来源：Proteomic analysis of hemolymph reveals immune response changes in silkworm pupae following treatment with Bacillus subtilis（Journal of Agriculture and Food Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
昆虫依赖先天免疫系统抵御病原体入侵，家蚕是研究昆虫免疫的重要模式生物。本研究利用蛋白质组学技术，分析了枯草芽孢杆菌感染后家蚕蛹血淋巴中的蛋白质变化，共鉴定到669种蛋白质，其中214种在感染后发生显著变化。研究发现免疫识别蛋白在感染早期上调，而免疫效应蛋白在感染后期上调，并筛选出多个潜在的抗菌蛋白/多肽。该研究为家蚕抗菌肽的开发与应用提供了蛋白质组层面的系统数据。
研究背景
昆虫缺乏适应性免疫系统，完全依赖先天免疫防御。先天免疫的激活分为三步：病原体识别、信号级联放大和效应分子产生。血淋巴包绕昆虫所有器官和细胞，在先天免疫中发挥关键作用——许多血淋巴蛋白由脂肪体细胞合成并以时间依赖方式分泌，参与抵御外来病原体。家蚕是鳞翅目的经典模式生物，目前其免疫相关基因研究已覆盖基因组、转录组和蛋白质组等多个层面。基因组水平上已系统鉴定出家蚕203个免疫相关基因；转录组水平上，注射苏云金芽孢杆菌后鉴定到87个差异表达免疫相关基因；蛋白质组水平上，已有研究利用液相色谱-串联质谱检测五龄家蚕幼虫血淋巴。然而，蛹期对益生菌枯草芽孢杆菌感染的蛋白质组响应尚缺乏系统研究。
研究方法
2.1 实验材料
家蚕品系DaZao由西南大学生物科学研究中心提供。幼虫在人工饲料上饲养，控制条件为25°C、相对湿度70–80%，光周期12小时光照/12小时黑暗。枯草芽孢杆菌（JINGBIO，中国）在溶菌肉汤培养基中于37°C培养至对数期。培养物用20 mM磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）稀释，终浓度约为10⁶细胞/mL。取半数家蚕蛹（化蛹后第1天）浸泡在枯草芽孢杆菌培养液中10秒作为实验组，另一半浸泡在等体积PBS中作为对照组。尽管系统性感染通常通过注射诱导，但浸泡可能允许细菌通过气门或表皮微小擦伤进入，此现象在鳞翅目蛹中已有报道。感染后24、48或72小时提取血淋巴，置于含苯硫脲晶体的冰浴管中以抑制黑化。样品随后在4°C下以1000 g离心10分钟去除血细胞，血清保存于-80°C。
【数据】菌株：家蚕DaZao品系；温度：25°C（饲养）、37°C（细菌培养）；湿度：70–80%；光周期：12h光照/12h黑暗；细菌浓度：约10⁶细胞/mL；浸泡时间：10s；感染时间点：24h、48h、72h；离心：1000 g，10 min，4°C
2.2 样品制备
取血清样品（10 μL），加入35 μL无RNase水于1.5 mL无RNase微量离心管中稀释。随后加入5 μL 1 M碳酸铵缓冲液（pH 11）（Carnoss Technology，中国）和还原/烷基化混合液（10 mM二硫苏糖醇和25 mM碘乙酰胺，Hengkang Biopharmaceutical和Aladdin Biochemical Technology，中国），使最终体积达到50 μL。混合物在37°C避光孵育60分钟，确保充分还原和烷基化。孵育后，样品冻干。干燥蛋白用100 μL胰蛋白酶溶液（50 mM碳酸氢铵中10 μg/mL，Jusheng Technology，中国）复溶，37°C酶解过夜。酶解后，样品使用10K分子量截留超滤单元（Millipore，德国）在12,000×g离心20分钟。收集含有目标肽段的滤液（<10 kDa）。截留物（>10 kDa）用50 μL 50 mM碳酸氢铵洗涤，并在相同条件下再次离心。第二次滤液与第一次合并。合并后的滤液冻干、脱盐，保存于-80°C直至LC-MS/MS分析。
