四株菌株的生物表面活性剂生产能力。DW-2在重油上产生最大的透明圈直径（75.4 mm），其次是DW-4（47.0 mm）（P < 0.05；图1b）。与阳性对照（0.3 cm）相比，DW-1和DW-3的透明圈不明显（图1b和1d）。油铺展直径大于7 mm的菌株被认为是生物表面活性剂生产阳性菌（Paul et al., 2022）。DW-2的油铺展活性凸显了其在重油上生长时产生生物表面活性剂的潜力。该菌株将培养液的表面张力从71.2 mN·m⁻¹降至27.1 mN·m⁻¹。这一结果为DW-2是具有强表面活性的高效生物表面活性剂产生菌提供了额外证据。因此，选择DW-2作为候选重油降解和生物表面活性剂产生菌株进行后续试验。形态学观察和16S rRNA基因序列分析将DW-2鉴定为枯草芽孢杆菌（PV422577）（补充图S1）。
在原油、污染土壤和油田废水中已鉴定出大量产生物表面活性剂的石油降解细菌，尤其是芽孢杆菌属。例如，Althalb等（2021）从利比亚油田受污染土壤中分离到一株芽孢杆菌。该菌株在降低原油黏度和提高残余油采收率方面优于恶臭假单胞菌和Nocardia cyriacigeorgica。芽孢杆菌是一大类革兰氏阳性菌，可通过孢子形成在极端条件下生存和繁殖。重要的是，许多芽孢杆菌物种产生烃降解酶，使其适用于重油开采（Chen et al., 2025）。除了对烃类的分解代谢能力外，功能微生物在实际环境中的存活对MEOR的成功也至关重要（Chen et al., 2020）。枯草芽孢杆菌在脂肪族和芳香族化合物降解中起促进作用，同时形成内生孢子以适应恶劣环境（Wang et al., 2025）。该物种对原油的高效降解可能归因于脂肽等生物表面活性剂的生产（Xu et al., 2019）。
【数据】分离菌株数：4；DW-1生长直径：79.3 mm；DW-2生长直径：78.0 mm；DW-3：70.7 mm；DW-4：73.3 mm；DW-2透明圈直径：75.4 mm；DW-4：47.0 mm；阳性对照：0.3 cm；表面张力：71.2→27.1 mN·m⁻¹；菌株鉴定：Bacillus subtilis（PV422577）
3.2 枯草芽孢杆菌DW-2的重油生物降解
#### 3.2.1 重油生物降解效率
重量分析显示，枯草芽孢杆菌DW-2在30天内实现了34.2%的重油降解率（图2）。该降解效率令人满意（>30%），尽管低于蜡样芽孢杆菌（42.0%）和Chelatococcus daeguensi（48.9%）（Shahebrahimi et al., 2018; Ke et al., 2019）。Patowary等（2016）表明，芽孢杆菌优于在石油高度污染土壤中发现的其他烃降解细菌。特别是，在23株原油降解菌中，B. pumilus KS2和B. cereus R2表现出最大的生物降解能力。含有KS2和R2的芽孢杆菌联合体在孵育5周后实现了高达84.2%的总石油烃降解率。生物表面活性剂可以增加石油烃的疏水性和生物可利用性，有助于其降解（Pandey et al., 2022）。因此，应用产生物表面活性剂的石油降解菌（如枯草芽孢杆菌DW-2）有望促进重油组分的生物降解。其潜在机制包括增溶、增溶和/或乳化作用。
【数据】重油降解率：34.2%（30天）；对照菌株降解率：B. cereus 42.0%、C. daeguensi 48.9%；Bacillus联合体降解率：84.2%（5周）
#### 3.2.2 SARA组分的再分布
根据极性和溶解性，重油可分为四种SARA组分（Wei et al., 2018）。石油降解菌对SARA组分的生物降解有助于降低油黏度和改善油流动性。在30°C下与枯草芽孢杆菌DW-2共培养30天，导致重油中SARA组分的再分布（图2）。与对照组相比，残余油中芳香烃（–28.1%）和胶质（–17.1%）的相对质量含量显著降低（P < 0.05）。沥青质的相对质量含量略有下降（–11.7%），同时饱和烃含量增加（+16.0%）。这表明在生物降解过程中产生了轻烃，这与Wang等（2025）的发现一致。B. subtilis PHDB实现了原油中重质组分（芳香烃2.7%、胶质3.8%、沥青质1.0%）的降解，并产生了饱和烃（8.4%）。DW-2引起的SARA组分含量变化（图2）与Wang等（2025）观察到的趋势相似，反映了枯草芽孢杆菌对芳香烃和胶质的优先降解。虽然多种细菌可以降解原油中的简单有机化合物，但很少有物种能够利用难降解的油组分。鉴于其对SARA组分的高生物降解效率，枯草芽孢杆菌DW-2似乎是重油开采的有前景候选菌株。胶质和沥青质等极性组分通常占原油的45%以上，导致重油/超重油的高黏度。因此，降解、改质或去除胶质和沥青质为降低油黏度提供了策略（Xia et al., 2021）。Sun等（2017）从中国中部高温油藏采集的水样中筛选出地衣芽孢杆菌SH-2和枯草芽孢杆菌SH-3。用这两株细菌处理后，油黏度在54天后从750 mPa·s降至634 mPa·s。油黏度的降低归因于细菌产生的生物表面活性剂和生物气体，从而改善了重油的流动性。处理后蜡含量（–12.3%）和胶质-沥青质含量（–16.9%）也有所降低。SARA组分的定量变化表明它们在重油中发生了生物转化，这可以改善油的物理性质（Raheem et al., 2022）。使用能够耐受油藏条件并产生理想代谢产物的细菌菌株对MEOR至关重要。
