来源：Engineered Bacillus subtilis to deliver dsRNA via extracellular vesicles against the H9N2 avian influenza virus（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
RNA干扰（RNAi）是一种序列特异性的抗病毒技术，优于传统广谱药物，但在动物疫病防控中面临两大瓶颈：靶标设计依赖计算机预测的siRNA而非病毒来源siRNA（vsiRNA），以及缺乏经济有效的siRNA递送系统。本研究将益生菌枯草芽孢杆菌168改造为重组菌株B. subtilis AAD，使其组成型表达富集vsiRNA的dsRNA，靶向H9N2禽流感病毒。口服给药后，该菌株通过分泌胞外囊泡（EVs）递送dsRNA，激活Dicer加工与RNAi/干扰素信号通路，使病毒载量降低约70%。该策略将益生菌特性与EV介导的dsRNA递送相结合，为动物疫病防控提供了一种可持续、无残留的抗病毒方案。
研究背景
RNAi通过序列特异性沉默病毒基因，在抗病毒应用中展现出优于传统药物和疫苗的特异性。尽管RNAi在人类医学和植物保护领域已取得进展，其在动物疫病控制中的应用仍受两大核心挑战制约。其一，多数RNAi策略依赖计算机预测的siRNA序列，而非病毒来源的siRNA（vsiRNA），人工设计的dsRNA与天然RNAi机制之间的差异常导致Dicer切割效率不足，并引发对宿主或共生微生物基因的脱靶沉默。其二，动物siRNA递送缺乏经济有效的系统——合成纳米颗粒或体外转录dsRNA等方法生产成本高，且在生理环境中稳定性差。这些问题在H9N2禽流感病毒（AIV）中尤为突出。H9N2 AIV是分布最广泛的低致病性禽流感毒株，不仅感染家禽、损害其生长性能，还在长期传播中持续突变，为人畜共患的高致病性AIV提供基因片段。因此，亟需开发一种安全、可口服、能在复杂胃肠道环境中持续生产dsRNA且无需基因修饰的递送平台。
研究方法
dsRNA靶标制备
dsRNA通过T7体外转录合成。简要流程如下：使用5′端携带T7启动子序列的引物，通过PCR扩增靶DNA片段。dsRNA合成使用T7 RNAi Transcription Kit（Vazyme Biotech，中国），按制造商说明书操作。dsRNA浓度和纯度使用NanoDrop分光光度计测定。
【数据】试剂盒：T7 RNAi Transcription Kit（Vazyme Biotech）；仪器：NanoDrop分光光度计；引物：5′端含T7启动子序列
RNA提取、逆转录、PCR与RT-qPCR
使用TRIzol™试剂（Invitrogen，美国）按制造商说明书从细胞或组织中提取总RNA。约500 ng/μL RNA使用HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix for qPCR（Vazyme Biotech Co., Ltd，中国）逆转录为cDNA。RT-qPCR使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Vazyme Biotech Co., Ltd，中国）。引物序列见在线补充信息表S2。相对基因表达分析采用2^-ΔΔCT法，以β-Actin或GAPDH作为内参基因。
【数据】RNA量：约500 ng/μL；逆转录试剂：HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix；qPCR试剂：ChamQ SYBR qPCR Master Mix；内参基因：β-Actin或GAPDH；分析方法：2^-ΔΔCT法
Western Blot分析
蛋白样品与5× SDS上样缓冲液混合，沸水浴变性15分钟。随后通过SDS-PAGE分离蛋白，并使用Bio-Rad转印装置转移至PVDF膜。
【数据】变性条件：沸水浴15分钟；上样缓冲液：5× SDS；转印装置：Bio-Rad
病毒感染