【数据】血清体积：10 μL；碳酸铵缓冲液：1 M，pH 11，5 μL；DTT：10 mM；碘乙酰胺：25 mM；孵育：37°C，60 min，避光；胰蛋白酶：10 μg/mL（50 mM碳酸氢铵）；酶解：37°C，过夜；超滤：10K截留，12,000×g，20 min
2.3 LC-MS/MS分析
干燥肽段样品用0.1%甲酸复溶，使用Dionex UltiMate 3000纳米高效液相色谱系统联用Thermo Scientific Q Exactive质谱仪进行分析。肽段分离在C18反相分析柱（75 μm × 15 cm，1.9 μm，100 Å，Thermo Scientific）上进行，流速600 nL/min。流动相由溶剂A（0.1%甲酸水溶液）和溶剂B（0.1%甲酸乙腈溶液）组成。质谱分析采用数据依赖采集模式。全扫描MS在70,000分辨率（m/z 200）下采集，扫描范围m/z 300–1400。选择强度最高的前20个前体离子进行高能碰撞解离碎裂，归一化碰撞能量为27。MS/MS谱图在17,500分辨率（m/z 200）下采集，隔离窗口为3.0 m/z。启用15秒动态排除以避免同一前体离子重复分析。质谱蛋白质组学数据已通过iProX合作存储库提交至ProteomeXchange联盟（https://proteomecentral.proteomexchange.org），数据集标识符为PXD070808。
【数据】流速：600 nL/min；MS分辨率：70,000（m/z 200）；扫描范围：m/z 300–1400；NCE：27；MS/MS分辨率：17,500（m/z 200）；隔离窗口：3.0 m/z；动态排除：15s；数据集编号：PXD070808
2.4 蛋白质鉴定
蛋白质序列从家蚕基因组数据库SilkDB（http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/）和UniProt数据库（http://www.uniprot.org/）获取。从两个数据库共下载32,835条家蚕蛋白质序列并合并，建立用于MaxQuant搜索的本地蛋白质数据库。SilkDB主要用于补充序列覆盖度，UniProt提供标准化功能注释。因此，正文和图中使用UniProt ID表示蛋白质，以保证一致性和可访问性。原始质谱数据使用MaxQuant软件（版本1.3.0.5）分析。搜索参数包括甲硫氨酸氧化和N端乙酰化的可变修饰，以及半胱氨酸残基的氨基甲酰甲基化固定修饰。最小肽段长度设为6个氨基酸，允许最多2个漏切位点。肽段和蛋白质鉴定均过滤以维持1%假发现率。仅保留至少由1条独特肽段鉴定的蛋白质，同时排除常见反向命中和污染物。蛋白质丰度使用MaxQuant中实现的基于强度的绝对定量算法计算，基于给定蛋白质所有肽段的峰强度总和。
【数据】蛋白质序列总数：32,835条；最小肽段长度：6个氨基酸；最大漏切位点：2；FDR：1%；独特肽段数：≥1
2.5 差异蛋白筛选
为评估细菌感染对家蚕血淋巴蛋白质表达的影响，使用感染蛹（IP，n=3）和未感染蛹（UP，n=3）的iBAQ数据。蛋白质丰度值经标准化以最小化样品间系统偏差。基于倍数变化和统计显著性进行差异表达分析。FC（IP/UP）>1.2的蛋白质定义为上调，FC（UP/IP）<0.8的蛋白质定义为下调。此外，仅保留p<0.05的蛋白质进行后续分析。1.2的倍数变化阈值基于iBAQ数据分布选择，以捕获适度变化但可能具有生物学意义的蛋白质，而严格的p<0.05确保统计可靠性。
