来源：Insights into the mechanism of enhanced tetramethylpyrazine production in dehulled adlay fermented by Bacillus subtilis BJ3–2（Food Research International）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
四甲基吡嗪（TTMP）是发酵食品中重要的生物活性生物碱和特征风味化合物。本研究以去壳薏苡（BDA）和黄豆（BSB）为底物，比较蜡样芽孢杆菌BJ3–2在两体系中的发酵特性、基因转录和蛋白表达差异。结果显示，BDA体系中TTMP产量达6.11 mg/g干重，较BSB体系提高360倍。通过转录组与蛋白质组联合分析，研究揭示了底物差异驱动acetoin高效合成与降解抑制的分子机制，为TTMP的靶向生物合成提供了理论依据。
研究背景
TTMP又称川芎嗪，是源自传统中药川芎的主要生物活性生物碱，具有血管扩张、改善微循环和抗血小板聚集等药理活性，对心血管疾病防治具有重要价值。作为一种含氮杂环吡嗪化合物，TTMP也是豆豉、食醋和中国白酒等传统发酵食品的特征风味成分。近年来，随着天然食品添加剂和功能性发酵产品需求的增长，TTMP的生物合成受到广泛关注——这一合成方式安全且环境友好。因此，阐明微生物高效合成TTMP的代谢调控机制，对提升发酵食品品质和开发新型功能性发酵产品具有重要意义。已有研究从纳豆中分离出TTMP，并首次证明纳豆芽孢杆菌能够产生TTMP。此后，多种微生物被证实具有TTMP合成能力。然而，底物如何影响微生物的TTMP合成效率、其背后的分子调控机制仍不清楚。本研究以去壳薏苡为底物，通过多组学手段解析蜡样芽孢杆菌BJ3–2高产TTMP的机制。
研究方法
2.1 材料与试剂
去壳薏苡购自贵州仁信农业开发有限公司（中国贵州）。黄豆（黔州9号）购自当地超市。色谱级甲醇、acetoin和TTMP购自Sigma Chemical Co.（美国密苏里州圣路易斯）。RNAiso PLUS、PrimeScript™ RT Reagent Kit和SYBR Green Realtime PCR Master Mix购自TAKARA Bio Inc.（日本）。其他化学品和试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司（中国江苏苏州）。
2.2 样品制备
蜡样芽孢杆菌BJ3–2（专利号201110023795.4）由贵州大学生命科学学院吴博士惠赠。BDA和BSB发酵样品按照Wen等（2023）描述的方法制备，分别命名为BDA组和BSB组。样品每4小时间隔采集，真空冷冻干燥，研磨过60目筛，−20°C保存备用。蜡样芽孢杆菌BJ3–2在相同条件下分别发酵去壳薏苡（BDA）和黄豆（BSB）。简要流程如下：将30 g去壳薏苡或黄豆置于300 mL锥形瓶中，种子经洗涤后于去离子水中浸泡过夜。用去离子水调整料液比为1:1.6（v/m），密封后于121°C灭菌30 min。冷却至室温后，每底物接种9%（v/m）的蜡样芽孢杆菌BJ3–2种子培养液，于40°C培养48 h。
【数据】底物量：30 g；料液比：1:1.6（v/m）；灭菌条件：121°C、30 min；接种量：9%（v/m）；培养温度：40°C；培养时间：48 h
2.3 分析方法
#### 2.3.1 理化性质测定
活菌计数：每个未干燥发酵样品与10 mL无菌蒸馏水在试管中混合并涡旋。将适宜稀释度的上清液涂布于LB琼脂平板（三重复），37°C培养20 h后计数，活菌浓度以每克菌落形成单位（CFU/g）表示。样品pH使用pH计（上海佑科仪器有限公司，中国上海）测定。游离氨基酸含量按照Yang等（2025）的方法测定：从0.5 g干燥粉末中用50 mL 0.01 mol/L盐酸溶液超声提取30 min，提取液经Whatman No.4滤纸过滤，滤液用0.01 mol/L盐酸溶液定容至50 mL。取5 mL滤液于离心管中，加入5 mL 8%（w/v）磺基水杨酸溶液，充分涡旋混匀，静置15 min后于7080g离心10 min。