来源：Metabolic flux redirection via glyoxylate shunt disruption enhances poly-γ-glutamic acid production and suppresses foaming in Bacillus subtilis（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
聚γ-谷氨酸（γ-PGA）是一种应用广泛的天然生物聚合物，但其发酵生产长期受制于底物利用率低和发酵过程严重起泡两大瓶颈。本研究通过精准敲除枯草芽孢杆菌JJ-2中的异柠檬酸裂解酶编码基因aceA，构建了高产突变株JJ-2ΔaceA，使γ-PGA产量提升至61.35 g/L，碳源消耗率达97.4%。结合转录组与代谢组分析，研究揭示了"阻断-推动-拉拽"（Block-Push-Pull）协同代谢重编程机制，并在50 L反应器中以糊精为碳源将产量进一步提高至71.45 g/L。同时，该突变株表现出显著的低起泡特性，为低成本、规模化γ-PGA生产提供了新路径。
研究背景
聚γ-谷氨酸（γ-PGA）是由D-谷氨酸和L-谷氨酸组成的天然聚合物，主要由芽孢杆菌属微生物合成。凭借保水性、缓释性和生物安全性等优良特性，γ-PGA已广泛应用于农业种植、化妆品制造、食品工业和医疗治疗等领域。降低发酵成本、提高产量是推动γ-PGA应用的关键。提升γ-PGA产量的策略可分为两类：宏观发酵工艺优化和微观菌株改造。发酵参数优化如pH调控和溶氧水平控制虽有一定效果，但菌株本身的代谢潜力改造更具根本性。乙醛酸支路将异柠檬酸从TCA循环中分流，减少进入L-谷氨酸代谢的α-酮戊二酸（α-KG）供应，从而限制γ-PGA合成。因此，阻断乙醛酸途径有望增强α-KG供给，促进γ-PGA合成。
研究方法
2.1 基因编辑突变株的构建
以温度敏感型穿梭载体pMAD为基础，采用无标记同源重组策略精准敲除B. subtilis JJ-2中的aceA基因。具体操作如下：从JJ-2基因组中扩增aceA基因上游（UP）和下游（DN）各500 bp的同源臂，同时从pHN216质粒中扩增氯霉素抗性片段（cmx，1484 bp）。三段片段通过重叠PCR连接形成敲除盒（UP+DN+cmx），随后用T4 DNA连接酶将该敲除盒克隆至pMAD载体的BamHI和SalI酶切位点之间。重组质粒pMAD-ΔaceA经PCR和Sanger测序验证后，电转化至B. subtilis JJ-2感受态细胞。单交换菌落在无抗生素LB培养基中于42°C连续传代三次，在37°C的X-gal平板上筛选白色菌落。最终通过特异性引物（aceA-check-F/R）PCR和测序确认aceA基因的缺失，所得突变株命名为JJ-2ΔaceA。
【数据】同源臂长度：500 bp；抗性片段：cmx 1484 bp；酶切位点：BamHI和SalI；培养温度：42°C（传代）、37°C（筛选）
2.2 γ-PGA发酵培养基与参数
细胞生长基础培养基为LB培养基。γ-PGA生产培养基配方为：50 g/L葡萄糖、50 g/L谷氨酸钠、10 g/L柠檬酸钠、0.024 g/L FeCl₃、10 g/L (NH₄)₂SO₄、1 g/L K₂HPO₄、1 g/L MgSO₄·7H₂O、0.1 g/L MnSO₄·H₂O、0.1 g/L CaCl₂，初始pH调至7.2。摇瓶发酵接种量为3%，于37°C、220 rpm条件下培养。5 L罐发酵时搅拌转速提高至260 rpm，通气量为1.5 vvm。48小时连续发酵期间每6小时取样一次。50 L搅拌罐放大发酵中，初始碳源浓度提高至100 g/L，其他组分浓度不变。发酵罐装液量30 L，接种种子培养液（7% v/v），温度维持在37°C，初始罐压0.04 MPa。气体流量恒定在35 L/min，转速在200-600 rpm范围内调节以维持适宜的溶氧百分比。5 L和50 L反应器的γ-PGA发酵均采用分批发酵模式，不进行任何底物补加。