【数据】上调阈值：FC>1.2；下调阈值：FC<0.8；显著性：p<0.05；生物学重复：n=3
2.6 蛋白质互作分析
鉴定到的差异表达蛋白质提交至STRING数据库（版本12.0）构建PPI网络。STRING参数设为最低互作评分0.30。第一壳层和第二壳层额外互作因子均禁用（最大互作因子数=无），仅保留查询蛋白。隐藏无连接节点，仅显示至少有一个互作的蛋白质。所得网络从STRING导出，使用STRING中实现的马尔可夫聚类算法（MCL）鉴定模块结构，膨胀参数为2.6。各簇的功能注释使用STRING内置富集分析结合人工文献整理进行，以赋予假定的生物学角色。结果随后导入Cytoscape软件（版本3.10.3）进行网络可视化和拓扑性质分析。最后，使用Adobe Illustrator对簇进行高亮。
【数据】STRING版本：12.0；最低互作评分：0.30；MCL膨胀参数：2.6；Cytoscape版本：3.10.3
2.7 GO和KEGG富集分析
鉴定到的差异表达蛋白质提交至STRING数据库（版本12.0）进行功能富集分析，包括基因本体论和京都基因与基因组百科全书通路注释。富集显著性使用p<0.05评估。为控制多重检验误差，采用Benjamini–Hochberg方法校正p值并估计假发现率。显著富集项在FDR<0.05标准下鉴定。结果用条形图可视化，条形长度代表各项的富集显著性（-log10(FDR)），条形颜色梯度对应FDR值，同时标注各项富集的基因数。
【数据】富集显著性：p<0.05；FDR阈值：<0.05；校正方法：Benjamini–Hochberg
2.8 典型和潜在免疫相关蛋白筛选
本部分聚焦于上调的免疫相关蛋白的筛选与鉴定。
【数据】原文未详述
研究结果
4.1 蛋白质组学分析概览
使用LC-MS/MS鉴定响应枯草芽孢杆菌感染的血淋巴蛋白质。三个生物学重复的结果共鉴定到669种蛋白质，其中246种蛋白质（36.8%）在所有组中共同存在（图1A）。各时间点感染组和未感染组中特异性表达的蛋白质也被鉴定。与未感染组相比，感染组在24h、48h和72h分别鉴定到63、36和43种独特蛋白质（图1B–D）。
【数据】总鉴定蛋白质：669种；共同蛋白质：246种（36.8%）；独特蛋白质：24h为63种、48h为36种、72h为43种
4.2 高表达血淋巴蛋白
通过比较各样品间iBAQ值的蛋白质丰度，鉴定到丰度最高的前20种蛋白质，包括10种营养储存蛋白（卵黄原蛋白、载脂蛋白和30K蛋白）、3种蛋白酶抑制剂（丝氨酸蛋白酶抑制剂和胱抑素家族）和1种免疫效应蛋白（溶菌酶）。其他高丰度蛋白包括驱动蛋白运动结构域蛋白、27K糖蛋白、GH18结构域蛋白、推定角质层蛋白、眼色素结合蛋白和若干功能未知蛋白。其中许多蛋白质在枯草芽孢杆菌感染后一个或多个时间点上调（表1），提示对外来病原体的潜在防御反应。
【数据】高丰度蛋白：20种；营养储存蛋白：10种；蛋白酶抑制剂：3种；免疫效应蛋白：1种（溶菌酶）
4.3 差异蛋白筛选
p<0.05且FC（IP/UP）>1.2的蛋白质定义为上调，p<0.05且FC（IP/UP）<0.8的蛋白质定义为下调，其余蛋白质视为无变化。基于这些标准，在三个时间点共鉴定到109种上调和105种下调蛋白质。具体而言，感染后24h有63种蛋白质上调和31种下调（图2A）；48h有36种蛋白质上调和62种下调（图2B）；72h有12种蛋白质上调和17种下调（图2C）。
【数据】总上调蛋白：109种；总下调蛋白：105种；24h：上调63种、下调31种；48h：上调36种、下调62种；72h：上调12种、下调17种
4.4 差异蛋白GO和KEGG分析
