来源：Enhancement of bioactive compounds in Haematococcus pluvialis through fermentation by glutamate-dependent Bacillus subtilis（LWT）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）以积累虾青素闻名，但其营养丰富的生物质本身也是微生物发酵的优质底物。本研究利用谷氨酸依赖性Bacillus subtilis HA发酵雨生红球藻，通过添加不同浓度谷氨酸钠（MSG），实现对发酵产物中γ-聚谷氨酸（γ-PGA）粘质物、肽类、多酚等功能成分的定向调控。研究结果显示，10% MSG组发酵48小时后粘质物产量达3.90%，其中γ-PGA占比81.49%；而无MSG组则表现出最高的肽含量（270 μg/mL）和抗氧化活性。该策略为微藻基功能性食品配料的开发提供了新路径。
研究背景
全球人口增长对食品供应链构成持续压力，传统食品生产体系面临可持续性挑战。微藻单位面积生物量产出高，可在非耕地利用非饮用水培养，部分种类甚至可在海水中生长，且蛋白质含量丰富，适合工业化生产，被视为未来食品的重要原料来源。雨生红球藻作为一种绿色微藻，不仅能在胁迫条件下积累类胡萝卜素虾青素，其生物质还富含蛋白质、氨基酸、矿物质及多种胞内代谢物。这些组成特性使其成为微生物发酵的理想底物——通过发酵转化，可进一步提升其功能价值，生产具有多重生物活性的食品配料。
研究方法
2.1 材料
雨生红球藻提取物粉末购自EOMMA AESON Co., Ltd.（韩国金泉市）。该粉末的制备流程为：采收雨生红球藻后，经初步清洗去除杂质并干燥；将清洁生物质进行热水提取和过滤以回收可溶性成分；提取液经减压浓缩以尽量减少热敏性生物活性化合物的热降解；灭菌后喷雾干燥获得稳定粉末产品。本研究直接使用该粉末作为发酵底物，未进行纯化或修饰。
谷氨酸钠（MSG）和葡萄糖（用作粘质物产生的底物）分别购自CJ CheilJedang Co., Ltd.（韩国首尔）和Q-One Co., Ltd.（韩国首尔）。脱脂乳（用作食品应用目的起始培养物培养基）购自Seoul Milk Cooperative（韩国首尔）。MRS肉汤（Difco™, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA）用于培养物制备。所有分析用试剂均为分析纯级。
2.2 菌株与培养起始物制备
本研究所用Bacillus subtilis HA（KCCM 10775P）购自韩国微生物保藏中心（KCCM）。该菌株最初分离自清麴酱（cheonggukjang），被归类为GRAS细菌，已报道具有合成聚-γ-谷氨酸的能力。
菌株活化：将保存的培养物划线接种于MRS琼脂平板，37°C培养24小时。随后，取一环培养物接种于灭菌的5%脱脂乳培养基中，37°C、160 rpm振荡培养24小时，制备起始培养物。
2.3 芽孢杆菌发酵
发酵培养基在1000 mL带挡板反应容器中配制：加入10 g/L雨生红球藻粉末、20 g/L葡萄糖，以及0、50或100 g/L MSG（分别对应0%、5%和10% MSG组）。培养起始物通过在5%（w/v）脱脂乳培养基中预培养B. subtilis HA制备，以全悬浮液形式使用，不进行细胞收集或洗涤。接种物最终浓度为50 g/L。种子培养物在所有实验中以相同条件制备，并以相同剂量添加至所有处理组。最终工作体积用灭菌蒸馏水调整至400 mL。发酵培养基在37°C、160 rpm振荡培养48小时。
为评估雨生红球藻对γ-PGA产生的影响，使用不含雨生红球藻的培养基进行对照发酵。此外，采用不含雨生红球藻的确定成分培养基作为粘质物产生的阳性对照。所有培养基组成见原文Table S1。总工作体积和HA起始培养物接种水平与雨生红球藻基发酵培养基保持一致，所有发酵条件（包括工作体积400 mL）在各处理组间保持一致。
2.4 发酵雨生红球藻的理化分析
#### 2.4.1 细胞生长动力学测定
在48小时发酵期间，按固定时间间隔采集样品以评估微生物生长特征。细菌生长通过标准平板计数法和600 nm处光密度（OD600）测定两种方法评估。OD值使用EPOCH2微孔板读数仪（BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA）测定。
为表征生长动力学，OD600数据采用非线性回归分析拟合Gompertz生长模型。模型表达式为：
Eq. (1) OD(t) = YM · exp[−exp(−K(t − t0))]