【数据】葡萄糖：50 g/L（摇瓶/5 L）、100 g/L（50 L）；谷氨酸钠：50 g/L；接种量：3%（摇瓶）、7%（50 L）；温度：37°C；转速：220 rpm（摇瓶）、260 rpm（5 L）、200-600 rpm（50 L）；通气量：1.5 vvm（5 L）、35 L/min（50 L）；罐压：0.04 MPa；发酵时间：48 h；取样间隔：6 h
2.3 分析方法
细胞生物量通过测定干重获得：取5 mL发酵悬液，于10000 rpm、4°C离心10 min，弃上清；沉淀用0.85% NaCl洗涤三次，于50°C干燥至恒重。γ-PGA产量采用C18反相高效液相色谱法测定。葡萄糖和谷氨酸浓度使用生物分析仪（S-10，Siemantec Technology）按标准程序检测。碳源消耗率（Rcons,%）计算公式为：Rcons(%) = (C₀-Ct)/C₀ × 100%，其中C₀和Ct分别代表碳源的初始浓度和残余浓度。糊精的初始和残余浓度均以葡萄糖当量计算。总RNA使用商业提取试剂盒（Promega，上海）提取，基因组DNA污染用gDNA Eraser（Takara，中国）去除，cDNA使用反转录试剂盒（Takara，中国）按说明书合成。qRT-PCR使用SupRealQ Ultra Hunter SYBR qPCR master mix试剂盒（Vazyme Biotech，中国）进行，所有基因表达水平采用2⁻ΔΔCt法计算，以dnaN、clsA和rpoB为内参基因。
【数据】离心条件：10000 rpm、4°C、10 min；洗涤液：0.85% NaCl；干燥温度：50°C；检测仪器：C18反相HPLC、S-10生物分析仪；内参基因：dnaN、clsA、rpoB
2.4 组学分析
转录组和代谢组样本取自5 L发酵试验的6 h、18 h和30 h时间点。每个时间点取5 mL发酵产物，用6 M HCl酸化至pH 2.0，然后于10000 rpm离心7 min。收集的细胞沉淀立即用液氮冷冻，于-80°C保存待测。每组设置三个生物学重复。总RNA提取、rRNA去除、文库构建和测序由Majorbio Co., Ltd.（上海）完成。原始读段经质量过滤后比对至B. subtilis JJ-2参考基因组。差异表达基因（DEGs）使用DESeq2鉴定，阈值设为|log2FC| ≥ 1且FDR < 0.05。代谢组检测中，代谢物提取、LC-MS检测和定量同样由Majorbio Co., Ltd.完成。差异积累代谢物（DAMs）以VIP ≥ 1且|log2FC| ≥ 1为标准鉴定。整合转录组和代谢组分析用于揭示DEGs与DAMs之间的相关性，重点关注中心碳代谢、乙醛酸支路、谷氨酸合成和γ-PGA合成途径相关组分。关键基因和代谢物映射至KEGG通路进行功能富集和调控网络分析。
【数据】取样时间点：6 h、18 h、30 h；样本量：5 mL；酸化：6 M HCl至pH 2.0；离心：10000 rpm、7 min；保存：液氮、-80°C；生物学重复：3；DEGs阈值：|log2FC| ≥ 1、FDR < 0.05；DAMs阈值：VIP ≥ 1、|log2FC| ≥ 1
2.5 统计分析
每个实验至少设置三个平行。使用Origin 8.5和SPSS 18.0软件进行生物数据处理与分析。组学数据分析使用多个R包，包括DESeq（差异表达分析）、ggplot2（火山图可视化）、pheatmap（聚类分析和热图绘制）、topGO（GO功能富集）和Vennplot（韦恩图生成）。
【数据】平行数：≥3；软件：Origin 8.5、SPSS 18.0、R包（DESeq、ggplot2、pheatmap、topGO、Vennplot）