GO富集分析用于预测差异表达蛋白的功能。在生物学过程类别中，差异蛋白显著富集于免疫和应激反应相关条目，包括"对其他生物的响应"、"对其他生物的防御反应"、"对外部刺激的响应"、"先天免疫应答"和"分子功能的负调控"（图3A）。这些发现表明差异蛋白广泛参与宿主防御和免疫调节过程。在分子功能方面，最显著富集的条目是"丝氨酸型内肽酶抑制剂活性"（图3B），提示这些基因可能在蛋白酶抑制和免疫应答调节中发挥关键作用。细胞组分分析显示，差异蛋白主要定位于"细胞外区域"、"细胞外空间"、"含胶原蛋白的细胞外基质"、"基底膜"和"细胞外基质"（图3C）。这种强富集表明鉴定到的基因可能参与细胞外结构和细胞微环境的重塑。KEGG通路分析显示多个代谢和结构通路的显著富集，包括"叶酸一碳库"、"氨基酸生物合成"、"ECM-受体互作"、"碳代谢"和"代谢通路"（图3D）。这些结果暗示显著的代谢重编程和细胞-细胞外基质互作的改变是家蚕蛹响应细菌感染的关键特征。
【数据】GO富集条目：生物学过程（免疫/应激相关）、分子功能（丝氨酸型内肽酶抑制剂活性）、细胞组分（细胞外区域/基质）；KEGG通路：叶酸一碳库、氨基酸生物合成、ECM-受体互作、碳代谢、代谢通路
4.5 差异蛋白互作网络
基于STRING的PPI网络由差异表达蛋白构建，经MCL（膨胀参数=2.6）划分为27个离散簇（图4）。许多簇对应经典免疫功能，包括明确的抗菌肽模块、麻痹肽（BmPp）和30K蛋白（Ppbp2）、丝氨酸蛋白酶抑制剂以及一个含模式识别受体和上游免疫传感器（PGRP-S1、BGRP2）的簇，与Toll/Imd信号传导一致（图4D）。一个包含CLIP结构域丝氨酸蛋白酶（CLIP-SP，BAEE）组分的独特簇显示与serpin-3的网络连接，与定量蛋白质组学观察一致——某些CLIP-SP和serpin-3在同一时间点共同上调，而其他CLIP-SP在serpin-3下降时增加（图4D）。与MAPK激活相关的信号转导/调控组分（如Rab GDP解离抑制剂（H9IV39_BOMMO）和14-3-3家族成员（Ywhae，14-3-3zeta））也发现与下游效应子连接（图4A）。除经典免疫因子外，若干高连接簇对应翻译机制，如延伸因子（如ef-1g、EF1a）和核糖体蛋白（如RpL22、RpL13）、核苷酸生物合成（如H9JX54_BOMMO）和一碳代谢（如H9J609_BOMMO）、糖酵解和磷酸戊糖途径（如H9JDT4_BOMMO）以及ROS代谢酶（如SOD）（图4A）。这些代谢和翻译模块与免疫簇的共现和互连支持感染相关代谢和基因表达重编程的模型。值得注意的是，细胞骨架蛋白（bmtub2、微管蛋白α链和其他细胞骨架相关蛋白如A4和PFN）作为连接信号簇和代谢簇的关键桥接节点出现，提示细胞骨架重塑可能在响应过程中协调运输、分泌或细胞迁移。基底膜组织和ECM-受体互作模块的出现（图4B）可能反映感染诱导的组织屏障改变或ECM重塑，例如修复受损组织或调节细胞迁移/免疫细胞募集，也可能与样品组织来源中的基底膜组分有关。此外，网络中的化学感受蛋白簇（CSP4和CSP11）（图4D）可能反映感染诱导的宿主感觉行为或与环境通讯的变化。
【数据】MCL簇数：27个；STRING最低互作评分：0.30；MCL膨胀参数：2.6
4.6 典型免疫相关差异蛋白筛选
从家蚕血淋巴蛋白质组中鉴定到47种典型免疫相关蛋白，包括14种免疫识别蛋白、19种免疫信号蛋白和14种免疫效应蛋白。感染枯草芽孢杆菌后，观察到5种免疫识别蛋白（UniProt ID：H9JEU1、H9JQ03、H9JII6、H9J9Z4、H9IYF5）、9种免疫信号蛋白（UniProt ID：Q95YI2、H9JF68、H9JJC0、Q2PQU4、H9B445、H9JL11、Q2VG86、B5BSX4、H9JLA5）和9种免疫效应蛋白（UniProt ID：Q2WGL0、H9IZR2、Q27239、O76146、Q2WGL1、H9JD61、H9JB80、H9JTA1、H9JTA12）显著上调（图5）。尽管大多数这些蛋白在各时间点表现出一致的上调，但有些表现出时间特异性波动。例如，BmLP38（图5B）在24h显著上调但在72h下调，而Cecropin-A（图5C）在24h下调但在72h上调，提示免疫调节的复杂时间调控。
