来源：Mechanistic insights of cold plasma inactivation of Bacillus subtilis in little millet (Panicum sumatrense) flour（Innovative Food Science & Emerging Technologies）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
小米作为耐逆性谷物在全球粮食安全中地位重要，但其面粉易受微生物污染。本研究利用介质阻挡放电冷等离子体（DBD-CP）技术，在10、15、20 kV电压下处理小米粉和PBS基质中的枯草芽孢杆菌营养细胞，系统评估了灭活效率、动力学模型拟合及活性氧/氮物种的定量变化。结果显示20 kV处理15分钟可使小米粉中菌量降低0.79 log，PBS中降低约1 log。通过分子对接和FTIR分析揭示了活性氧对细胞壁蛋白的氧化损伤机制，为冷等离子体在谷物加工中的应用提供了理论支撑。
研究背景
小米被全球公认为营养谷物，具有气候适应性强和营养价值高的特点。小米（Panicum sumatrense）是印度最早驯化的小米之一，为热带地区脆弱人群提供重要营养来源，含74–75%碳水化合物、11–12%膳食纤维、7–8%蛋白质、2–3%脂肪及酚类和黄酮类物质。然而，小米粒极小（2.51 × 1.52 × 1.11 mm）、谷壳附着紧密、壳仁比高，脱壳和抛光困难，导致面粉微生物负载不均。高淀粉含量和吸湿性使小米在不当储存条件下易受细菌、真菌和霉菌污染，品质和货架期下降。市售小米粉中检测到芽孢杆菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属等多种微生物，这些病原体的存在可能引发严重食物中毒。冷等离子体技术作为新兴非热杀菌手段，在低水分食品加工中具有应用前景。
研究方法
2.1 基质
本研究采用两种基质：磷酸盐缓冲液（PBS）和小米粉。首先，使用磷酸盐缓冲液（0.90% PBS溶于MilliQ水）维持细菌细胞的活性和代谢状态。小米（Panicum sumatrense）购自印度中央邦贾巴尔普尔谷物市场。测量谷物近似尺寸（长：2.51 mm；宽：1.52 mm；厚：1.11 mm），每份称取5 g，冷等离子体处理前水分含量为10–11%。整粒谷物研磨成粉后过No. 150筛（孔径约100 μm），获得面粉（堆积密度：0.682 g/cm³）。所得面粉作为冷等离子体处理实验的食品基质。
【数据】PBS浓度：0.90%；谷物尺寸：2.51 × 1.52 × 1.11 mm；样品重量：5 g；水分含量：10–11%；筛孔径：约100 μm；面粉堆积密度：0.682 g/cm³
2.2 接种物制备
基于预实验，选择枯草芽孢杆菌作为非致病菌株接种于面粉样品。菌株购自微生物类型培养物保藏中心与基因库（MTCC），编号为MTCC 441。冻干培养物经复活后，在营养琼脂肉汤中于30°C振荡培养箱（Make: Model no. 50084090-RIVOTEK, Valency Lab Equipment Private Limited, India）中培养。细菌复活后，在层流净化台（Model No. AI-149, Amaze Instruments, India）中制备纯培养物以获得工作菌液。培养龄为8–10小时，确保细胞处于营养生长期而非孢子形成状态。接种浓度为7 log CFU mL⁻¹。
【数据】菌株：枯草芽孢杆菌MTCC 441；培养温度：30°C；培养时间：8–10 h；接种浓度：7 log CFU mL⁻¹
2.3 基质制备与接种