研究结果
3.1 aceA敲除突变株的表征
乙醛酸支路将异柠檬酸从TCA循环中分流，减少进入L-谷氨酸代谢的α-KG，进而降低γ-PGA产量。因此，从B. subtilis JJ-2基因组中敲除乙醛酸途径的第一个基因aceA，构建了乙醛酸支路缺陷菌株JJ-2ΔaceA。PCR和测序结果均确认了aceA基因的精准缺失（图S1）。JJ-2ΔaceA突变株与野生型JJ-2在LB培养基中的生长曲线显示出相似的生物量积累和生长速率，无显著差异。然而，JJ-2ΔaceA在LB平板上的菌落形态表现出更强的粘性和轻微聚集表型，暗示胞外聚合物显著增加。扫描电镜结果显示，JJ-2ΔaceA细胞被交联聚合物包裹，而非像JJ-2野生型那样彼此分离，形成三维多孔网络结构（图S2）。由于γ-PGA是一种高度亲水和粘稠的底物，粘液状菌落通常意味着γ-PGA合成能力。Zeng等人从300个粘液状菌落中筛选出高产γ-PGA菌株B. subtilis GXG-5，证实更粘稠的菌落与更高的γ-PGA产量相关。因此，aceA基因的破坏赋予菌株更强的粘性特征，暗示其γ-PGA合成能力更为强大。
摇瓶发酵结果如图1所示。aceA的敲除促进了γ-PGA产量提升。48 h发酵后，突变株JJ-2ΔaceA产生29.77 g/L γ-PGA，较JJ-2（22.27 g/L）提高33.7%。JJ-2ΔaceA的碳源消耗率也显著提升至92%，利用率较野生型提高24%。此外，JJ-2ΔaceA的发酵pH值稳定在6.2-7.2之间，波动远小于JJ-2，表明酸性副产物积累减少（图S3）。分子量分析表明，JJ-2ΔaceA产生的γ-PGA具有更高的平均分子量（1.87 × 10⁶ Da），而JJ-2为1.02 × 10⁶ Da。这些结果可能归因于胞内α-KG和谷氨酸前体库的扩大，为γ-PGA聚合酶提供了更多底物；同时更稳定的pH环境有利于防止γ-PGA降解并促进其积累。
为探究JJ-2ΔaceA突变株γ-PGA产量提升的分子基础，采用qRT-PCR检测了24 h发酵后关键基因的表达谱。JJ-2ΔaceA中aceA及其下游基因aceB（苹果酸合酶）的表达水平低于检测阈值，证实乙醛酸支路被成功阻断。随着乙醛酸支路被抑制，进入TCA循环的碳通量显著增加（图S4）。qRT-PCR结果显示，编码TCA循环关键起始酶柠檬酸合酶的citZ基因表达提高4.26倍。同时，谷氨酸合酶基因簇gltAB的表达基本提升3倍，表明丰富的异柠檬酸转向α-KG合成，积累的α-KG随后进入谷氨酸合成途径。此外，核心γ-PGA合成基因pgsB的表达较野生型菌株大幅上调8.39倍，而编码γ-PGA内切水解酶的pgdS基因表达则显著下降。这表明aceA敲除不仅增强了γ-PGA合成通量，还通过抑制酶促降解效应稳定了胞外γ-PGA的积累。由于γ-PGA合成是ATP依赖的聚合反应，qPCR检测中atp基因（ATP合成相关基因）的上调进一步证实了JJ-2ΔaceA增强的γ-PGA合成能力。通过增强氧化磷酸化途径提供充足的胞内ATP供应，为高效γ-PGA聚合提供了足够能量。
【数据】γ-PGA产量：29.77 g/L（JJ-2ΔaceA）vs 22.27 g/L（JJ-2），提高33.7%；碳源消耗率：92% vs 68%，提高24%；pH范围：6.2-7.2；分子量：1.87 × 10⁶ Da vs 1.02 × 10⁶ Da；citZ表达：提高4.26倍；gltAB表达：提高约3倍；pgsB表达：上调8.39倍
3.2 JJ-2ΔaceA的γ-PGA高产与低起泡表型