上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，最终滤液用自动氨基酸分析仪测定游离氨基酸含量。铵浓度按照Wen等（2023）的方法测定：1.00 g发酵样品与10 mL 20% NaOH溶液混合，振荡30 min，8000g离心10 min，收集上清液于4°C保存备用。铵浓度采用水杨酸盐法，用分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司，中国上海）测定。四甲基吡嗪和acetoin按照Wen等（2020）的方法分析：3.0 g样品粉末用15 mL 80%乙醇超声提取30 min，4000g离心15 min，收集上清液，残渣再提取两次。三次上清液合并后用80%乙醇定容至50 mL。溶液经0.45 μm滤膜过滤后进行HPLC分析。色谱分离采用Phecda-C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），柱温45°C，流动相为水相（1%乙酸和0.05%三氟乙酸，pH 2.5）和甲醇（70:30，v/v），流速0.8 mL/min，检测波长297 nm，进样量20 μL。
【数据】活菌计数培养基：LB琼脂；培养条件：37°C、20 h；游离氨基酸提取：0.5 g样品+50 mL 0.01 mol/L HCl、超声30 min；磺基水杨酸浓度：8%（w/v）；离心：7080g、10 min；铵测定：1.00 g样品+10 mL 20% NaOH、振荡30 min、8000g离心10 min；TTMP/acetoin提取：3.0 g样品+15 mL 80%乙醇、超声30 min、4000g离心15 min；HPLC条件：Phecda-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、45°C、流速0.8 mL/min、检测波长297 nm、进样量20 μL
#### 2.3.2 转录组分析
BDA组在4 h、24 h和32 h采集30 g样品，BSB组在4 h、16 h和24 h采集30 g样品。每个发酵样品与30 mL无菌生理盐水混合，涡旋1 min，经8层无菌纱布过滤。滤液于4°C、10195g离心10 min，收集菌体转移至冻存管中，立即于液氮中速冻。总RNA使用TRlzol试剂盒（天根生物技术有限公司，中国北京）提取。RNA纯度用NanoDrop 2000分光光度计（IMPLEN，美国加利福尼亚）评估。RNA片段长度用Agilent 2100（Agilent Technologies，美国加利福尼亚）分析。质量验证后，通过核糖体RNA去除富集mRNA。富集的mRNA用片段化缓冲液打断，以随机六聚体引物和反转录酶合成第一链cDNA。随后用缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶I合成第二链cDNA。双链cDNA用AMPure XP磁珠纯化，随后进行末端修复、加A尾和接头连接。用AMPure XP磁珠进行片段大小选择，通过PCR扩增构建cDNA文库。文库质控后，根据有效浓度和所需数据量合并文库，最后在Illumina HiSeq 4000平台上以PE150双端测序策略进行测序。原始读段用fastp软件过滤。干净读段用Bowtie2比对到参考基因组。BDA与BSB组间差异表达分析用DESeq2 R包（版本1.20.0）进行。表达变化至少2倍（FC）且校正后P值≤0.001的基因定义为差异表达基因（DEGs）。基因本体（GO）富集分析用GOseq R包进行，京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析用KOBAS软件进行。
【数据】样品量：30 g；离心：10195g、10 min、4°C；DEGs筛选阈值：FC≥2、校正P≤0.001；测序平台：Illumina HiSeq 4000、PE150
