来源：Rewiring energy homeostasis in Yarrowia lipolytica enables efficient terpenoid biosynthesis（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是萜类化合物生物合成的重要细胞工厂，但其严格的代谢网络调控常将碳流导向固有代谢物溢出，限制目标产物合成效率。本研究通过引入非氧化糖酵解（NOG）途径并敲除磷酸果糖激酶，重构中心碳代谢以增强乙酰-CoA供应，再经适应性实验室进化（ALE）恢复细胞生长。多组学分析与通量平衡分析揭示，碳代谢抑制因子Reg1与葡萄糖激酶Glk1的同步失活通过激活Snf1激酶介导的碳信号通路并平衡混合糖酵解与三羧酸循环之间的通量，重建了细胞能量稳态。最终通过代谢工程与发酵设计，β-法尼烯产量达到82.1 g/L，为解脂耶氏酵母中萜类化合物的最高报道产量。
研究背景
微生物细胞工厂通常通过构建目标化学品的生物合成途径来赋予细胞生产能力。然而，代谢网络的固有鲁棒性使细胞能够抵抗资源向非天然方向的流动，这给高效细胞工厂的构建带来极大挑战。非常规酵母解脂耶氏酵母因其广泛的底物利用能力和高效的乙酰-CoA及NADPH供应能力，在萜类生物合成中展现出独特潜力，已被广泛用于生产柠檬烯、β-法尼烯、角鲨烯和β-胡萝卜素等多种萜类化合物，其中β-法尼烯的最高报道产量为53.4 g/L。β-法尼烯是一种无环倍半萜，不仅是维生素E等高价值生物产品的关键中间体，其氢化衍生物法尼烷也因其优异的燃烧效率和环境友好特性而成为有前景的生物燃料候选物。然而，β-法尼烯及其他萜类化合物的过量生产常受酵母固有代谢调控的限制。
研究方法
2.1 培养基与培养条件
培养解脂耶氏酵母所用培养基包括：YPD培养基（含20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨和10 g/L酵母提取物）；合成葡萄糖（SD）基本培养基（含20 g/L葡萄糖、1.7 g/L酵母氮源碱、5 g/L (NH4)2SO4，根据菌株的营养缺陷特性选择性添加氨基酸混合物）；酵母提取物蛋白胨葡萄糖-油酸（YPDO）培养基（含葡萄糖和油酸作为混合碳源，20 g/L蛋白胨和10 g/L酵母提取物）。将解脂耶氏酵母单菌落接种至2 mL液体培养基中，于30°C、220 rpm条件下培养24小时。随后以2%（v/v）接种量转接至含50 mL新鲜液体培养基的300 mL摇瓶中，在相同温度和转速条件下培养。每24小时取样一次，用于后续生理和代谢指标分析。对于大肠杆菌DH5α菌株，使用添加50 mg/L氨苄青霉素的LB培养基（10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl），于37°C、220 rpm振荡过夜培养，用于常规质粒构建。
【数据】葡萄糖：20 g/L；蛋白胨：20 g/L；酵母提取物：10 g/L；温度：30°C；转速：220 rpm；时间：24h；接种量：2%（v/v）；氨苄青霉素：50 mg/L
2.2 菌株与质粒构建
本研究所用菌株和质粒列于表S1和S2，引物序列列于表S3。所有异源基因均根据解脂耶氏酵母的密码子使用偏好进行密码子优化，并由安徽通用生物有限公司合成。基因删除时，使用CHOPCHOP网络工具（https://chopchop.cbu.uib.no/）设计靶向特定基因位点的20 bp向导RNA（gRNA）序列。删除操作使用pCASyl系统，这是针对解脂耶氏酵母优化的CRISPR-Cas9基因组编辑工具。基因表达时，将基因组装至pKi-1（pUT8启动子、CYC1t终止子、leu2标记）或JMP-hyg（pGPD启动子、XPR2t终止子、hyg标记）等载体中。所得重组载体经限制性酶切线性化，再通过醋酸锂法转化至感受态细胞中。这些片段随机整合至基因组中。通过在选择性培养基上平板筛选阳性克隆，并经菌落PCR进一步确认。所有表达盒的详细信息列于表S2。
【数据】gRNA长度：20 bp；转化方法：醋酸锂法；标记基因：leu2、hyg；启动子：pUT8、pGPD；终止子：CYC1t、XPR2t
2.3 适应性实验室进化
适应性实验室进化在四个独立平行系中进行。菌株首先在添加0.1%甘油的葡萄糖基本培养基中培养。过夜培养后，以初始OD600约为0.1转接至等体积的新鲜葡萄糖基本培养基中。随后，每3–4天在葡萄糖基本培养基中进行连续传代培养，当OD600达到1–2时进行转接。培养45天后，从每个摇瓶中选取菌落分析生长特性。
【数据】甘油：0.1%；初始OD600：~0.1；传代OD600：1–2；传代间隔：3–4天；总时长：45天
2.4 基因组重测序
