来源：Engineering Bacillus subtilis for the biosynthesis of nicotinamide mononucleotide（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
β-烟酰胺单核苷酸（NMN）是NAD⁺的关键前体，在食品、医药及大健康产业中具有广阔应用前景。本研究以枯草芽孢杆菌164T7P为底盘菌株，通过多层级代谢工程策略系统优化NMN生物合成途径：整合表达ywlF-prs强化PRPP供给、重构葡萄糖酸代谢途径引流碳流至磷酸戊糖途径、采用富磷ZYM培养基、敲除内源prs并表达反馈抑制不敏感型PRS突变体（L135I）。最终工程菌株NMN产量达4607.33 mg/L，较原始菌株提升2299.65%。
研究背景
NMN由烟酰胺（NAM）与磷酸化核糖通过β-1′-糖苷键连接而成，仅β异构体具有生物活性。作为NAD⁺的关键生物合成前体，NMN通过调控NAD⁺水平参与DNA修复、染色质重塑、线粒体稳态及免疫应答等核心细胞过程。研究表明，脑、皮肤、肝脏、肌肉及卵母细胞等组织中的NAD⁺水平随衰老进程逐渐下降，补充NMN可有效缓解或逆转衰老相关病理表型。因此，建立高效、经济的NMN生物合成方法具有重要的转化价值。本研究采用多层级代谢工程策略，系统优化枯草芽孢杆菌中NMN生物合成途径。
研究方法
2.1 化学试剂、菌株与质粒
NMN标准品购自苏州华赛生物技术有限公司。D-木糖和葡萄糖酸钠由上海麦克林生化科技有限公司提供。烟酰胺和D-葡萄糖购自生工生物工程（上海）股份有限公司。高保真DNA聚合酶2 × Phanta® Master Mix、FastPure凝胶DNA提取试剂盒及FastPure质粒提取试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。枯草芽孢杆菌164T7P（ATCC 6051a衍生菌株[32]）及其基因工程菌株用于质粒构建，并作为NMN生物合成的起始菌株。本研究所用菌株与质粒详细信息汇总于表1。质粒pMK4作为所有重组构建体的骨架载体。质粒pMK4-T7-cre携带Cre/loxP重组酶系统，可在同源重组介导的基因敲除和敲入操作后消除整合至基因组中的红霉素抗性基因。如图1所示，所有过表达靶基因均插入至重组质粒的T7启动子及其对应终止子之间。本研究所用引物列于表S1，DNA测序服务由北京擎科生物科技有限公司提供。
【数据】NMN标准品来源：苏州华赛生物；D-木糖和葡萄糖酸钠来源：麦克林；烟酰胺和D-葡萄糖来源：生工生物；工具酶及试剂盒来源：诺唯赞；菌株：B. subtilis 164T7P（ATCC 6051a衍生）；质粒骨架：pMK4；抗性基因消除系统：Cre/loxP（pMK4-T7-cre）
2.2 培养条件与摇瓶发酵生产NMN
枯草芽孢杆菌的试管培养和初步摇瓶发酵在LB液体培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）中进行，温度为37°C，恒温振荡培养箱中200 rpm持续振荡。固体培养时，向LB液体培养基中添加2%（w/v）琼脂粉。后续发酵实验采用改良ZYM培养基[29]（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、25 mM Na₂HPO₄、25 mM KH₂PO₄、50 mM NH₄Cl、5 mM Na₂SO₄）进行NMN生物合成。根据质粒维持和基因修饰需要，向培养基中添加氯霉素（10 μg/mL）或红霉素（10 μg/mL）。摇瓶发酵期间，添加1%（w/v）D-木糖诱导T7 RNA聚合酶表达，从而促进工程菌株中NMN生物合成途径关键蛋白的过表达。此外，提供2%（w/v）葡萄糖或葡萄糖酸钠作为主要碳源，添加1%（w/v）烟酰胺（NAM）作为NMN合成前体。摇瓶发酵时，挑取各工程菌株单菌落接种至含3 mL LB培养基的试管中，37°C、200 rpm振荡过夜培养。随后将过夜种子培养物以1%（v/v）的体积比接种至含50 mL新鲜LB或改良ZYM培养基的500 mL摇瓶中，按需添加相应抗生素。37°C、200 rpm培养5.5–6 h后，向培养物中添加1%（w/v）诱导剂、2%（w/v）碳源（葡萄糖或葡萄糖酸钠）和1%（w/v）NAM前体，持续发酵120 h。每24 h收集1 mL发酵液样品，并在每个取样时间点补充诱导剂。