【数据】芳香烃变化：–28.1%；胶质：–17.1%；沥青质：–11.7%；饱和烃：+16.0%；B. subtilis PHDB对照：芳香烃2.7%、胶质3.8%、沥青质1.0%降解，饱和烃+8.4%；SH-2/SH-3处理：黏度750→634 mPa·s（54天），蜡–12.3%，胶质-沥青质–16.9%
#### 3.2.3 重油组成的变化
为进一步揭示枯草芽孢杆菌DW-2的生物降解能力，使用GC-MS分析了正构烷烃和芳香烃的变化。残余油中化合物的相对减少量基于峰面积（强度）的降低进行定量。枯草芽孢杆菌DW-2对不同碳数和环数的正构烷烃和芳香烃实现了高效生物降解（表1）。特别是对难降解的长链烷烃（C30–34）和3–4环芳香烃的降解效率很高。枯草芽孢杆菌DW-2对正构烷烃的降解表现出选择性偏好，长链化合物（C30–34，65.8%）的降解率最高。中链化合物（C20–C29，38.9%）和短链化合物（C12–C19，27.1%）的降解率较低。相比之下，Costa和Millán（2024）报道地衣芽孢杆菌对短链烷烃（C8–C16）的偏好明显高于中链烷烃（C17–C28）。这种差异可能源于芽孢杆菌菌株的不同特征，包括基因组成和表达、分解代谢酶活性和生物表面活性剂生产（Xia et al., 2021）。枯草芽孢杆菌DW-2对多环芳香烃也表现出较高的降解效率：萘（23.4%）、菲（27.3%）和芘（70.1%）。这些结果表明，该菌株对重油中多种石油烃组分具有广谱降解能力。
【数据】C30–34降解率：65.8%；C20–C29：38.9%；C12–C19：27.1%；萘：23.4%；菲：27.3%；芘：70.1%
3.3 生物表面活性剂的生产与优化
枯草芽孢杆菌DW-2在BEP培养基中培养7天，生物表面活性剂产量从0.68 g·L⁻¹增加至1.51 g·L⁻¹（优化条件下），同时培养液的表面张力显著降低。生物表面活性剂的表征通过TLC、FTIR和UHPLC-MS/MS完成，确认其主要为脂肽类化合物。
【数据】生物表面活性剂产量：0.68→1.51 g·L⁻¹（7天）；表面张力：显著降低（原文未详述具体数值）
3.4 全基因组测序与功能注释
对枯草芽孢杆菌DW-2进行了全基因组测序。基因组圈图（图4）显示了基因组的整体结构，包括正链基因、负链基因、rRNA（蓝色）和tRNA（红色）分布、GC含量和GC skew。基因组注释结果显示（图5），大量基因被注释到不同数据库，包括COG功能分类、GO分类、KEGG通路和CAZymes分类。
基因组注释揭示了多个参与正构烷烃和芳香烃降解的核心基因，包括CYP153、adhP、atoB、fdhA、cmtA、catE、praC和xylA等，以及参与脂肽生物合成的核心基因（如srfAA、srfAB、srfAC、srfAD）。图6展示了枯草芽孢杆菌DW-2降解正构烷烃（a）和芳香烃（b）的核心基因气泡图。
基于基因组信息，预测了枯草芽孢杆菌DW-2降解正构烷烃和芳香烃的代谢通路（图7），以正十七烷（a）、2-甲基十一烷（b）、甲基环己烷（c）、菲（d）、甲苯（e）和萘（f）为代表底物。图中橙色、粉色、蓝色和绿色字体分别代表菌株中存在核心基因。
【数据】核心基因：CYP153、adhP、atoB、fdhA、cmtA、catE、praC、xylA（烃降解）；srfAA、srfAB、srfAC、srfAD（脂肽合成）
讨论与解读
本研究从重质原油中分离并鉴定了一株枯草芽孢杆菌DW-2。该菌株对长链烷烃和2–4环芳香烃表现出高效的利用能力，实现了重油的生物降解。同时，该菌株表现出较高的脂肽产量，具有良好的驱油活性、降低表面张力和高乳化活性。基因组中含有大量石油烃降解和次级代谢产物生物合成的核心基因，这些功能基因的存在支持了重油利用和乳化的实验结果。未来研究应通过岩心驱替试验评估枯草芽孢杆菌DW-2在重油开采中的适用性，并对功能基因表达进行定量分析，以深入了解重油生物降解的分子机制。
编译者解读
该研究将表型筛选与基因组分析相结合，从一株环境分离菌中同时挖掘了"降解"与"乳化"双重功能，策略上值得借鉴。值得注意的是，作者对长链烷烃（C30–34）和芘（70.1%降解率）的高效降解能力，在已报道的芽孢杆菌中较为突出。但需指出，实验室条件下的降解效率与油藏实际环境仍有差距——温度、压力、盐度等因素均可能影响菌株性能。后续岩心驱替试验和功能基因表达定量分析是验证其MEOR应用价值的关键一步。基因组中脂肽合成基因簇的完整存在，也为该菌株的工业化表面活性剂生产提供了遗传基础。
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.04.004