其中OD(t)为时间t时的光密度，YM为最大生物量（渐近OD600），K为生长速率常数，t0为从迟滞期向指数期转变的拐点时间。使用GraphPad Prism（版本10.4.2, GraphPad Software, San Diego, CA, USA）进行非线性回归分析以估算动力学参数。
活菌计数：取100 μL培养物样品与900 μL 0.85% NaCl溶液混合，进行10¹至10⁶系列稀释。随后取各稀释度20 μL涂布于MRS琼脂平板，37°C培养24小时。活菌数以log菌落形成单位（CFU）/mL表示。
#### 2.4.2 葡萄糖消耗测定
雨生红球藻发酵液中的还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定，以D-葡萄糖为标准品。样品经16,200 × g离心15分钟后，收集上清液并稀释，取1 mL稀释样品与3 mL DNS试剂混合。反应混合物在沸水浴中（100°C）加热5分钟，室温（约25°C）避光冷却40分钟，于550 nm处测定吸光度。
#### 2.4.3 发酵雨生红球藻粘质物成分分析
2.4.3.1 粘质物含量测定
为测定粗粘质物（含γ-PGA）含量，取10 g发酵液样品与10 g蒸馏水混合并涡旋。混合物以3134 × g离心30分钟收集上清液。随后，将上清液加入装有40 g已于−20°C预冷的异丙醇的锥形瓶中，使粘质物沉淀。用镊子收集聚集的聚合物，在60°C干燥箱中干燥24小时。称量干燥粘质物重量，按Eq. (2)计算含量：
Eq. (2) 粘质物含量(%) = Wd/Ws × 100(%)
其中Wd为粘质物干重，Ws为样品重量。
2.4.3.2 粘质物总碳水化合物测定
发酵雨生红球藻来源粘质物的总碳水化合物含量采用苯酚-硫酸法（Nielsen, 2009）测定。向每管加入1 mL苯酚溶液，随后加入5 mL 96%硫酸，充分涡旋混合。静置10分钟后，再次振荡试管，于30°C水浴孵育20分钟。随后使用分光光度计（UV-5100 UV/Vis分光光度计，上海美析仪器有限公司，中国上海）于490 nm处测定吸光度。
2.4.3.3 粘质物粗蛋白测定
发酵液蛋白质含量使用BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, USA）测定。取25 μL标准品或样品加入96孔微孔板各孔中。随后向每孔加入200 μL新鲜配制的工作试剂，轻轻振荡平板30秒确保充分混合。盖上平板，37°C孵育30分钟。冷却至室温后，使用微孔板读数仪（Epock, BioTek Instrument Inc., USA）于562 nm处测定吸光度。
2.4.3.4 粘质物γ-PGA含量测定
粘质物中γ-PGA含量测定参照Wei等（2010）的方法并稍作修改。含γ-PGA的样品在6 M HCl中、105°C下水解24小时。水解后，反应混合物用6 M NaOH中和。未水解和水解样品中的谷氨酸浓度使用配备Acclaim™ 120 C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA）的HPLC系统（Ultimate 3000, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA）测定。流动相为10%甲醇（v/v, pH 2.5），流速0.4 mL/min。使用UV-Vis检测器进行检测。
【数据】菌株：Bacillus subtilis HA（KCCM 10775P）；活化温度：37°C；活化时间：24h；起始培养：5%脱脂乳，37°C，160 rpm，24h；发酵底物：10 g/L雨生红球藻粉 + 20 g/L葡萄糖 + 0/50/100 g/L MSG；接种量：50 g/L；工作体积：400 mL；发酵条件：37°C，160 rpm，48h；离心：16,200 × g，15min；DNS法：100°C，5min，550nm；粘质物沉淀：−20°C异丙醇，3134 × g，30min，60°C干燥24h；苯酚-硫酸法：30°C，20min，490nm；BCA法：37°C，30min，562nm；γ-PGA水解：6M HCl，105°C，24h；HPLC：C18柱（4.6mm × 250mm），10%甲醇（pH 2.5），0.4 mL/min
研究结果
3.1 *B. subtilis* HA在发酵雨生红球藻培养基中的生长动力学
在雨生红球藻基培养基中发酵时，B. subtilis HA的活菌数从初始水平7.50 log CFU/mL上升至培养24小时后超过9.00 log CFU/mL（MSG 0%组：9.38 log CFU/mL；5%组：9.08 log CFU/mL；10%组：9.52 log CFU/mL）。48小时时，细胞活力下降，最终计数分别为9.11、8.19和8.14 log CFU/mL（图2A）。