细胞实验中，AIV感染HD11细胞的MOI设定为1。在37°C、5% CO₂条件下孵育2小时，然后用RPMI 1640洗涤。空白组为未感染病毒的无病毒细胞。MOCK组仅向细胞添加RPMI-1640培养基，随后感染相应病毒，作为实验中的阳性对照。RNA和蛋白样品按指定时间点（12和24小时）收集。
【数据】MOI：1；温度：37°C；CO₂：5%；孵育时间：2小时；洗涤液：RPMI 1640；样品收集时间：12h和24h
病毒滴度测定
禽流感病毒（AIV）滴度在MDCK细胞中测定，传染性法氏囊病病毒（IBDV）滴度在DF-1细胞中测定。细胞培养实验使用细胞培养上清进行TCID50测定。动物实验中，0.1 g肺组织（AIV）或法氏囊（IBDV）在1 mL PBS中匀浆，所得组织匀浆进行TCID50测定。测试样品进行十倍系列稀释。病毒感染按照标准病毒接种方案进行。每个样品设置八个重复孔。孵育48小时后观察细胞病变效应。病毒滴度使用Reed–Muench法计算。
【数据】AIV测定细胞：MDCK；IBDV测定细胞：DF-1；组织量：0.1 g；PBS量：1 mL；稀释方式：十倍系列稀释；重复孔数：8；孵育时间：48h；计算方法：Reed–Muench法
RNA浓度测定
外源合成的dsRNA应进行系列稀释，随后进行逆转录以生成cDNA。下一步使用不同浓度cDNA的引物进行qPCR，以建立标准曲线。
【数据】原文未详述具体稀释梯度
细菌连续培养
使用含壮观霉素抗性的LB培养基培养重组菌株AAD。每天以1‰接种量接种新鲜培养基。每日收集培养物，提取总RNA，进行PCR和RT-qPCR检测。该过程连续重复14天。
【数据】培养基：含壮观霉素的LB；接种量：1‰；培养时间：连续14天
动物组织中dsRNA含量测定
12只10日龄SPF雏鸡随机分为两组（每组n = 6）。MOCK组连续两天口服PBS。AAD组每只雏鸡连续两天口服200 μL重组B. subtilis AAD（1 × 10⁸ CFU/mL）。最后一次给药24小时后，对雏鸡实施安乐死。收集结肠、血液、心脏、肝脏、肺和肾脏样品。称取约0.1 g各组织，提取总RNA。通过RT-qPCR定量不同组织中靶dsRNA的水平。
【数据】动物数：12只；日龄：10日龄；分组：2组（n=6）；给药体积：200 μL/只；浓度：1 × 10⁸ CFU/mL；给药天数：2天；取样时间：末次给药后24h；组织取样量：约0.1 g
重组B. subtilis AAD体内抗病毒实验
36只10日龄SPF雏鸡分为六组，每组六只。MOCK组连续两天给予PBS，不进行病毒攻毒。PBS组每只雏鸡连续两天接受200 μL PBS。dsRNA组每只雏鸡鼻内给予20 μg聚乙烯亚胺（PEI）包被的、靶向H9N2的体外合成dsRNA，氮磷比为6.5。Bs168组每只雏鸡连续两天喂饲200 μL浓度为1 × 10⁸ CFU/mL的枯草芽孢杆菌；AAD组每只雏鸡连续两天喂饲200 μL浓度为1 × 10⁸ CFU/mL的重组枯草芽孢杆菌AAD；ZsGreen组每只雏鸡连续两天喂饲200 μL浓度为1 × 10⁸ CFU/mL的重组枯草芽孢杆菌ZsGreen。PBS、RNA、Bs168、AAD和ZsGreen组在喂饲或鼻内给药当天，鼻内接种300 μL滴度为EID₅₀ = 10⁷/0.1 mL的H9N2禽流感病毒。每天测量动物体重以计算日体重变化。第7天对动物实施麻醉和安乐死并取样。
另取18只10日龄SPF雏鸡分为三组，每组六只。MOCK组连续两天给予PBS，不进行病毒攻毒。PBS组每只雏鸡连续两天接受200 μL PBS；AAD组每只雏鸡连续两天喂饲200 μL浓度为1 × 10⁸ CFU/mL的重组枯草芽孢杆菌AAD。PBS和AAD组在喂饲或鼻内给药当天，鼻内接种300 μL滴度为TCID₅₀ = 10⁴·⁵/0.1 mL的IBDV。第7天对动物实施麻醉和安乐死并取样。
【数据】雏鸡数：36只+18只；日龄：10日龄；分组：6组+3组；每组：6只；给药体积：200 μL/只；菌浓度：1 × 10⁸ CFU/mL；PEI-dsRNA：20 μg/只，N/P=6.5；H9N2攻毒：300 μL，EID₅₀=10⁷/0.1 mL；IBDV攻毒：300 μL，TCID₅₀=10⁴·⁵/0.1 mL；取样时间：第7天
Bacillus subtilis AAD体内示踪