#### 2.3.3 蛋白质组分析
将−80°C保存的30 g样品在液氮中研磨，然后用4倍体积（v/w）含10 mM DTT和1%蛋白酶抑制剂混合物的苯酚提取缓冲液进行超声裂解。加入等体积Tris饱和苯酚，混合物于4°C、2107g离心10 min。收集上层苯酚相后，加入5倍体积的0.1 M乙酸铵甲醇溶液，于−20°C沉淀过夜。所得蛋白质沉淀依次用甲醇和丙酮洗涤，然后用8 M尿素溶解。蛋白质浓度用BCA法测定。蛋白质溶液用5 mM DTT于56°C还原30 min，用11 mM碘乙酰胺于室温避光烷基化15 min，尿素浓度稀释至2 M以下。按质量比（酶:蛋白=1:50）加入胰蛋白酶，于37°C酶解过夜，随后补加胰蛋白酶（1:100）进行第二次4 h酶解。所得肽段用Strata X C18柱脱盐，真空干燥后用0.5 M TEAB溶解。肽段按照制造商说明书用TMT试剂标记（室温，2 h），标记样品混合、脱盐、干燥。TMT标记肽段混合物用Agilent 300Extend C18色谱柱（4.6 × 250 mm，5 μm）进行高pH反相色谱分级。肽段用8%–32%乙腈（pH 9）梯度洗脱60 min。收集60个馏分，合并为18个最终馏分。
【数据】样品量：30 g；DTT浓度：10 mM、5 mM；碘乙酰胺浓度：11 mM；酶:蛋白比：1:50（过夜）、1:100（4 h）；TMT标记：室温、2 h；分级梯度：8%–32%乙腈（pH 9）、60 min；馏分数：60收集、18合并
研究结果
3.1 蜡样芽孢杆菌BJ3–2发酵去壳薏苡产TTMP关键时间点的鉴定
为鉴定蜡样芽孢杆菌BJ3–2发酵去壳薏苡过程中TTMP产生的关键时间点，系统研究了发酵过程中细胞生长、pH、前体物质和TTMP的动态变化。BDA组中，细菌细胞经过短暂延滞期后迅速进入对数生长期，24 h后达到最大细胞密度，随后经历短暂稳定期和衰亡期（图1A）。BSB组中，细胞生长更快，16 h后达到峰值，最大活菌数达2.09 × 10⁸ CFU/g。BDA组pH先下降至16 h的5.19，随后上升并稳定在约5.80。相比之下，BSB组pH在8 h后降至6.14，随后持续上升并稳定在约7.80（图1B）。随着发酵进行，两种底物中总游离氨基酸含量逐渐增加。发酵48 h时，BDA和BSB中总游离氨基酸含量分别为4.68 g/100 g和6.50 g/100 g（图1C-D）。异亮氨酸（1.53 g/100 g）和亮氨酸（0.61 g/100 g）是BDA中的主要游离氨基酸，而谷氨酸（1.34 g/100 g）和丙氨酸（0.86 g/100 g）是BSB中的主要游离氨基酸。铵和acetoin含量在发酵过程中持续增加（图1E和F）。整个发酵过程中，BSB中的铵含量高于BDA。发酵结束时，BSB和BDA中的铵含量分别达到10.93 mg/g DW和3.20 mg/g DW。发酵前20 h，BSB中acetoin含量相对较高，而BDA中保持较低水平。20 h后，BDA中acetoin迅速积累，48 h时达到108.82 mg/g DW，是BSB的2.19倍。同时，BSB中TTMP含量在12 h时达到峰值0.079 mg/g DW，随后逐渐下降并维持在低水平。相比之下，BDA中TTMP在20 h后急剧增加，32 h后达到相对较高水平（图1G）。48 h时，BDA中TTMP产量约为BSB的360倍。基于观察到的细菌生长、pH变化以及前体和TTMP积累模式，选定了反映细菌生长特性和目标产物合成关键阶段的时间点。BDA体系选择3个时间点（4 h、24 h和32 h）。BSB体系选择的时间点为4 h、16 h和24 h。这些时间点采集的发酵样品用于后续转录组分析，以阐明TTMP合成通路中关键基因的表达与调控。
【数据】BDA最大细胞密度时间：24 h；BSB最大活菌数：2.09 × 10⁸ CFU/g（16 h）；BDA最低pH：5.19（16 h）；BSB最低pH：6.14（8 h）；BDA最终pH：约5.80；BSB最终pH：约7.80；BDA总游离氨基酸：4.68 g/100 g（48 h）；BSB总游离氨基酸：6.50 g/100 g（48 h）；BDA主要游离氨基酸：异亮氨酸1.53 g/100 g、亮氨酸0.61 g/100 g；BSB主要游离氨基酸：谷氨酸1.34 g/100 g、丙氨酸0.86 g/100 g；BDA铵含量：3.20 mg/g DW（48 h）；BSB铵含量：10.93 mg/g DW（48 h）；BDA acetoin：108.82 mg/g DW（48 h）；BSB acetoin峰值：0.079 mg/g DW（12 h）；TTMP产量比：BDA约为BSB的360倍