【数据】LB培养基组分：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl；ZYM培养基组分：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、25 mM Na₂HPO₄、25 mM KH₂PO₄、50 mM NH₄Cl、5 mM Na₂SO₄；温度：37°C；转速：200 rpm；琼脂：2%（w/v）；氯霉素/红霉素浓度：10 μg/mL；D-木糖诱导浓度：1%（w/v）；碳源浓度：2%（w/v）；NAM前体浓度：1%（w/v）；接种量：1%（v/v）；发酵体积：50 mL/500 mL摇瓶；诱导时机：5.5–6 h；发酵周期：120 h；取样间隔：24 h
2.3 质粒构建
本研究所有重组质粒均采用先前报道的简易克隆方法[33]构建。简要流程如下：携带T7启动子和终止子的线性化pMK4骨架与目标基因片段分别经PCR扩增，生成带有50 bp重叠末端序列的DNA片段。随后进行融合PCR，将载体与插入片段组装为整合DNA多联体。组装产物转化至感受态枯草芽孢杆菌细胞中，由宿主内源酶介导线性DNA片段内化并环化为完整重组质粒。感受态细胞经D-木糖诱导预处理，详细制备方案见前期研究[32]。阳性转化子在含氯霉素的LB琼脂平板上筛选。质粒构建通过菌落PCR验证，随后对PCR扩增产物进行DNA测序确认。
【数据】重叠序列长度：50 bp；感受态细胞诱导剂：D-木糖；筛选标记：氯霉素（10 μg/mL）；验证方法：菌落PCR + DNA测序
2.4 菌株基因工程改造
枯草芽孢杆菌的基因组修饰通过携带选择性标记盒的线性DNA片段进行同源重组实现。构建yfkN基因座ywlF-prs过表达突变株时，组装了四个不同的DNA模块，包括yfkN上游同源臂（U-yfkN）、两侧翼lox位点的红霉素抗性盒（ermC）、T7启动子-终止子驱动的ywlF-prs表达片段及yfkN下游同源臂（D-yfkN）。具体而言，U-yfkN和D-yfkN片段从164T7P菌株基因组扩增获得，ermC盒从pMD19T-aea质粒扩增获得，ywlF-prs表达片段从pMK4-T7-ywlF-prs质粒扩增获得。上述四个片段通过两轮融合PCR组装为线性转化模板。第一轮融合PCR中，每个纯化DNA片段取100 ng，与10 μL 2 × Phanta® Master Mix混合，用ddH₂O调整总反应体积至20 μL。第二轮扩增时，取1 μL第一轮PCR产物作为模板，加入2.5 μL正向引物F-UHR-yfkN、2.5 μL反向引物R-DHR-yfkN及25 μL 2 × Phanta® Master Mix，ddH₂O补足至50 μL。将第二轮PCR产物与0.5 mL D-木糖诱导的感受态枯草芽孢杆菌细胞在37°C孵育2 h。将所得混合物涂布于含红霉素的LB琼脂平板，37°C过夜培养。工程菌株的正确基因组修饰通过菌落PCR初步验证，并进一步通过扩增子DNA测序确认。经验证的突变株随后转化pMK4-T7-cre质粒以切除染色体上的红霉素抗性盒。
【数据】融合PCR模板量：100 ng/片段；第一轮体系：10 μL 2 × Phanta® Master Mix，总体积20 μL；第二轮体系：1 μL第一轮产物 + 2.5 μL正/反向引物 + 25 μL 2 × Phanta® Master Mix，总体积50 μL；转化条件：0.5 mL感受态细胞，37°C，2 h；筛选标记：红霉素；抗性盒切除：pMK4-T7-cre
2.5 分析方法