为评估乙醛酸支路缺陷菌株JJ-2ΔaceA的生产潜力，本研究进行了5 L和50 L发酵罐的放大实验，系统监测了γ-PGA合成性能、碳利用效率和发酵稳定性。5 L搅拌罐发酵结果进一步证实了JJ-2ΔaceA的优异γ-PGA生产能力，48 h时γ-PGA产量达37.40 g/L（图2A），较野生型JJ-2（26.83 g/L）提高39.4%。生产强度从0.56 g/(L·h)提升至0.78 g/(L·h)。五个重复批次的发酵重现性优异，JJ-2ΔaceA保持高γ-PGA产量且变异极小。底物代谢分析显示，JJ-2ΔaceA具有更高的平均葡萄糖消耗速率（0.86 g/(L·h)），而JJ-2为0.52 g/(L·h)。然而，两菌株的最大生物量积累相同，表明JJ-2ΔaceA增加的碳摄取和利用主要导向γ-PGA合成而非过度细胞生长（图2B，表S7）。与摇瓶试验相似，JJ-2ΔaceA发酵过程中的pH值更稳定，为微生物酶活性提供了更温和的微环境（图2C）。
在50 L发酵罐中，JJ-2ΔaceA持续优于野生型菌株。以葡萄糖为碳源发酵48 h后，JJ-2ΔaceA的γ-PGA产量达61.35 g/L，较JJ-2（33.76 g/L）提高81.7%（图2D）。在放大条件下γ-PGA产量显著高于5 L水平，表明突变菌株对工业发酵具有优异的适应性。基于结果分析，JJ-2ΔaceA在12 h后进入快速合成阶段，并在24-36 h之间达到γ-PGA合成速率峰值（1.8 g/(L·h)），而同期的JJ-2合成速率保持在0.7 g/(L·h)以下。JJ-2ΔaceA的葡萄糖消耗速率进一步提高至2.03 g/(L·h)，显著高于JJ-2（1.75 g/(L·h)）。48 h时JJ-2ΔaceA的残余葡萄糖仅为2.6 g/L，碳源消耗率达97.4%（表S8）；而野生型JJ-2的残余葡萄糖为15.8 g/L，利用率较低（84.2%）。尽管葡萄糖消耗量高，JJ-2ΔaceA的生物量积累（11.2 g/L）与JJ-2相当。在50 L葡萄糖基发酵中，JJ-2ΔaceA实现了0.614 g/g总底物的γ-PGA产率，占理论最大值（0.798 g/g）的76.9%；而野生型JJ-2仅达到理论效率的42.3%，证实更多碳资源参与了高效的γ-PGA合成。
突变菌株JJ-2ΔaceA的自发泡控制能力根据反应器中的泡沫高度进行了定量评估。在5 L搅拌罐发酵中，野生型JJ-2在整个发酵过程中持续产生强烈泡沫，泡沫高度峰值约18.6 cm（图2G），需要频繁添加化学消泡剂以防止发酵液溢出——这是B. subtilis发酵过程中大量表面活性素合成的典型现象。相比之下，突变株JJ-2ΔaceA在48 h发酵期间无需任何消泡剂干预，泡沫高度始终维持在4 cm以下（表S1）。这种低起泡特性在50 L规模发酵中进一步稳定体现。
【数据】5 L γ-PGA产量：37.40 g/L vs 26.83 g/L，提高39.4%；生产强度：0.78 g/(L·h) vs 0.56 g/(L·h)；葡萄糖消耗速率：0.86 g/(L·h) vs 0.52 g/(L·h)；50 L γ-PGA产量：61.35 g/L vs 33.76 g/L，提高81.7%；峰值合成速率：1.8 g/(L·h)（24-36 h）；葡萄糖消耗速率：2.03 g/(L·h) vs 1.75 g/(L·h)；残余葡萄糖：2.6 g/L vs 15.8 g/L；碳源消耗率：97.4% vs 84.2%；生物量：11.2 g/L；产率：0.614 g/g底物（76.9%理论值）vs 42.3%理论值；泡沫高度：<4 cm vs 18.6 cm
3.3 转录组与代谢组联合分析揭示"Block-Push-Pull"机制
为深入理解aceA敲除引发的全局代谢重编程，对JJ-2和JJ-2ΔaceA在5 L发酵的6 h、18 h和30 h时间点进行了比较转录组学和代谢组学分析。主成分分析（PCA）显示，两菌株在基因表达谱和代谢物谱上均存在显著差异（图3A，图4A）。韦恩图展示了不同时间点差异表达基因（DEGs）的重叠情况（图3B），而差异积累代谢物（DAMs）的上下调数量统计和火山图分别如图4B和图4C所示。整合分析聚焦于中心碳代谢、乙醛酸支路、谷氨酸合成和γ-PGA合成途径的关键基因与代谢物。