小米粉首先经UV-C光（254 nm）照射2小时灭菌以消除背景微生物。具体操作：取3 g灭菌面粉置于灭菌玻璃培养皿中，加入1 mL含枯草芽孢杆菌的接种悬浮液。接种后面粉充分混合避免结块。样品在生物安全柜中干燥1小时后进行冷等离子体处理。为考察基质效应，将3 mL灭菌PBS（参考基质）与1 mL枯草芽孢杆菌（7 log CFU mL⁻¹）混合，在处理前置于生物安全柜中。PBS作为水性参考基质，用于评估基质相关干扰和屏蔽最小化条件下细菌细胞的敏感性。所有实验设三次重复，每个阶段后验证菌落数以排除背景微生物污染。
【数据】UV-C灭菌波长：254 nm；灭菌时间：2 h；面粉用量：3 g；接种量：1 mL；干燥时间：1 h；PBS用量：3 mL；重复次数：3次
2.4 DBD冷等离子体处理
介质阻挡放电（DBD）冷等离子体装置由电压发生器和等离子体处理室组成（图1）。
等离子体处理室由两个高压平行铜电极（厚度5 mm）构成，间距15 mm，面积1225 cm²。介质阻挡板为覆盖两个电极的3 mm厚石英板。高压升压变压器初级绕组输入功率为230 V、50 Hz市电。将接种的PBS（3 mL）和3 g小米粉倒入硼硅酸盐玻璃培养皿（直径=90 mm，面粉填充厚度2 mm）。样品随后暴露于高压介质阻挡放电等离子体（Zeonics Systech Defence and Aerospace Engineers Private Limited, India），电压水平分别为10、15、20 kV，处理时间分别为3、6、9、12、15 min，对应功率密度分别为0.014、0.027、0.038 W/cm³。处理时大气条件为相对湿度65%、温度28°C。冷等离子体处理后，两种基质中的样品重新悬浮于10 mL PBS中并剧烈振荡，然后取样。提取处理后存活的芽孢杆菌细胞进行系列稀释。每个稀释度取100 μL涂布于营养琼脂（NA）培养基。30°C培养16–18小时，三次重复，人工计数暴露后存活的菌落。
公式(1)：CFU/mL = 菌落数 × 稀释因子 / 铺板体积(mL)
【数据】电极厚度：5 mm；电极间距：15 mm；电极面积：1225 cm²；石英板厚度：3 mm；输入电压：230 V；频率：50 Hz；PBS体积：3 mL；面粉质量：3 g；培养皿直径：90 mm；面粉填充厚度：2 mm；处理电压：10、15、20 kV；处理时间：3、6、9、12、15 min；功率密度：0.014、0.027、0.038 W/cm³；相对湿度：65%；温度：28°C；重悬体积：10 mL PBS；涂布体积：100 μL；培养温度：30°C；培养时间：16–18 h
2.5 微生物灭活动力学建模
在小米粉基质中评估冷等离子体处理下芽孢杆菌细胞的灭活情况。比较10、15、20 kV下3、6、9、12、15 min暴露获得的实验数据，以更好地理解食品基质屏蔽细菌免受损伤的影响。使用OriginPro 2024（Origin Lab Corporation, MA, USA）软件对小米粉中获得的实验灭活数据应用三种不同灭活模型。
2.5.1 对数线性模型
公式(2)：N(t) = N₀ × e^(−k_max × t)
其中N₀表示初始细菌群体，N(t)表示时间't'时的群体（CFU mL⁻¹或CFU g⁻¹），k_max表示最大灭活速率（min⁻¹）。
2.5.2 Weibull模型
将非线性模型Weibull模型拟合至实验数据，如公式(3)所示。该方程中，尺度参数'D'表示第一次十进制减少所需时间，形状参数'p'定义曲线形状。若p > 1，曲线呈凹向下（肩形）；若p < 1，曲线呈凹向上（拖尾）效应。这些值通过非线性回归分析获得。
公式(3)：N(t) = N₀ × e^(−(t/D)^p)
2.5.3 Membre模型
Membre模型是一种修正的逻辑型数学模型，用于描述微生物灭活动力学——特别是在热处理条件下。它使用"修正"的逻辑函数来捕捉存活曲线中常见的非线性特征（例如灭活过程开始时的肩部或较长处理时间下的拖尾）。参数'N∞'表示最终渐近存活群体，'t_m'为拐点时间，'s'为形状参数。