将EAVKΔpfk-XP和四个进化菌株在YPD培养基中培养至对数中期后收集细胞。提取基因组DNA，进行片段化，随后进行末端修复和加A尾处理。通过互补连接将含索引的接头连接至粘性末端。使用磁珠法进行特定长度片段的筛选，随后进行PCR扩增以构建带索引的测序文库。使用Illumina HiSeq/Nova平台进行2 × 150 bp双端测序。原始数据使用fastp（v0.23.0）进行质量控制和过滤，去除接头和污染序列。清洗后的数据使用Sentieon bwa比对至参考基因组，随后用Sentieon去除PCR重复。随后计算测序深度、覆盖率、单核苷酸变异（SNVs）和插入/缺失（InDels）。最后使用Annovar对SNVs和InDels进行功能注释。基因组测序由苏州安升达生命科学有限公司完成。
【数据】测序平台：Illumina HiSeq/Nova；测序模式：2 × 150 bp双端；比对软件：Sentieon bwa；变异注释：Annovar
2.5 转录组分析
将EAVKΔpfk-XP和进化菌株ALE-XP-2在YPD培养基中培养至对数中期。使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA。使用VAHTS Universal V5 RNA-seq文库制备试剂盒构建文库，并由上海欧易生物技术有限公司在Illumina NovaSeq 6000平台进行150 bp双端测序。原始测序数据使用fastp过滤以获得干净读数，通过HISAT2比对至参考基因组。使用HTSeq-count定量基因表达水平。使用DESeq2进行差异表达分析。使用超几何分布算法对差异表达基因（DEGs）进行GO和KEGG通路富集分析。显著富集的条目使用R语言可视化。转录组分析采用三个独立生物学重复。
【数据】测序平台：Illumina NovaSeq 6000；读长：150 bp双端；比对软件：HISAT2；定量工具：HTSeq-count；差异分析：DESeq2；生物学重复：3
2.6 靶向代谢组学分析
将菌株EAVK、EAVKΔpfk-XP和ALE-XP-2在YPD培养基中培养至对数中期，离心收集细胞，立即在液氮中淬灭，设三个独立生物学重复。在4°C解冻后，将细胞与预冷的甲醇/乙腈（1:1，v/v）和同位素标记内标混合。经超声破碎和离心后，取上清过滤，按2:1分成两份：较大一份在氮气下干燥，用50%乙腈复溶，离心后直接分析；较小一份在氮气下干燥，用含3-NPH/EDC的甲醇在室温下衍生化，离心后取上清分析。分析使用LC-30AD超高效液相色谱系统，配备C18柱和Amide柱进行分离。质谱检测使用6500+ QTRAP质谱仪（SCIEX）。代谢物浓度使用Multiquant 3.0.2软件计算。靶向代谢组学分析由上海鹿明生物科技有限公司完成。
【数据】淬灭方式：液氮；提取溶剂：甲醇/乙腈（1:1，v/v）；衍生化试剂：3-NPH/EDC；色谱柱：C18柱、Amide柱；质谱仪：6500+ QTRAP（SCIEX）
2.7 通量平衡分析
通量平衡分析（FBA）用于模拟通量分布。基于解脂耶氏酵母基因组规模代谢模型iYali4，使用GECKO 3.0框架成功构建了酶约束代谢模型。对于EVAK和EP2-9菌株，根据基因型特征调整模型参数。为用生理数据约束模型，测定了菌株在合成基本培养基中的生长和关键代谢参数，用于约束相关交换反应速率。为获得生理相关的代谢通量分布，使用RAVEN 2.10.3分两步进行模拟。首先，在约束条件下最小化总酶使用量。随后，在模拟总酶使用量固定的情况下，使用pFBA算法进行通量计算以最小化葡萄糖摄取。所得代谢通量用于后续分析。
【数据】代谢模型：iYali4；框架：GECKO 3.0；模拟工具：RAVEN 2.10.3；算法：pFBA
2.8 2-脱氧葡萄糖抗性生长测定
将菌株在含2%葡萄糖的基本培养基中过夜培养，然后稀释至OD600约为1。将培养物以十倍梯度稀释后点样于含2%蔗糖/半乳糖/麦芽糖/果糖和200 μg/mL 2-脱氧葡萄糖的基本培养基上。对照组平板不含2-脱氧葡萄糖。所有平板在30°C培养2天。
【数据】葡萄糖：2%；2-脱氧葡萄糖：200 μg/mL；稀释梯度：十倍；温度：30°C；时间：2天
2.9 摇瓶培养生产β-法尼烯
菌株在2 mL YPD培养基中预培养，于30°C、220 rpm振荡培养24小时。以2%（v/v）接种量转接至含50 mL YPD培养基的300 mL摇瓶中，于30°C、220 rpm培养96小时。收集样品分析生物量（OD600）和葡萄糖消耗。
【数据】温度：30°C；转速：220 rpm；预培养时间：24h；培养时间：96h；接种量：2%（v/v）；培养基体积：50 mL
研究结果
3.1 重构中心碳代谢构建非氧化糖酵解依赖的β-法尼烯生产菌株