在含1.5%木糖的LB培养基中培养Bacillus subtilis AAD 14小时后，收集并计数细菌细胞。将12只SPF雏鸡分为四组，禁食24小时以消除非特异性荧光。Blank组作为纯对照。其余三组通过口服灌胃按200 μL/只喂饲浓度为1 × 10⁸ CFU/mL的Bacillus subtilis AAD，在不同时间点进行。根据实验计划对动物实施麻醉和安乐死。随后取出消化道，使用小动物活体成像系统进行荧光成像（Ex/Em = 560/620 nm）。
【数据】培养时间：14h；木糖浓度：1.5%；动物数：12只；分组：4组；禁食时间：24h；给药体积：200 μL/只；浓度：1 × 10⁸ CFU/mL；成像波长：Ex/Em=560/620 nm
EVs的制备
通过4°C下15,000 g离心20分钟收集无细菌上清，然后通过0.22 μm滤膜过滤去除杂质。上清随后在4°C下150,000 g超速离心1小时。所得沉淀重悬于PBS中。纯化的EVs短期使用储存在4°C，长期储存在−80°C。
【数据】离心1：15,000 g，20分钟，4°C；过滤：0.22 μm滤膜；离心2：150,000 g，1小时，4°C；重悬液：PBS；短期储存：4°C；长期储存：−80°C
EVs表征
使用ZetaView_Particle Metrix（Particle Metrix, PMX-120，德国）通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测量EVs的数量和大小。仪器使用前用100 nm聚苯乙烯微球（Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA）校准。NTA软件用于测量纳米颗粒浓度（颗粒/mL）。NTA软件中包含的批处理流程用于每个样品的测量。
【数据】仪器：ZetaView_Particle Metrix（PMX-120）；校准：100 nm聚苯乙烯微球；测量参数：颗粒浓度（颗粒/mL）
扫描电子显微镜（SEM）
离心收集细菌细胞，重悬于电镜固定液中，室温固定2小时。用0.1M磷酸盐缓冲液PB（pH 7.4）洗涤固定样品三次，每次15分钟。配制1%四氧化锇溶液（溶于0.1M磷酸盐缓冲液PB，pH 7.4），室温避光固定1-2小时。用0.1M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤三次，每次15分钟。将样品依次置于30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%和100%乙醇中各15分钟进行梯度脱水。
【数据】固定液：电镜固定液；固定时间：室温2小时；洗涤：0.1M PB（pH 7.4），3次×15分钟；锇酸固定：1%四氧化锇，室温避光1-2小时；乙醇梯度：30%-100%系列，各15分钟
研究结果
改造B. subtilis 168以产生靶向H9N2禽流感病毒的dsRNA
为构建能表达靶向H9N2 AIV的dsRNA的枯草芽孢杆菌菌株，我们通过质粒转化对细菌进行工程化改造（图1A）。首先从先前验证的vsiRNA数据库中选择了一段300碱基对的dsRNA片段，该片段富含病毒来源的siRNA。作为阴性对照，我们同时设计并通过体外转录合成了靶向无关ZsGreen基因的非特异性dsRNA。为确认抗病毒活性，将两段dsRNA片段转染至HD11鸡巨噬细胞，随后进行H9N2 AIV感染。Western blot、RT-qPCR和TCID₅₀病毒检测分析表明，与ZsGreen dsRNA对照相比，病毒来源的300 bp dsRNA显著抑制了H9N2复制并降低了病毒载量（图1B、C及在线补充信息图S1a、b）。
