来源：Concentration-dependent biological activities of postbiotics derived from Bacillus subtilis LYCC129 in juvenile Micropterus salmoides: effects on nutritional quality and intestinal health（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
后生元作为灭活微生物及其组分的生物活性制剂，正成为替代活菌制剂的饲料添加剂新方向。本研究以传统发酵食品八宝豆豉中分离的枯草芽孢杆菌LYCC129为原料，制备三种浓度的热灭活后生元制剂，添加到大口黑鲈幼鱼饲料中开展8周养殖试验。结果显示，中浓度组（BS129-2，2.5×10⁷ CFU当量/g饲料）在增重、血清免疫指标、肠道绒毛高度及有益菌属丰度等方面表现最优，提示后生元存在浓度依赖性生物活性窗口。
研究背景
药物滥用导致病原菌耐药性增强和药物残留问题日益严峻，研究者转向利用活菌制剂调节宿主免疫。然而，活菌制剂既面临严格储存条件的要求，也存在一定感染风险。后生元是由灭活微生物及其组分构成的生物活性制剂，可通过发酵培养、灭活处理和提取等多道工序制备，含有灭活微生物细胞、细胞碎片、细胞关联组分及代谢产物等生物活性分子，如细胞壁多糖、磷壁酸和肽聚糖。大量体外细胞实验、动物模型研究及日益增多的临床试验已证实后生元在宿主健康调控方面的潜力。
研究方法
2.1 实验菌株与培养条件
本实验所用枯草芽孢杆菌LYCC129菌株由临沂健康工程技术研究中心（中国）提供，保藏编号为CGMCC No. 37377，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）。该菌株分离自传统发酵食品八宝豆豉，经鉴定为食源性枯草芽孢杆菌。
枯草芽孢杆菌在LB肉汤中、37°C条件下培养16小时，获得浓度为2.5×10⁹ CFU/mL的菌悬液。菌悬液以4000 rpm离心15分钟，随后用无菌0.85% NaCl洗涤两次。洗涤后的菌悬液在热灭活前稀释至三个浓度：2.5×10⁷、2.5×10⁸和2.5×10⁹ CFU/mL。对照组CG仅含无菌0.85% NaCl。三组菌悬液和CG均在121°C下高压灭菌15分钟。通过将热处理后的悬液等分涂布于LB琼脂平板并在37°C培养48小时验证完全灭活，未观察到菌落形成。所得制剂为含有灭活菌体及细胞关联组分的全细胞热灭活枯草芽孢杆菌LYCC129制剂。由于细胞经热处理后不再存活，最终饲料中的剂量以CFU当量/g饲料表示。
【数据】菌株：枯草芽孢杆菌LYCC129（CGMCC No. 37377）；培养基：LB肉汤；温度：37°C；时间：16h；浓度：2.5×10⁹ CFU/mL；离心：4000 rpm×15min；洗涤：无菌0.85% NaCl两次；灭活：121°C×15min；灭活验证：LB琼脂平板37°C×48h
2.2 实验饲料与阶梯式设计
基础饲料配方基于前期研究结果（Tao et al., 2022）制定。饲料制备过程中，粗蛋白含量为51.9%，粗脂肪含量为12.8%，如表1所示。鱼粉、豆粕和分离大豆蛋白为蛋白质源；碳水化合物源为面粉；脂肪源为鱼油、大豆油和大豆卵磷脂。原料按配方要求称重，先粉碎，过60目筛，最后与水充分混合30分钟。混合物随后投入双螺杆挤出机（TSE65），使用2.5毫米模具挤出颗粒饲料（北京扬工，中国）。颗粒在55°C下干燥6小时，然后储存在阴凉干燥环境中。
实验设四组：不含后生元的阴性对照组（CG），以及三个给予不同浓度枯草芽孢杆菌LYCC129后生元制剂的实验组（BS129-1、BS129-2、BS129-3）。每组各取10 mL均匀喷洒在100 g大口黑鲈幼鱼饲料上，阴凉处风干，使饲料中最终含量为0、2.5×10⁶、2.5×10⁷、2.5×10⁸ CFU当量/g饲料。
【数据】粗蛋白：51.9%；粗脂肪：12.8%；筛网：60目；混合时间：30min；挤出机：TSE65双螺杆；模具孔径：2.5mm；干燥：55°C×6h；喷洒量：10mL/100g饲料；终浓度：0、2.5×10⁶、2.5×10⁷、2.5×10⁸ CFU当量/g饲料