细菌生长通过分光光度计测定600 nm处光密度（OD600）监测。发酵液中NMN和NAM的滴度采用高效液相色谱（HPLC）定量测定，使用伍丰LC-P100系统，检测波长254 nm。无细胞样品制备时，发酵液以12,000 rpm离心10 min，所得上清液根据样品浓度用超纯水稀释10倍或20倍。稀释上清液经0.22 μm亲水性聚四氟乙烯（PTFE）滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司）过滤后检测。处理后的样品注入Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 × 250 mm），柱温恒定30°C。流动相为95%（v/v）20 mM乙酸铵水溶液和5%（v/v）乙腈，流速恒定1.0 mL/min。进样量20 μL，每样品运行时间15 min。
【数据】检测波长：254 nm；离心条件：12,000 rpm，10 min；稀释倍数：10或20倍；滤膜：0.22 μm PTFE；色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 × 250 mm）；柱温：30°C；流动相：95% 20 mM乙酸铵 + 5%乙腈；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；运行时间：15 min
2.6 统计分析
本研究所有实验均独立进行三次生物学重复。采用单因素方差分析（ANOVA）评估实验组间显著差异。组间统计学显著性以相应图中星号标示。
【数据】重复次数：3次生物学重复；统计方法：单因素方差分析（ANOVA）
研究结果
3.1 协同过表达ywlF和prs增强PRPP通量
在微生物NMN发酵中，无论以烟酰胺（NAM）还是烟酸（NA）为底物，磷酸核糖焦磷酸（PRPP）都是唯一的磷酸核糖供体。因此，研究假设提高胞内PRPP可利用性可促进NMN生物合成。然而，直接外源添加PRPP因其极高的成本在大规模生产中不具备经济可行性。为解决这一问题并实现高效NMN合成，研究通过对底盘菌株164T7P进行代谢工程改造，策略性增强胞内PRPP积累。前期研究已证实，敲除编码2′,3′-环核苷酸2′-磷酸二酯酶的yfkN基因可有效提高NMN产量[31]。基于此结论，首先通过同源重组敲除yfkN基因，构建工程菌株NMN001。随后实施两种工程策略强化PRPP生物合成途径：在菌株NMN002中通过pMK4质粒过表达关键功能基因ywlF（编码核糖-5-磷酸异构酶）和prs（编码PRPP合成酶），或在菌株NMN003中将这些基因染色体整合至yfkN基因座，旨在增强胞内PRPP供应并进一步提高NMN滴度。
如图2所示，单独敲除yfkN及后续ywlF-prs过表达均未能实现NMN产量的显著提升。该结果表明，pncB编码的烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）[31]很可能是NMN由NAM合成途径中的限速酶。PncB表达不足限制了PRPP的下游转化，即使增强了PRPP生物合成，代谢通量仍被阻断，无法向NMN积累方向流动。此外，除携带质粒的NMN002外，所有构建菌株在摇瓶发酵期间均表现出较差的细胞生长（图2B）。测定的培养pH值证实所有发酵培养物均出现酸化（表S2），表明低胞外pH是抑制细菌生长的首要因素。
为进一步探究ywlF和prs过表达对NMN生物合成的影响，研究进行了cinA（编码烟酰胺单核苷酸脱酰胺酶）的染色体敲除及pnuC（编码来源于蜡样芽孢杆菌的NMN转运蛋白）的染色体整合。随后通过pMK4衍生质粒转化构建了三株工程菌株：NMN004（NMN001背景，携带pMK4-T7-pncB）、NMN005（NMN001背景，携带pMK4-T7-ywlF-prs-pncB）和NMN006（NMN003背景，携带pMK4-T7-pncB）。所有菌株均在pH受控发酵条件下培养，相应实验结果汇总于图3。