接下来，我们基于pDG1663骨架构建了两个表达载体pDGds-AAD和pDGds-ZsGreen（图S1j–l）。这些载体利用双向Pylb启动子驱动细胞内dsRNA形成（图1D）。为减少内源性dsRNA降解，我们首先通过质粒pJJ2删除编码RNase III的基因，生成了B. subtilis Δrnc突变体（图S1c–e）；该敲除使dsRNA产量大幅提高，达到与商业菌株HT115-L4440相当的水平（图S1f–h）。随后将pDGds-AAD质粒导入Δrnc背景，获得重组菌株B. subtilis Δrnc-AAD（后文简称B. subtilis AAD）。阳性转化子在激发光下表现出强烈的红色荧光（图1E）。PCR扩增和Sanger测序确认靶标插入片段精确整合，无突变或缺失（图S1i）。采用类似流程生成对照菌株B. subtilis ZsGreen（图S1k–m）。扫描电子显微镜显示，重组AAD、ZsGreen与野生型B. subtilis 168菌株之间无明显形态差异（图1F）。生长曲线进一步表明，两个重组菌株的增殖动力学与亲本菌株一致，约在10小时达到稳定期（图1G）。靶dsRNA在对数期和稳定期早期积累至最高水平（图1H）。重要的是，AAD菌株在连续培养14天后仍保持稳健的dsRNA产量和遗传稳定性（图S1n、o）。
【数据】dsRNA片段长度：300 bp；对照基因：ZsGreen；启动子：双向Pylb；敲除基因：rnc（RNase III）；质粒骨架：pDG1663；敲除质粒：pJJ2；稳定期：约10h；连续培养：14天
重组B. subtilis AAD对H9N2 AIV的体内效力
我们随后在SPF雏鸡中评估了重组B. subtilis AAD菌株对H9N2 AIV攻毒的保护效力。实验设六个组：未处理（MOCK）、PBS（磷酸盐缓冲液，溶媒对照）、体外转录dsRNA（聚乙烯亚胺包被）、野生型B. subtilis 168（Bs168）、B. subtilis AAD（AAD）及无关对照菌株B. subtilis ZsGreen（ZsGreen）（图2C）。体内荧光成像证实，口服给予的B. subtilis AAD被有效递送至胃肠道并滞留（图2A）。肛拭子系列稀释涂板表明，重组菌株在给药后至少在肠道中持续存在7天（在线补充信息图S2a）。与此高效递送一致，RT-qPCR分析显示结肠、血液、心脏、肝脏和肺中靶dsRNA水平较高，肾脏中含量较低但可检测到，表明具有广泛的全身分布（图2B）。
为确认抗病毒效应具有序列特异性，我们用异源RNA病毒——传染性法氏囊病病毒（IBDV）攻毒喂饲B. subtilis AAD的雏鸡（图S2b）。在PBS处理、IBDV攻毒组中，雏鸡法氏囊和脾脏显著肿大，组织病理学检查显示滤泡间间隙变窄和广泛的红细胞浸润（图S2c）。喂饲B. subtilis AAD的雏鸡表现出完全相同的肉眼和显微病变（图S2c）。与此一致，法氏囊和脾脏中的病毒载量——通过RT-qPCR和TCID₅₀测定——在AAD喂饲组和PBS处理组之间相当（图S2d–f）。因此，喂饲重组AAD菌株并未抑制IBDV复制，证实对H9N2 AIV的保护活性严格依赖序列。
【数据】分组：6组；肠道滞留时间：≥7天；dsRNA分布组织：结肠、血液、心脏、肝脏、肺（高水平）、肾脏（低水平）
B. subtilis来源EVs的分离与表征
近期研究表明，细菌可将蛋白质和核酸包装进EVs用于细胞间递送。因此，我们探究工程化的B. subtilis AAD菌株是否也能利用EVs运输靶dsRNA并抑制病毒复制。为提高EV产量，用低浓度溶菌酶温和处理B. subtilis细胞（图3A）。扫描电子显微镜显示，该处理导致局部细胞壁损伤并形成小孔，而未处理的阴性对照中无此现象（图3B）。结果，来自溶菌酶处理培养物的超速离心沉淀含有明显更多的EVs（图3C）。纳米颗粒追踪分析定量显示，与未处理组相比，EV数量增加了144倍（图3D）。
透射电子显微镜证实，溶菌酶处理和质粒转化均未改变B. subtilis来源EVs的特征形态。囊泡呈典型的"茶碟"状，具有清晰的双层膜结构（图3E及在线补充信息图S3b）。与先前报道一致，纳米颗粒追踪分析（NTA）显示大多数EVs的直径在80至200 nm范围内（图3F及图S3a）。从纯化EVs中提取的总RNA含有靶dsRNA，通过逆转录和琼脂糖凝胶电泳对AAD EVs特异来源的cDNA进行了验证（图3G）。对照重组菌株ZsGreen分泌的EVs中也检测到特异性dsRNA序列（图S3c）。绝对定量PCR结合NTA进一步表明，每毫升细菌培养物（OD₆₀₀ = 1.0）约产生4.78 × 10¹¹个EVs，装载10.23 μg靶dsRNA。为评估稳定性，将AAD来源EVs和裸合成dsRNA在4°C储存7天或用RNase A孵育。EV包封显著提高了dsRNA稳定性，并赋予其抵抗RNase A降解的强保护能力（图3H、I）。4°C储存7天后，EV数量仅下降30.50%，但囊泡仍保持典型形态和膜完整性（图S3d–f）。综上所述，这些数据表明重组B. subtilis AAD菌株能将功能性抗病毒dsRNA高效包装进分泌的EVs中。