一般而言，B. subtilis在NaCl浓度低于2%时生长最佳。然而，多数菌株据报道可在高达5% NaCl的环境中存活。鉴于MSG每100 g约含39.34 g NaCl（Gul et al., 2023; Maluly et al., 2017），这些发现提示MSG中所含的钠可能对细菌细胞施加渗透胁迫，可能影响其在较高MSG浓度下的生长动态。
OD600曲线呈典型S形生长模式，使用Gompertz模型拟合（图2B），所得动力学参数汇总于原文Table 1。最大生物量（YM）在0%组中最高（1.428；95% CI: 1.388–1.470），而MSG 5%和10%组的YM值降低（分别为1.012和1.174）。相比之下，生长速率常数（K）随MSG浓度增加而升高，最高值出现在MSG 10%组（0.2344），表明指数期生长加速。相应的1/K降低进一步证实了较高MSG水平下更快的生长动力学。
综合来看，这些结果表明MSG补充提高了生长速率但并未促进最终生物量积累，提示生长动力学与生物量产量之间存在权衡关系。MSG处理组在24–36小时后观察到的下降可能与渗透或代谢胁迫有关，与已报道的代谢重新分配机制一致（Wu et al., 2025）。
【数据】初始活菌数：7.50 log CFU/mL；24h活菌数：0%组9.38、5%组9.08、10%组9.52 log CFU/mL；48h活菌数：9.11、8.19、8.14 log CFU/mL；YM：0%组1.428（95% CI: 1.388–1.470）、5%组1.012、10%组1.174；K最高值：10%组0.2344；MSG含NaCl：39.34 g/100g
3.2 发酵雨生红球藻培养基中还原糖消耗
MSG补充组在所有采样时间点的葡萄糖浓度降低幅度均显著大于无MSG组（图3）。葡萄糖作为代表性可发酵糖，是B. subtilis在γ-PGA生物合成中的主要碳源。通过Embden–Meyerhof–Parnas（EMP）途径和三羧酸循环，葡萄糖被代谢为丙酮酸，随后转化为α-酮戊二酸（α-KG），后者是谷氨酸生物合成的重要中间体（Hsueh et al., 2017; Yu et al., 2017）。此外，当葡萄糖作为额外碳源供给时，B. subtilis IF03335会产生γ-PGA和多糖作为副产物（Goto & Kunioka, 1992），表明其激活了生物聚合物合成途径，从而增强聚合物的分泌。
【数据】葡萄糖消耗：MSG补充组各时间点均显著高于无MSG组（原文未详述具体数值）；发酵条件：37°C，160 rpm，48h
3.3 发酵雨生红球藻培养基中的粘质物成分
粘性物质的产生因MSG（作为γ-PGA生物合成前体）的存在及浓度不同而有所差异（图4A）。0% MSG组在整个发酵期间未形成粘质物，表明γ-PGA的生物合成严格依赖外源谷氨酸作为底物。此外，不含雨生红球藻但含葡萄糖和MSG的培养基（对照）在发酵48小时后产生2.53%粘质物，表明在无雨生红球藻的情况下谷氨酸合成仍可发生。然而，在相同MSG条件下，雨生红球藻基培养基表现出更高的粘质物产量，提示雨生红球藻对γ-PGA的产生具有显著影响。
含10% MSG的确定成分培养基（作为阳性对照）在发酵48小时后粘质物产量为4.89%，约为含10% MSG的雨生红球藻基培养基（3.90%）的1.25倍。B. subtilis HA在补充3%谷氨酸的确定成分培养基中产生γ-PGA，发酵第2天较第1天显著增加（Kim et al., 2014）。此外，在多种可获得高产量γ-PGA的B. subtilis HA发酵培养基中，含10% MSG的Dendropanax morbifera提取物培养基实现了4.10%的γ-PGA转化率（Son et al., 2024）。类似地，补充3% MSG的乳基培养基聚合物产量为4.65%（Lee, Yoon, Lee, & Garcia, 2022）。这些结果与本研究一致——我们获得了相当的转化效率4.01%，表明在所采用的培养条件下粘质物产量处于相似水平。
从补充10% MSG的雨生红球藻培养基中回收的粘质物成分分析显示，γ-PGA占粘性物质的81.49%（图4B，基于色谱图Fig. S1），而蛋白质和总碳水化合物分别占13.22%和5.29%。相比之下，确定成分培养基中产生的粘质物由96.9% γ-PGA及少量蛋白质（0.1%）和碳水化合物（3.0%）组成（Seo et al., 2008）。这些结果表明，尽管雨生红球藻基培养基产生的γ-PGA纯度略低于确定成分培养基，但谷氨酸补充有效促进了以γ-PGA为主要成分的粘质物产生。