与表S2所列pH调节参数一致，所有工程菌株的细胞生长均显著改善（图3B）。发酵结果验证了组合工程策略有效促进了NMN合成。具体而言，胞外NMN滴度从原始菌株的192 mg/L增加至529.67 mg/L，提升175.88%，与前期研究结果[31]一致。在菌株NMN006中进一步强化PRPP生物合成途径后，胞外NMN滴度达到957.67 mg/L，较原始菌株164T7P提高398.79%，较菌株NMN004（未进行ywlF-prs途径强化）提高80.81%。这些结果证实ywlF和prs过表达显著促进NMN生物合成。值得注意的是，尽管高拷贝质粒在增强微生物产物合成方面具有普遍优势，但携带pMK4-T7-ywlF-prs-pncB质粒的菌株NMN005未表现出NMN产量的提升。结合细胞生长曲线分析，该现象表明pMK4质粒较大的分子尺寸（8609 bp）可能对宿主菌株造成代谢负担。因此，选择生长性能更优且NMN生产能力更高的菌株NMN006进行后续实验研究。
【数据】NMN001构建：yfkN敲除；NMN002：pMK4质粒过表达ywlF-prs；NMN003：染色体整合ywlF-prs于yfkN基因座；NMN004：NMN001 + pMK4-T7-pncB；NMN005：NMN001 + pMK4-T7-ywlF-prs-pncB；NMN006：NMN003 + pMK4-T7-pncB；胞外NMN滴度：192 mg/L（原始菌株）→ 529.67 mg/L（NMN004，提升175.88%）→ 957.67 mg/L（NMN006，较原始菌株提高398.79%，较NMN004提高80.81%）；pMK4质粒大小：8609 bp
3.2 重定向碳通量以增强PRPP供应和NMN产量
在枯草芽孢杆菌中，NMN生物合成依赖磷酸戊糖途径（PPP）提供PRPP，这可能构成限制NMN滴度进一步提升的主要代谢瓶颈。葡萄糖是微生物培养中最常见的碳底物，通过磷酸转移酶系统进入细胞并汇入糖酵解途径（Embden-Meyerhof-Parnas途径，EMP），在其中被磷酸化为6-磷酸葡萄糖。6-磷酸葡萄糖经连续脱氢形成6-磷酸葡萄糖酸内酯，水解生成6-磷酸葡萄糖酸，随后在PPP内经氧化脱羧产生5-磷酸核酮糖。尽管该天然代谢级联具备功能，但不利的碳分配仍然存在：源自6-磷酸葡萄糖的大部分碳通量分流进入糖酵解途径，生成丙酮酸以维持能量代谢和前体补充，仅少部分进入PPP[34]。此外，高浓度葡萄糖补料（≥20 g/L）易引发溢流代谢，伴随大量乙酸及副产物分泌。这些酸性代谢物抑制164T7P菌株及其工程衍生菌株的增殖。前期试验中反复检测到此类抑制性副产物的持续积累（数据未显示）。
与葡萄糖相比，葡萄糖酸作为替代碳底物具有独特优势。胞外葡萄糖酸由葡萄糖酸通透酶（GntP）内化，经葡萄糖酸激酶（GntK）催化磷酸化为6-磷酸葡萄糖酸，再经6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（GntZ）不可逆脱羧生成5-磷酸核酮糖。该代谢途径绕过了糖酵解的碳消耗，直接为PPP氧化臂供碳，能够更有效地将碳通量引向PRPP生物合成。5-磷酸核酮糖经核糖-5-磷酸异构酶（YwlF）和PRPP合成酶（PRS）依次转化为PRPP，为NMN合成提供核心前体。然而，葡萄糖酸分解代谢酶GntP、GntK和GntZ的转录受到转录调控因子GntR的抑制。为上调这三种酶的表达并增加5-磷酸核酮糖池，研究在菌株NMN006中敲除了gntR基因，并在T7启动子控制下过表达gntP、gntK和gntZ。所得重组菌株命名为NMN007，具有重构的葡萄糖酸代谢途径。
如图4所示，以20 g/L葡萄糖酸钠而非葡萄糖作为主要碳源培养时，菌株NMN007表现出更优的细胞生长。摇瓶发酵120 h后，NMN007的胞外NMN滴度峰值达1202.67 mg/L。该值较以葡萄糖培养的NMN007高25.76%，较相同条件下原始菌株164T7P高526.39%。综合来看，这些结果与重编程葡萄糖酸分解代谢可增强NMN产量的观点一致，可能机制正如研究所假设的——通过增加胞内PRPP可利用性。此外，使用葡萄糖酸钠培养时，微生物代谢过程中的培养基酸化程度较轻，有助于在整个发酵过程中维持稳定的发酵液pH（表S2）。
【数据】碳源浓度：20 g/L葡萄糖酸钠或葡萄糖；NMN007胞外NMN滴度峰值：1202.67 mg/L（葡萄糖酸钠培养）；较葡萄糖培养NMN007提高25.76%；较葡萄糖培养原始菌株164T7P提高526.39%；发酵时间：120 h