2.3 鱼只与养殖实验
300尾大口黑鲈幼鱼置于水深120 cm的水族箱中。受试鱼先以对照饲料驯化两周以适应实验条件。驯化期结束后，共240尾健康大口黑鲈幼鱼（平均体重：12.41 ± 0.15 g）随机分配至12个水族箱——每箱水深50 cm，放养20尾鱼。水族箱为养殖试验及后续统计分析的实验单元。12个水族箱分为4组（CG、BS129-1、BS129-2、BS129-3），每组设3个独立重复。
8周养殖实验期间，每天投喂两次，时间为8:30和17:30。养殖期间水温维持在25至27°C之间，光周期为12小时光照/12小时黑暗。溶解氧：8.47 ± 0.07 mg/L，pH：8.03 ± 0.09，氨氮含量：0.02 ± 0.01 mg/L。临沂大学动物实验伦理委员会（批准号：LYU20250902）批准了本研究的所有程序。
【数据】鱼数量：300尾（驯化）→240尾（正式实验）；平均体重：12.41 ± 0.15 g；水族箱：12个（4组×3重复）；每箱鱼数：20尾；水深：50cm；实验周期：8周；投喂：8:30和17:30；水温：25-27°C；光周期：12h光照/12h黑暗；溶解氧：8.47 ± 0.07 mg/L；pH：8.03 ± 0.09；氨氮：0.02 ± 0.01 mg/L
2.4 样品采集
养殖期间，在第3、6和8周计数各水箱中大口黑鲈幼鱼数量并记录体重。养殖期结束后，所有大口黑鲈幼鱼禁食24小时，然后用MS-222麻醉。为分析存活率（SR）和最终平均体重（MBW），记录每个水箱中大口黑鲈幼鱼的数量和总重量。
从每个水箱随机选取的12尾鱼中，3尾立即在−80°C冷冻用于体成分分析，另外9尾立即解剖。用无菌1-mL注射器从9尾解剖个体中3尾的尾静脉采集血样。血样在4°C下以3000 rpm离心10分钟。血清分离后，保存于−80°C供进一步分析。另解剖3尾鱼，取出内脏，记录肝脏重量，计算肝体比（HSI）。在剩余3尾鱼解剖过程中采集肠道组织样本用于组织学分析。其余肠道样本转移至−80°C冰箱，用于炎症相关基因表达分析。为测定肠道微生物群，在最后一次投喂后6小时采集鱼肠道内容物。从每个水箱随机选取3尾大口黑鲈幼鱼的肠道样本合并为一个复合样本（n = 3）。
大口黑鲈幼鱼增重率（WG）、存活率（SR）和肝体比（HSI）的计算方法如Wang et al.（2021）所述。生长性能、鱼体成分、血清免疫指标（溶菌酶、补体C3、补体C4、IgM）、组织形态、基因表达（qPCR）和肠道微生物群（16S rRNA测序）均按标准方案分析。
【数据】采样时间点：第3、6、8周；禁食：24h；麻醉剂：MS-222；冷冻：−80°C；血样离心：3000rpm×10min×4°C；肠道内容物采集：末次投喂后6h；复合样本：3尾/箱
2.5 分析方法
#### 2.5.1 生长性能分析
养殖期间，在第3、6和8周计数各水箱中大口黑鲈幼鱼数量并记录体重。第8周记录每个鱼箱的死亡率。
【数据】记录时间点：第3、6、8周
#### 2.5.2 体成分分析
大口黑鲈全鱼和肝脏的常规营养成分按照AOAC标准方法（Arlington, 1995）测定。水分含量测定：样品在105°C下烘箱干燥至恒重；粗脂肪采用索氏提取法测定；粗蛋白采用凯氏定氮法测定（N × 6.25）；粗灰分含量采用马弗炉550°C焚烧样品至恒重测定。
【数据】水分测定：105°C烘至恒重；粗脂肪：索氏提取法；粗蛋白：凯氏定氮法（N×6.25）；粗灰分：马弗炉550°C至恒重
#### 2.5.3 血清生化分析
血清免疫指标，包括免疫球蛋白M（IgM）、补体成分3（C3）和补体成分4（C4），使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（南京建成，中国）检测。溶菌酶（LZM）使用商业检测试剂盒（南京建成，中国）测定。所有操作均严格按照南京建成生物工程研究所提供的说明书执行。
【数据】检测方法：ELISA试剂盒（IgM、C3、C4）；商业试剂盒（LZM）；试剂来源：南京建成（中国）