公式(4)：N(t) = N∞ + (N₀ − N∞) / (1 + exp((t − t_m)/s))
2.5.4 模型验证
基于校正决定系数（R²）、均方根误差（RMSE）和残差平方和（SSE）统计评估模型性能和拟合优度，公式如下：
公式(5)：SSE = Σ(y_i − ŷ_i)²
公式(6)：RMSE = √(SSE/n)
公式(7)：R²_adj = 1 − (1 − R²)(n − 1)/(n − p − 1)
还确定了准确因子（A_f）和偏差因子（B_f）以评估所应用模型的满意性能。这些参数广泛用于模型验证。公式如下：
公式(8)：A_f = 10^(1/n Σ log₁₀(y_i/ŷ_i))
公式(9)：B_f = 10^(1/n Σ log₁₀(y_i/ŷ_i))
其中'n'表示观测次数，'p'指模型参数，SSE为残差平方和，'R²'为决定系数，'y_i'和'ŷ_i'分别为预测值和实际实验值。
2.5.5 基于Akaike信息准则的模型选择
借助Akaike信息准则（AIC）选择合适模型。AIC方程如下：
公式(10)：AIC = n ln(SSE) − n ln(n) − 2p
其中'n'为观测次数，'p'为模型参数，SSE为残差平方和。根据准则规范，AIC值越小（趋近零），模型拟合越好。AIC值为0的模型被指定为Akaike增量（Δi）。
【数据】建模软件：OriginPro 2024；模型数量：3种（Log-linear、Weibull、Membre）；统计参数：R²、RMSE、SSE、A_f、B_f、AIC
研究结果
3.1 DBD-CP对不同基质中枯草芽孢杆菌的灭活效果
枯草芽孢杆菌在小米粉和PBS中的灭活均随处理电压和暴露时间增加而增强（图2a–c）。
在10 kV下，小米粉中的灭活率随处理时间从3 min增加至15 min而从5.12%升至54.31%，对应显著减少0.02至0.34 log（图2a）。相同条件下，PBS基质中灭活率从10.40%升至56.70%。15 kV下观察到类似趋势，小米粉中最高灭活率为62.80%，相当于显著减少0.43 log；PBS中15 min结束时记录到66.45%灭活率，显著减少0.48 log。在所有研究的时间-电压组合中，20 kV处理15 min获得最大细菌载量降低，小米粉中灭活率达85.62%，显著减少0.79 log。PBS中相同处理条件产生约90%灭活，对应芽孢杆菌载量总体减少约1 log。Samioti等人（2024）报道了类似结果，他们对胰蛋白酶大豆肉汤中培养的鼠伤寒沙门氏菌和枯草芽孢杆菌应用冷常压等离子体（CAPP）处理3至15 min，15 min暴露后分别实现鼠伤寒沙门氏菌1.12 log和枯草芽孢杆菌1.58 log的减少。
PBS基质中比面粉基质中更高的灭活效果可归因于基质效应，使用公式(12)以相对有效性间接量化。这种基质屏蔽阻碍了冷等离子体处理对细菌细胞的灭活。通过计算两种基质在相同等离子体处理条件下的相对有效性，发现PBS中的灭活效果是面粉中的1.25倍，对应于20 kV、15 min时灭活率高出25%，直接量化了小米粉提供的基质屏蔽效应。面粉中细菌在冷等离子体处理期间的这种屏蔽可能通过四种相互关联的机制发生。第一，物理屏蔽——致密面粉颗粒阻碍活性氧/氮物种（ROS/RNS）接触被截留的微生物，类似于生物膜保护但通过物理截留实现。第二，面粉成分如淀粉、蛋白质和酚类物质吸收并清除活性氧/氮物种，在与细菌细胞相互作用前将其中和，从而降低抗菌效果。水分也有影响，因为低水分面粉限制反应性分子的扩散。第三，颗粒大小和排列形成微环境，保护裂缝内或聚集颗粒间的细菌。这些条件共同显著减少细菌损伤。此外，为更好理解该效应，补充文件中提供了活性物种在面粉中穿透的可能现象。与小米粉相比，PBS缺乏可减轻活性氧（ROS）的蛋白质、脂质和抗氧化剂，有利于等离子体物种无阻碍地到达细菌细胞。