3.3 通过调控磷酸盐供应促进NMN生物合成
NMN在结构上由NAM、核糖和磷酸基团组成。在微生物NMN生物合成中，源自培养基的无机磷酸盐（Pi）是NMN生物合成的关键决定因素，不仅作为核心结构组分参与NMN分子构成，还在多个代谢节点发挥调控作用。研究将原始LB培养基替换为富含磷酸盐的改良ZYM培养基（含25 mM Na₂HPO₄和25 mM KH₂PO₄），考察了磷酸盐供应对NMN合成的影响。如图5所示，ZYM培养基显著促进了工程菌株的NMN产量和细胞生长。在ZYM培养基中培养的菌株NMN007，其NMN产量较LB培养基培养时进一步提升53.60%。
【数据】ZYM培养基磷酸盐组成：25 mM Na₂HPO₄ + 25 mM KH₂PO₄；NMN产量提升幅度：53.60%（ZYM培养基 vs LB培养基）
3.4 PRS工程改造对NMN合成的影响
PRPP合成酶（PRS）催化核糖-5-磷酸转化为PRPP，是NMN生物合成途径中的关键酶。然而，天然PRS受胞内PRPP反馈抑制调控，限制了PRPP的过量积累。为解除这一代谢瓶颈，研究比较了表达天然PRS与反馈抑制不敏感型PRS突变体（L135I）的菌株性能。如图6所示，表达PRS（L135I）突变体的菌株在120 h发酵后NMN产量显著高于表达天然PRS的菌株，证实反馈抑制不敏感型PRS突变体可有效增强PRPP供应并促进NMN积累。
进一步研究中，对染色体上天然prs基因进行了原位改造。如图7所示，分别构建了保留天然prs、敲除prs以及由T7启动子驱动表达反馈抑制不敏感型L135I突变体的菌株。结果显示，敲除内源野生型prs并表达L135I突变体的菌株获得了最高的NMN产量。最终，在最优组合条件下——即整合表达ywlF-prs、重构葡萄糖酸代谢途径（gntP-gntK-gntZ过表达 + gntR敲除）、采用富磷ZYM培养基、敲除内源prs并过表达L135I突变体——工程菌株的NMN最终滴度达到4607.33 mg/L，较初始培养条件下的原始菌株提升了2299.65%。
【数据】PRS突变体：L135I；最终NMN滴度：4607.33 mg/L；较原始菌株提升：2299.65%；发酵时间：120 h
讨论与解读
本研究通过多层级代谢工程策略构建了高效生产NMN的枯草芽孢杆菌细胞工厂。研究揭示了几个关键发现：第一，仅增强PRPP合成不足以提高NMN产量，NAMPT（PncB）才是NAM转化途径中的限速酶，必须协同过表达pncB才能实现通量释放；第二，葡萄糖酸代谢途径的改造（gntP-gntK-gntZ过表达 + gntR敲除）可有效将碳通量导向PPP，同时减轻溢流代谢导致的培养基酸化问题；第三，敲除内源野生型prs是充分发挥反馈抑制不敏感型PRS突变体优势的必要前提——一旦消除天然PRS的干扰，增加突变体prs拷贝数并不能进一步提升NMN积累。
编译者解读：该研究展示了典型的"系统级"代谢工程思维——从前体供给（PRPP）、途径限速步骤（PncB）、碳源重定向（葡萄糖酸途径）、营养环境（富磷培养基）到酶分子改造（PRS反馈抑制突变），层层递进，逻辑清晰。尤其值得关注的是葡萄糖酸替代碳源策略，一举解决了碳通量分配和培养基酸化两大难题，体现了碳源选择对工业发酵过程控制的深远影响。最终4607.33 mg/L的NMN产量在枯草芽孢杆菌体系中具有显著竞争力。不足之处在于发酵周期长达120 h，工业化放大时需评估时间成本与产率的平衡。后续研究可探索更高效的诱导策略及发酵工艺优化。
参考来源
Zhang, T. Engineering Bacillus subtilis for the biosynthesis of nicotinamide mononucleotide. Biochemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.bej.2026.110383
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110383