【数据】溶菌酶处理：低浓度（原文未详述具体浓度）；EV数量增加：144倍；EV直径范围：80-200 nm；EV产量：4.78 × 10¹¹ EVs/mL培养物（OD₆₀₀=1.0）；dsRNA装载量：10.23 μg/mL培养物；4°C储存7天EV数量下降：30.50%
B. subtilis来源EVs的细胞摄取
为表征重组B. subtilis AAD菌株来源EVs的细胞内摄取，我们结合了DiI标记、超速离心纯化和多模态成像。按图4A所示流程操作，DiI染色的AAD EVs在超速离心后呈清晰的红色颗粒（图4B）。将染色EVs与HD11细胞孵育。共聚焦显微镜显示明显的时间依赖性摄取：AAD EVs在孵育后15分钟仅显示稀疏的红色荧光，至1小时时出现强信号积累（图4C、D）。高倍成像进一步证实了EVs在1小时时的细胞内定位，DiI荧光与细胞结构共定位（图4E）。这些观察结果通过流式细胞术得到佐证。点图分析显示DiI阳性细胞频率显著增加，升至
【数据】摄取时间点：15分钟（稀疏）、1小时（强信号）；标记染料：DiI；检测方法：共聚焦显微镜、流式细胞术
B. subtilis AAD来源EVs对H9N2 AIV的抗病毒活性及免疫通路激活
【数据】检测蛋白：AIV-NP、Dicer、Ago2、β-Actin；细胞：HD11；处理组：对照、MOCK（H9N2感染）等
通过B. subtilis来源EVs递送dsRNA
【数据】分析方法：small RNA测序、Pearson相关性分析
重组B. subtilis AAD在雏鸡体内通过EVs递送功能性病毒来源siRNA（vsiRNAs）
【数据】分析方法：Pearson相关性分析、Venn图、基因表达热图
讨论与解读
本研究实现了从植物保护到畜禽RNA病毒防控的范式转变。植物系统中的HIGS和MIGS技术已成功应用于作物抗真菌和抗病毒，但植物与动物生物系统间的显著差异阻碍了这些成果向畜牧业转化。家畜需要安全、可口服、避免基因修饰且能在复杂胃肠道环境中持续生产dsRNA的平台。本研究通过建立基于益生菌的dsRNA表达系统填补了这一空白。B. subtilis具备理想特性：它是公认的安全微生物，广泛用于动物饲料，且能在家禽肠道内存活7天，促进dsRNA的体内持续合成与递送。体内实验表明，AAD处理鸡在给药后24小时内多个组织可检测到dsRNA，病毒载量降低超过90%。
编译者解读
该研究的核心突破在于将"益生菌活载体"与"天然EV递送"两个成熟概念创造性整合，解决了RNAi动物应用中"靶标设计低效"和"递送成本高"两大痛点。选用vsiRNA数据库指导dsRNA设计、敲除RNase III提高产量、低浓度溶菌酶刺激EV分泌——每一步都针对实际瓶颈，而非简单堆砌技术。144倍EV产量提升和10.23 μg/mL的dsRNA装载量显示了良好的工业化潜力。值得注意的是，口服菌株能在多个组织检出dsRNA，提示EVs可能穿越肠道屏障实现全身分布，这一现象的机制值得深入探究。未来若能在大型家禽养殖场景中验证成本效益和规模化生产可行性，该策略有望成为替代传统抗病毒药物的新一代防控手段。
参考来源
Liu J. Engineered Bacillus subtilis to deliver dsRNA via extracellular vesicles against the H9N2 avian influenza virus. Trends in Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.05.025
DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.05.025