#### 2.5.4 肠道组织形态学分析
采集约1 cm肠道组织，用组织固定液（Servicebio）固定。随后样品依次用不同浓度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。切片厚度设为5 μm，采用苏木精-伊红（H&E）染色。使用显微镜（Nikon ECLIPSE E）观察以识别特征和结构。
【数据】组织长度：约1cm；切片厚度：5μm；染色：H&E；显微镜：Nikon ECLIPSE E
研究结果
3.1 生长性能
试验结束时，BS129-1和BS129-2组鱼的HSI显著低于对照组CG（P < 0.05）。BS129-1、BS129-2和BS129-3各组末MBW均显著高于CG组鱼（P < 0.05）。各补充组与对照组之间WG存在显著差异（P < 0.05）。各组间SR无显著差异（P > 0.05）（表3）。
【数据】HSI：BS129-1、BS129-2组显著低于CG（P<0.05）；MBW：三组均显著高于CG（P<0.05）；WG：各补充组与CG差异显著（P<0.05）；SR：各组间无显著差异（P>0.05）
3.2 体成分
如表4所示，BS129-1和BS129-2组的全鱼粗蛋白含量显著高于CG组（P < 0.05）。所有补充组的全鱼粗脂肪含量均显著低于CG组（P < 0.05）。在肝脏中，补充组的水分和蛋白质含量显著低于CG组，其中BS129-2和BS129-3组的肝脏蛋白含量最低（P < 0.05）。BS129-2组的肝脏脂质含量最高，而BS129-1和BS129-3组与CG组之间未观察到显著差异。
【数据】全鱼粗蛋白：BS129-1、BS129-2显著高于CG（P<0.05）；全鱼粗脂肪：所有补充组显著低于CG（P<0.05）；肝脏水分/蛋白：补充组显著低于CG（P<0.05）；肝脏脂质：BS129-2组最高
3.3 免疫参数
BS129-2和BS129-3组的血清C3水平显著高于对照组（CG）（P < 0.05），分别为对照组的2.11倍和2.75倍。与CG组相比，BS129-1、BS129-2和BS129-3组的血清C4、IgM和LZM水平均显著升高（P < 0.05）（表5）。
【数据】C3倍数：BS129-2为CG的2.11倍，BS129-3为CG的2.75倍（P<0.05）；C4、IgM、LZM：三组均显著升高（P<0.05）
3.4 肠道结构特征
图1展示了大口黑鲈幼鱼肠道的代表性组织学图像（图1A）。与对照组（CG）相比，BS129-2组的肠道绒毛高度（IVH）出现统计学显著增加（P < 0.05）（图1B）。三个实验组（BS129-1、BS129-2和BS129-3）的肠道肌层厚度（IMT）均呈上升趋势，如图1D所示。此外，BS129-2和BS129-3组的肠道绒毛厚度（IVT）数值较CG有所降低，但未达到统计学显著水平（P > 0.05）（图1C）。
【数据】IVH：BS129-2组显著高于CG（P<0.05）；IMT：三组均呈上升趋势；IVT：BS129-2、BS129-3数值降低但P>0.05
3.5 肠道炎症因子基因表达水平
大口黑鲈幼鱼肠道炎症因子的相对表达水平如图2所示。BS129-1组与CG之间各炎症因子的表达水平无显著差异（P > 0.05）。BS129-2组与CG之间ZO-1的表达水平存在统计学显著差异，BS129-2组ZO-1表达水平显著高于CG（P < 0.05）。BS129-3组的IL-10和IL-1β表达水平均出现统计学显著上调（P < 0.05）。
【数据】ZO-1：BS129-2组显著高于CG（P<0.05）；IL-10、IL-1β：BS129-3组显著上调（P<0.05）；BS129-1组：各因子无显著差异（P>0.05）
3.6 肠道微生物群
采用16S rRNA基因测序分析肠道微生物群落，所有实验组共获得943,493条高质量序列。获得的序列基于97%相似性阈值归入操作分类单元（OTU）。在不同分类水平上对肠道微生物群落进行了表征（图3）。
在门水平上，Bacillota、Fusobacteriota、Actinomycetota和Pseudomonadota在所有组别的肠道中占主导地位（图3A）。在BS129-1、BS129-2和BS129-3实验组的大口黑鲈样本中，Bacillota的相对丰度较高。在属水平上，所有实验组的细菌群落均表现出显著较高的Cetobacterium、Clostridium、Turicibacter、Acinetobacter、Aurantimicrobium等相对丰度（图3B）。BS129-2处理组中具有潜在益生特性的Cetobacterium相对丰度显著高于对照组（P < 0.05）（图3C）。