综上，虽然从食品级雨生红球藻培养基中发酵获得的粘质物γ-PGA纯度相对低于确定成分培养基，但谷氨酸的补充有效促进了γ-PGA为主要成分的粘质物的产生。
【数据】粘质物产量：0% MSG组未检出；对照（无雨生红球藻）2.53%；阳性对照（10% MSG确定培养基）4.89%；10% MSG雨生红球藻组3.90%；γ-PGA转化率：4.01%；粘质物组成：γ-PGA 81.49%、蛋白质13.22%、总碳水化合物5.29%；确定培养基粘质物组成：γ-PGA 96.9%、蛋白质0.1%、碳水化合物3.0%
3.4 发酵雨生红球藻培养基中的肽含量
为监测雨生红球藻发酵培养基中的蛋白质降解情况，使用以酪氨酸为标准品的测定法间接测量肽含量（图5）。与发酵前水平相比，所有样品的酪氨酸含量随发酵时间延长而显著升高。值得注意的是，对照组在发酵后表现出最高的酪氨酸浓度（270 μg/mL；图5）。B. subtilis HA菌株在发酵48小时时表现出443 U/mL的蛋白酶活性（Park et al., 2024）。这些发现表明，酶活性诱导雨生红球藻蛋白质的结构或组成修饰，从而在使用Folin试剂时增加可检测肽的数量（Zhu et al., 2021）。
【数据】最高酪氨酸浓度：270 μg/mL（对照组）；蛋白酶活性：443 U/mL（48h）；测定标准：酪氨酸
3.5 发酵雨生红球藻培养基中的多酚含量
食品物料中的酚类化合物是人类膳食中最丰富的抗氧化剂（Li et al., 2014）。发酵前各组总多酚含量相当，范围为12.44至16.07 mg GAE/mL，与MSG添加无关。然而，发酵48小时后，所有组均观察到显著增加，尤其是0%和5% MSG组，分别达到208.32和217.06 mg GAE/mL（图6）。这表明B. subtilis HA发酵促进了食品基质中蛋白质的降解，导致生物活性肽的产生，同时通过促进多酚的溶解和生物合成，增加了多酚含量和抗氧化活性（Chai et al., 2020; Huang, 2023; Zhang et al., 2025）。
【数据】发酵前总多酚：12.44–16.07 mg GAE/mL；发酵48h后：0%组208.32、5%组217.06 mg GAE/mL；增加倍数：9.3–16.8倍
3.6 发酵雨生红球藻培养基中的抗氧化活性
发酵受多种因素影响，包括微生物类型、底物水平、时间和温度，这些因素均可显著影响最终产品中生物活性化合物浓度和抗氧化特性（Sarıtaş et al., 2024）。在DPPH自由基清除试验中，所有样品在发酵后均表现出增强的清除能力，各处理组间活性相近。0% MSG条件下肽产量的增加（图5）可能对此效应有所贡献，因为酪氨酸、色氨酸和组氨酸等残基……
【数据】DPPH清除活性：所有样品发酵后均增强（原文未详述具体数值）；各处理组间活性相近
讨论与解读
本研究建立了利用Bacillus subtilis HA发酵雨生红球藻的体系，并通过MSG补充调控最终发酵产物的生物活性组成。主要结论包括：10% MSG补充获得最高粘质物产量（3.90%），回收粘质物以γ-PGA为主（81.49%），证实外源谷氨酸有效促进了微藻底物中γ-PGA主导型生物聚合物的产生；无MSG组表现出最高的肽含量和抗氧化活性，提示谷氨酸限制条件下有利于肽的生成；发酵还显著增加了总多酚含量和α-葡萄糖苷酶抑制活性，表明发酵产物整体功能特性得到提升。雨生红球藻可作为生产多功能食品配料的有前景的发酵底物，MSG补充可实现粘质物的选择性富集，而无MSG发酵则表现出更高的蛋白水解相关响应和抗氧化活性。
编译者解读： 该研究巧妙利用谷氨酸依赖性菌株的代谢特性，通过最简单的培养基成分调控实现了产物谱系的定向切换——加MSG得γ-PGA粘质物，不加MSG得活性肽——这种"一菌双产物"的策略在功能性食品配料开发中具有实用价值。值得注意的是，雨生红球藻本身作为虾青素来源成本较高，将其作为发酵底物需考虑经济性平衡。此外，γ-PGA纯度（81.49%）低于确定培养基（96.9%），后续如用于高附加值应用，可能仍需纯化步骤。该体系为微藻-细菌协同转化提供了可调平台，值得进一步探索其他微藻底物的适用性。
参考来源
Cho, B.-S. (2026). Enhancement of bioactive compounds in Haematococcus pluvialis through fermentation by glutamate-dependent Bacillus subtilis. LWT, 2026. DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119611
DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119611