公式(12)：相对有效性 = PBS中log减少量 / 面粉中log减少量
图2a显示了枯草芽孢杆菌细胞在10 kV冷等离子体暴露期间（面粉中9 min内仅0.07 log减少）表现出的初始延迟期或抗性。而在较高电压（15 kV）下这种初始抗性最小化，处理9 min后细菌载量降至0.17 log（图2b）。类似地，相同持续时间下，20 kV冷等离子体处理的芽孢杆菌细胞表现出最小抗性（0.28 log减少），如图2c所示。这种响应可归因于与较低电压条件相比，短时间内产生更高强度和浓度的活性等离子体物种。此外，更高密度的活性物种可能更深入穿透细菌团块并到达面粉颗粒下方被屏蔽的细胞——这通常导致灭活曲线中的肩形效应。另一个重要解释是革兰氏阳性芽孢杆菌细胞的结构试图应对较低电压条件下产生的应激条件。由于厚壁和膜作为缓冲，细胞在一段时间内保持亚致死损伤状态，延迟RONS渗入细胞质，为细胞激活修复和抗氧化系统争取时间。
【数据】10 kV灭活率：5.12%→54.31%（3→15 min）；10 kV log减少：0.02→0.34；PBS 10 kV灭活率：10.40%→56.70%；15 kV面粉灭活率：62.80%（0.43 log）；15 kV PBS灭活率：66.45%（0.48 log）；20 kV面粉灭活率：85.62%（0.79 log）；20 kV PBS灭活率：约90%（约1 log）；相对有效性：1.25倍（PBS/面粉）；10 kV 9 min面粉log减少：0.07；15 kV 9 min log减少：0.17；20 kV 9 min log减少：0.28
3.2 小米粉中枯草芽孢杆菌的灭活动力学
小米粉基质中获得的实验数据与不同模型在不同电压条件下的预测值绘图如图3a、3b和3c所示。
随着处理电压增加，参数值出现变化。这一趋势与先前报道一致。对数线性模型中，k值从0.039 ± 0.006 min⁻¹（10 kV）增至0.101 ± 0.009 min⁻¹（20 kV），表明较高冷等离子体强度加速微生物灭活。Membre模型中，相同条件下参数's'从3.398 ± 0.347降至2.631 ± 0.663，参数't_m'从16.419 ± 0.276 min减至12.023 ± 1.192 min。Weibull模型中，尺度参数'D'随施加电压从10 kV增至20 kV而从16.460 ± 0.366 min降至10.817 ± 0.508 min，表明较高电压产生更多等离子体物种（表1）。这些物种增强细菌灭活，缩短有效冷等离子体处理所需时间。灭活曲线的形状参数'p'也随处理电压从10 kV增至20 kV而从2.619 ± 0.25降至1.67 ± 0.270（表1）。'p'的降低表明向更凹的存活曲线转变，指示由于面粉基质保护和等离子体诱导的应激异质性导致的更大初始微生物抗性，随后在较高电压下由升高的活性氧/氮物种（RONS）加速致死。因此，较低的'p'突显了优化电压以克服低水分谷物中早期肩效应的必要性，从而增强整体微生物安全性。
为找到预测微生物灭活的最佳拟合模型，使用各种统计参数进行比较（表2）。在所有冷等离子体处理电压（10、15、20 kV）下，Weibull模型一致显示最高R²值，表明对灭活数据的最佳拟合。10 kV时，Weibull模型（R² = 0.994）优于Membre（R² = 0.989）和对数线性（R² = 0.792）模型。15 kV时，Weibull模型拟合最强（R² = 0.978），而Membre（R² = 0.969）和对数线性（R² = 0.949）较低。20 kV时观察到类似趋势，Weibull显示良好值（R² = 0.957）。基于RMSE值（0.013、0.03、0.076）和SSE值（0.0004、0.0008、0.0058）（分别在10、15、20 kV处理下）的评估也确认Weibull具有最低误差值，优于其他模型。此外，基于准确因子（A_f）和偏差因子（B_f）选择模型。A_f值最接近1的始终为Weibull模型（1.022、1.049、1.106），分别在10、15和20 kV冷等离子体处理下获得。