【数据】典型免疫相关蛋白总数：47种（识别14种、信号19种、效应14种）；显著上调：识别5种、信号9种、效应9种；时间特异性：BmLP38（24h上调/72h下调），Cecropin-A（24h下调/72h上调）
4.7 潜在免疫相关差异蛋白筛选
基于已有报道和UniProt注释，鉴定到13种潜在免疫相关差异蛋白，包括3种角质层蛋白（UniProt ID：O96052、C0H6D7、A0A8R1WNY8）、5种30K蛋白（UniProt ID：H9B445、Q2PQU4、H9B448、Q5YI2、H9B459）、1种化学感受蛋白（UniProt ID：Q3LB95）和4种其他蛋白（UniProt ID：Q86QT1、B9VTR5、Q2HZG4、A4PHN7）显著上调（图6）。
【数据】潜在免疫相关蛋白总数：13种（角质层蛋白3种、30K蛋白5种、化学感受蛋白1种、其他4种）
4.8 免疫相关蛋白互作通路预测
枯草芽孢杆菌感染后，家蚕免疫系统通过模式识别受体检测病原体相关分子模式，启动下游免疫应答。
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究系统探究了家蚕蛹对细菌的免疫应答。通过比较蛋白质组学分析，不仅鉴定到大量参与典型免疫通路的蛋白质上调，还发现了可能参与抗菌防御的潜在新型蛋白。浸泡法可能允许枯草芽孢杆菌通过气门或天然表皮开口进入蛹血淋巴，后续系统性免疫蛋白的上调证实了这一点。面对细菌攻击，家蚕蛹表现出遵循"识别—信号—效应"序列的时间协调免疫反应。与既往报道一致，感染后24h内，PGRP-S1、PGRP-S5和βGPR-3等识别蛋白上调，通过识别PAMP启动免疫应答；48h时丝氨酸蛋白酶和serpin等信号组分达到峰值，放大免疫级联；72h时Attacin和Cecropin等抗菌肽以及溶菌酶等效应分子大量积累，表明持续的体液免疫应答。在整个抗菌应答过程中，酚氧化酶驱动黑化过程，介导对入侵病原体和寄生虫的包裹和结节化。此外，在黑素产生过程中会产生醌类和活性氧等高毒性中间产物。
编译者解读
该研究选择浸泡而非注射方式建立感染模型，更接近自然感染途径，但细菌进入效率可能不均一，这或许是部分蛋白表达时间波动的原因之一。研究将经典免疫蛋白与潜在新型免疫蛋白（如30K蛋白、角质层蛋白）并置分析，拓展了抗菌肽筛选的候选池。蛋白质组数据已公开（PXD070808），为后续功能验证提供了资源。局限在于仅用单一菌株、单一时间点采样，且未对候选蛋白进行RNAi或重组表达验证——从组学线索到功能确证之间仍有相当距离。未来若能将时间分辨的蛋白质组数据与抗菌活性实验结合，将更直接推动家蚕抗菌肽的应用开发。
参考来源
Li Z. Proteomic analysis of hemolymph reveals immune response changes in silkworm pupae following treatment with Bacillus subtilis. Journal of Agriculture and Food Research, 2026. DOI: 10.1016/j.jafr.2026.102947
DOI: 10.1016/j.jafr.2026.102947