基于多组学数据，研究提出了"Block-Push-Pull"协同代谢重编程机制（图5）：aceA基因的缺失切断了乙醛酸支路（"Block"），同时增强了糖酵解基因的表达（"Push"），导致α-KG和L-谷氨酸前体积累；聚合酶基因pgsBCA的同步上调高效地将前体转化为γ-PGA（"Pull"）。
【数据】组学取样时间点：6 h、18 h、30 h；分析平台：PCA、DEGs（|log2FC| ≥ 1，FDR < 0.05）、DAMs（VIP ≥ 1，|log2FC| ≥ 1）
3.4 aceA敲除抑制脂肽合成
低起泡表型的分子机制研究表明，aceA敲除后脂肽合成受到全局抑制。热图显示了脂肽生物合成相关基因的表达水平变化（图6A）。srfA操纵子基因在JJ-2和JJ-2ΔaceA中的转录水平如图6B所示。脂肽合成所需前体氨基酸的相对含量如图6C所示。这些结果共同表明，aceA敲除导致的脂肽合成操纵子srfA的全局抑制与低起泡表型密切相关。
【数据】脂肽合成相关基因表达：全局下调；srfA操纵子转录水平：显著降低（原文未详述具体数值）
3.5 糊精碳源放大发酵验证
为评估该策略在工业相关碳源条件下的适用性，研究采用糊精作为碳源在50 L反应器中进行了放大发酵验证。以糊精为基础的发酵系统中γ-PGA产量和生物量的时间曲线如图7A所示。不同发酵规模和碳源条件下最终γ-PGA产量的对比如图7B所示。在50 L糊精基发酵系统中，γ-PGA产量进一步提高至71.45 g/L，且低起泡表型得以保持。这表明该突变株的高产和不起泡特性在不同碳源条件下均能稳定遗传和表现。
【数据】50 L糊精发酵γ-PGA产量：71.45 g/L
讨论与解读
本研究通过精准敲除B. subtilis JJ-2的aceA基因，成功构建了γ-PGA高产且低起泡的突变株JJ-2ΔaceA。多组学分析揭示了"Block-Push-Pull"协同代谢重编程机制：aceA缺失"阻断"乙醛酸支路，将碳通量强制导入TCA循环氧化脱羧分支，导致α-KG积累——转录组中icd上调及代谢组中胞内α-KG滴度提高6倍证实了这一点。与削弱下游TCA循环酶的策略相比，在α-KG节点进行代谢重定向是一种更精细的策略，可避免能量产生受损，因此JJ-2ΔaceA保持了稳健的生长和能量代谢。此前研究表明aceA缺失对地衣芽孢杆菌γ-PGA合成的影响因菌株而异，而本研究的JJ-2ΔaceA菌株保持了TCA循环完整性和能量稳态。
编译者解读：该研究的核心价值在于"一石二鸟"——通过单基因敲除同时解决了γ-PGA生产中产量低和起泡严重两大痛点。从合成生物学应用角度看，"Block-Push-Pull"策略体现了代谢工程中"节点重定向"思维的精髓：不直接强化目标产物合成通路，而是通过切断竞争性分支来迫使碳流重新分配，这种间接调控往往比直接过表达更易维持细胞代谢平衡。值得注意的是，低起泡表型与脂肽合成抑制的关联为工业发酵中泡沫控制提供了基因层面的解决思路，有望减少对化学消泡剂的依赖。未来若能将这一机制与动态调控元件结合，在发酵不同阶段精细调节aceA表达，或许能进一步挖掘菌株的生产潜力。
参考来源
Wang X. Metabolic flux redirection via glyoxylate shunt disruption enhances poly-γ-glutamic acid production and suppresses foaming in Bacillus subtilis. Chemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.cej.2026.179097
DOI: 10.1016/j.cej.2026.179097