图4显示了DBD-CP处理的PBS基质中细菌细胞悬浮液离心后上清液pH和电导率的变化。
图5显示了不同电压处理下枯草芽孢杆菌细胞的SEM形态。
图6显示了不同电压条件下DBD-CP处理后枯草芽孢杆菌的ATR-FTIR光谱。
图7显示了ROS（H₂O₂）与枯草芽孢杆菌细胞包膜中发现的PBP4a必需蛋白之间相互作用的分子对接分析。
图8展示了DBD-CP处理小米粉中革兰氏阳性芽孢杆菌细胞灭活的可能机制。
【数据】Log-linear k值：0.039 ± 0.006→0.101 ± 0.009 min⁻¹（10→20 kV）；Membre s值：3.398 ± 0.347→2.631 ± 0.663；Membre t_m值：16.419 ± 0.276→12.023 ± 1.192 min；Weibull D值：16.460 ± 0.366→10.817 ± 0.508 min；Weibull p值：2.619 ± 0.25→1.67 ± 0.270；Weibull R²：0.994（10 kV）、0.978（15 kV）、0.957（20 kV）；Membre R²：0.989（10 kV）、0.969（15 kV）；Log-linear R²：0.792（10 kV）、0.949（15 kV）；RMSE：0.013、0.03、0.076；SSE：0.0004、0.0008、0.0058；A_f：1.022、1.049、1.106
讨论与解读
本研究证实DBD-CP作为非热技术灭活小米粉中枯草芽孢杆菌的潜力，对干食品加工和谷物制品去污具有实际意义。活性物种定量、分子对接和FTIR分析提供的机制证据确认，等离子体产生的活性物种通过氧化损伤细菌细胞壁和蛋白质。尽管基质效应限制了面粉中的微生物灭活效果，冷等离子体处理与补充屏障技术（如水分调节、温和有机酸处理、气调包装、低强度热或微波处理、熏蒸）整合时，在工业应用中具有前景。这些发现支持开发基于冷等离子体的干食品保藏策略，在保持产品质量的同时实现微生物控制。未来工作应侧重于工艺优化以保持面粉品质，并验证复杂食品基质中腐败菌和病原菌（包括孢子）的实际灭活效果。
编译者解读：该研究在方法学上的亮点在于将灭活动力学建模与分子机制解析相结合——Weibull模型的系统比较筛选为干粉类食品的等离子体杀菌工艺设计提供了定量工具，而分子对接揭示的ROS-PBP4a相互作用则从蛋白氧化损伤角度解释了细胞壁破坏的分子基础。值得注意的是，小米粉基质中仅0.79 log的灭活量提示，在低水分复杂食品基质中实现有效杀菌仍需依赖多技术联用策略。从合成生物学视角看，若能将等离子体处理与工程化抗菌蛋白或多肽协同使用，或通过代谢工程增强产孢缺陷菌株的敏感性，有望突破低水分食品杀菌效率瓶颈。该研究为谷物加工行业提供了一条无需加热、无需化学添加剂的绿色杀菌路径，但工业化放大中的均匀性问题和面粉品质保持仍需进一步探索。
参考来源
Kaur, J. (2026). Mechanistic insights of cold plasma inactivation of Bacillus subtilis in little millet (Panicum sumatrense) flour. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2026. DOI: 10.1016/j.ifset.2026.104728
DOI: 10.1016/j.ifset.2026.104728