为检测各实验组间具有统计学显著差异的细菌类群，使用线性判别分析效应大小（LEfSe）方法比较所有组的微生物群落结构。结果显示，后生元补充组的肠道微生物群中有7个细菌属表现出统计学显著富集。Parageobacillus在BS129-1组富集；Roseateles在BS129-2组富集；Clostridium、Rhodococcus、Methylobacterium、Mesorhizobium和Romboutsia在BS129-3组富集（图3D）。
图4显示了不同组间肠道微生物功能通路的预测结果。与对照组相比，BS129-1、BS129-2和BS129-3组在多个功能通路中表现出升高的相对丰度，包括碳水化合物代谢、膜运输、信号转导、细胞群落—原核生物、能量代谢、核苷酸代谢、细胞运动性、折叠分选与降解、聚糖生物合成与代谢、细胞生长与死亡以及免疫系统（P < 0.05）（图4）。
【数据】高质量序列总数：943,493条；OTU阈值：97%相似性；门水平优势菌门：Bacillota、Fusobacteriota、Actinomycetota、Pseudomonadota；属水平：Cetobacterium在BS129-2组显著高于CG（P<0.05）；LEfSe富集菌属：BS129-1组1个（Parageobacillus）、BS129-2组1个（Roseateles）、BS129-3组5个（Clostridium、Rhodococcus、Methylobacterium、Mesorhizobium、Romboutsia）；功能通路：11条通路在补充组显著升高（P<0.05）
讨论与解读
本研究证实枯草芽孢杆菌LYCC129后生元制剂可影响大口黑鲈幼鱼的生长、免疫应答和肠道健康。类似研究也已在结肠炎诱导小鼠（Pradhan et al., 2023）、鲤鱼（Wang et al., 2021）和牛蛙（Tao et al., 2023）中报道，这些发现支持了芽孢杆菌源后生元作为功能性添加剂的潜力。
补充组的末MBW和WG显著高于对照组，表明枯草芽孢杆菌LYCC129后生元制剂具有促生长作用。BS129-1和BS129-2组的全鱼粗蛋白含量升高，提示中等补充水平可改善营养沉积。值得注意的是，补充组的肝脏蛋白含量降低，尤其是BS129-2和BS129-3组。这一结果说明，虽然中等剂量补充改善了全鱼蛋白沉积，但也可能改变了肝脏营养代谢。需进一步分析肝脏组织学和代谢相关标志物，以阐明该变化的生理意义。
编译者解读
本研究最值得关注的设计是采用三个浓度梯度（相差10倍）评估后生元效应，清晰揭示了"浓度-活性"关系——并非剂量越高效果越好：中浓度组（BS129-2）在肠道绒毛高度和Cetobacterium丰度上表现最优，而高浓度组（BS129-3）则在特定免疫基因上显示更强效应。这种浓度依赖性的差异化响应提示，后生元应用需要针对目标性状进行剂量优化。从产业化角度看，热灭活全细胞制剂制备工艺简单、储存条件宽松，较活菌制剂更具应用便利性。但本研究未涉及后生元活性成分的鉴定与分离，作用机制仍停留在表型描述层面，后续若能结合代谢组学和转录组学阐明关键活性分子及其信号通路，将推动后生元从经验应用走向理性设计。
参考来源
Li, J.-X. (2026). Concentration-dependent biological activities of postbiotics derived from Bacillus subtilis LYCC129 in juvenile Micropterus salmoides: effects on nutritional quality and intestinal health. Food Bioscience. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109426
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109426