3.2 发酵过程中的转录组分析
所有样品的RNA完整性数值（RIN）≥6.0（补充表S1），表明RNA完整性高。所有测序读段的Q20值范围为86.43%至98.78%，Q30值范围为89.41%至96.20%。错误率在0.01%至0.02%之间，表明转录组数据质量高。以表达变化≥2倍且校正后P值≤0.001为阈值筛选的差异表达基因（DEGs）数量见图2A。BDA4-vs-BSB4比较中鉴定出469个DEGs，包括233个上调基因和236个下调基因。BDA24-vs-BSB16中检测到827个DEGs，包括433个上调基因和394个下调基因。BDA32-vs-BSB24比较中，观察到1247个DEGs，包括482个上调基因和765个下调基因。此外，对共同上调或下调基因进行了GO分析（图2B–2D）。BDA4-vs-BSB4比较中，DEGs主要富集于细胞（GO:0005623）、细胞部分（GO:0009987）、膜（GO:0016020）、转运（GO:0006810）、定位建立（GO:0051234）和定位（GO:0051179）等GO条目。BDA24-vs-BSB16比较中，DEGs主要涉及定位建立（GO:0051234）、定位（GO:0051179）、转运（GO:0006810）、转运体活性（GO:0005215）和氧化还原酶活性（GO:0016491）。BDA32-vs-BSB24比较中，DEGs主要与分子功能（GO:0003674）、定位（GO:0051179）、转运（GO:0006810）、定位建立（GO:0051234）和杂环代谢过程（GO:0046483）相关。这些结果表明，发酵4 h后，去壳薏苡底物中的蜡样芽孢杆菌BJ3–2主要参与营养摄取和细胞合成相关活动。24 h后，菌株进入活跃代谢阶段，其特征为快速底物摄取、精确代谢物分配和定向分泌。值得注意的是，32 h后，蜡样芽孢杆菌BJ3–2处于吡嗪和呋喃等杂环代谢物合成或降解的动态调控阶段。与BSB4相比，BDA4显示出多个显著富集的KEGG通路（P < 0.05），包括嘌呤代谢、ABC转运体、柠檬酸循环、糖酵解/糖异生、硫代谢、精氨酸生物合成、C5支链二元酸代谢、缬氨酸/亮氨酸和异亮氨酸生物合成、氨基酸生物合成、2-含氧羧酸代谢和氮代谢（图2E和F）。其中，嘌呤代谢、ABC转运体、柠檬酸循环和糖酵解/糖异生上调，表明此时蜡样芽孢杆菌BJ3–2主要增强碳源分解和能量捕获以支持细胞增殖。与BSB16相比，BDA24显示出显著富集（P < 0.05）的KEGG通路，包括C5支链二元酸代谢、缬氨酸/亮氨酸和异亮氨酸代谢、2-含氧羧酸代谢、氨基酸生物合成、氮代谢和精氨酸生物合成（图2G和H）。值得注意的是，C5支链二元酸代谢、缬氨酸/亮氨酸和异亮氨酸生物合成、2-含氧羧酸代谢、氨基酸生物合成、精氨酸生物合成以及苯丙氨酸/酪氨酸和色氨酸生物合成等通路上调，表明大量氨基酸合成为蛋白质、酶和其他生物分子的构建提供了底物。作为连接糖酵解与三羧酸循环的关键中间体，2-含氧羧酸代谢通量的增强直接提高了碳源利用率。重要的是，C5支链二元酸代谢作为acetoin合成的主要途径之一，为TTMP生物合成提供了充足前体。此外，与BSB24相比，BDA32在柠檬酸循环、糖酵解/糖异生、氮代谢、肌醇磷酸代谢、ABC转运体、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢等通路中表现出显著富集（P < 0.05）（图2I和J）。其中，上调的氮代谢通路为TTMP生物合成提供了充足的铵前体。
【数据】RIN值：≥6.0；Q20：86.43%–98.78%；Q30：89.41%–96.20%；错误率：0.01%–0.02%；BDA4-vs-BSB4：469个DEGs（233上调/236下调）；BDA24-vs-BSB16：827个DEGs（433上调/394下调）；BDA32-vs-BSB24：1247个DEGs（482上调/765下调）；DEGs筛选阈值：FC≥2、校正P≤0.001
3.3 发酵过程中的蛋白质组分析
在比较转录组分析中，发酵4 h后蜡样芽孢杆菌富集的KEGG通路主要与初始细胞生长和增殖相关。因此，研究聚焦于目标产物TTMP生物合成对应的关键时间点。约83%的肽段得分在70以上，表明鉴定质量理想（图3A）。大多数肽段的氨基酸数量范围为7至17个，蛋白质数量随肽段长度增加而减少（图3B）。鉴定蛋白质的分子量范围为4.30至406.81 kDa，其中4.30至80 kDa的蛋白质约占96%。30至40 kDa的蛋白质丰度最高。
【数据】肽段得分>70比例：约83%；肽段长度：7–17个氨基酸；蛋白质分子量范围：4.30–406.81 kDa；4.30–80 kDa蛋白质占比：约96%
3.4 差异表达蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析及关键蛋白分子对接
蛋白质-蛋白质相互作用网络分析揭示了差异表达蛋白之间的功能关联（图4A）。分子对接分析显示，α-乙酰乳酸脱羧酶（alsD）与乙酰羟酸合酶（ilvBH）之间存在紧密的相互作用界面（图4B），表明两者可能形成代谢通道复合物，从而高效介导acetoin的合成。这种空间上的邻近排布能够实现底物的直接传递，避免中间产物扩散损失，提高代谢通量效率。
【数据】相互作用蛋白对：alsD-ilvBH；对接分析：显示紧密相互作用界面
3.5 转录组和蛋白质组数据验证
为验证转录组和蛋白质组数据的可靠性，采用qRT-PCR对DEGs进行验证，采用平行反应监测（PRM）对差异表达蛋白进行验证（图5）。qRT-PCR验证结果与转录组测序数据趋势一致（图5A–C），PRM验证结果与TMT定量结果一致（图5D），表明转录组和蛋白质组数据可靠。
【数据】qRT-PCR验证：与转录组数据趋势一致；PRM验证：与TMT定量结果一致
3.6 TTMP生物合成代谢调控机制
基于上述多组学分析结果，研究提出了TTMP生物合成的代谢调控机制模型（图6）。该模型整合了糖酵解、丙酮酸代谢、三羧酸循环、支链氨基酸代谢和氮代谢通路。蓝色表示下调的基因/蛋白质，红色表示上调的基因/蛋白质。在去壳薏苡底物中，alsSD和ilvBH基因及其编码蛋白显著上调，促进了acetoin的合成；同时，乙酰脱氢酶复合物（acoABCL）下调抑制了acetoin的降解。氮代谢通路的转录增强保证了充足的铵供应。三方面因素共同作用，实现了TTMP的高效积累。
【数据】上调基因/蛋白：alsSD、ilvBH；下调基因/蛋白：acoABCL；上调通路：氮代谢
讨论与解读
本研究系统比较了蜡样芽孢杆菌BJ3–2在去壳薏苡和黄豆两种底物中的发酵特性，通过整合转录组和蛋白质组分析，阐明了去壳薏苡底物中TTMP高产的内在机制。BDA体系中TTMP含量达6.11 mg/g DW，较BSB体系提高360倍。多组学联合分析揭示了大量参与C5支链二元酸代谢、2-含氧羧酸代谢、缬氨酸/亮氨酸和异亮氨酸生物合成、柠檬酸循环和糖酵解/糖异生途径的候选转录本和蛋白质。该研究为蜡样芽孢杆菌发酵体系中TTMP生物合成的调控网络提供了新见解。未来研究将探讨乙酰乳酸合酶和脱羧酶是否形成代谢通道复合物，并阐明亮氨酸反馈激活乙酰乳酸脱羧酶的信号转导机制。
编译者解读：该研究的亮点在于将底物差异这一传统发酵变量与多组学手段深度结合，揭示了"底物—基因表达—代谢通量—产物积累"的完整因果链。特别值得关注的是，通过分子对接预测alsD与ilvBH形成代谢通道复合物，为代谢途径的空间组织提供了新视角——这提示合成生物学设计可从酶的空间邻近性入手提升通路效率。不足之处在于，代谢通道复合物的形成尚停留在计算预测层面，缺乏体内交联或体外动力学验证。此外，铵含量在BSB中更高而TTMP产量反而更低，说明前体供应并非唯一限制因素，acetoin的合成与降解平衡才是关键调控节点。这一发现对理性设计高产TTMP细胞工厂具有直接指导意义。
参考来源
Ma Y. Insights into the mechanism of enhanced tetramethylpyrazine production in dehulled adlay fermented by Bacillus subtilis BJ3–2. Food Research International, 2026. DOI: 10.1016/j.foodres.2026.120080
DOI: 10.1016/j.foodres.2026.120080