磷酸酮醇酶可不可逆地将木酮糖-5-磷酸（X5P）或果糖-6-磷酸（F6P）分别裂解为乙酰磷酸（AcP）和甘油醛-3-磷酸或赤藓糖-4-磷酸，且无碳损失。AcP可被磷酸转乙酰酶在无能量输入的条件下转化为乙酰-CoA。这一特性使非氧化糖酵解（NOG）途径在生产乙酰-CoA衍生化合物方面极具吸引力。为增强解脂耶氏酵母中流向乙酰-CoA的代谢通量并提高β-法尼烯合成效率，我们构建了β-法尼烯合成途径，并通过阻断糖酵解和引入NOG途径来重构中心碳代谢（图1a）。
我们前期研究表明，β-法尼烯合成酶突变体AanFSK197T/F180H的比活力比AanFS高54.4%（108.1 nmol/h/mg蛋白 vs. 70.1 nmol/h/mg蛋白），使β-法尼烯产量提高283.8%。因此，我们将AanFSK197T/F180H与FPP合酶（ERG20）融合，并在解脂耶氏酵母中表达该融合蛋白。工程菌株EA产生0.124 g/L β-法尼烯（图1b）。EfMvaE是一种双功能酶，既催化乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA，又催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸。EfMvaS基因编码HMG-CoA合酶。研究表明，突变体EfmvaSA110G可提高酶反应速率并增强大肠杆菌中的萜烯生物合成。因此，我们引入了来自粪肠球菌的EfMvaE和EfmvaS A110G。这一改造使β-法尼烯产量提高至0.45 g/L（图1b）。为进一步优化途径，我们比较了来自梅氏甲烷八叠球菌（MmMK）、刚毛甲烷鬃菌（McMK）和肺炎链球菌（SpMK）的甲羟戊酸激酶。MmMK在提高β-法尼烯产量方面表现更优（图S1）。因此，我们在工程菌株EAVK中表达MmMK，β-法尼烯滴度达到0.55 g/L（图1b）。
NOG途径可将碳流导向乙酰-CoA。为构建该途径，我们在产β-法尼烯菌株中删除了内源磷酸果糖激酶（Pfk1），并引入磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶。磷酸果糖激酶在糖酵解中起关键作用，PFK1是解脂耶氏酵母中唯一的磷酸果糖激酶编码基因。PFK1的破坏使菌株在葡萄糖基本培养基中完全无法生长，在YPD培养基中生长也受到严重抑制（图1c）。这是因为PFK1破坏导致糖酵解途径中断，引起严重的能量缺乏。虽然磷酸戊糖途径（PPP）与下游糖酵解结合可以补充ATP，但其能力不足以维持生长。随后，我们在EAVKΔpfk菌株中表达了来自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶（xPK）和来自解糖热厌氧杆菌的磷酸转乙酰酶（PTA），构建工程菌株EAVKΔpfk-XP。然而，生长仅得到轻微恢复（图1d）。这表明在解脂耶氏酵母中直接将Embden-Meyerhof-Parnas（EMP）途径与NOG途径嫁接无法支持稳健生长。因此，我们采用适应性实验室进化（ALE）来改善菌株生长。
【数据】AanFSK197T/F180H比活力：108.1 nmol/h/mg蛋白；AanFS比活力：70.1 nmol/h/mg蛋白；比活力提高：54.4%；产量提高：283.8%；菌株EA产量：0.124 g/L；引入EfMvaE/EfmvaS A110G后：0.45 g/L；引入MmMK后：0.55 g/L
3.2 适应性实验室进化恢复细胞生长
对菌株EAVK∆pfk-XP进行适应性实验室进化以恢复其在葡萄糖上的生长。四个独立组在葡萄糖基本培养基中平行传代（图2a）。经过45天（约57代）的连续传代，进化菌株表现出改善的生长。为表征其性能，我们评估了它们的生长曲线、葡萄糖消耗和产物合成。分离菌株ALE-XP-1、ALE-XP-2、ALE-XP-3和ALE-XP-4在YPD培养基中的最大比生长速率为0.160–0.185 h⁻¹，显著高于未进化菌株EAVK∆pfk-XP（0.095 h⁻¹），且接近PFK1完整的亲本菌株EAVK（0.189 h⁻¹）（图2b和图S2a）。最终生物量也高于EAVK菌株（图2c和图S2b）。与EAVK菌株相比，四个进化菌株的β-法尼烯产量提高了44–53%，柠檬酸积累降低了56–69%（图2d和e；图S2c和d）。这表明引入NOG途径减少了柠檬酸溢出并增加了β-法尼烯合成。表现最佳的变体ALE-XP-2的葡萄糖消耗降低了23%，同时β-法尼烯产率提高了106%（图2f和g；图S2e和f）。
【数据】ALE-XP-1至4最大比生长速率：0.160–0.185 h⁻¹；EAVK∆pfk-XP：0.095 h⁻¹；EAVK：0.189 h⁻¹；β-法尼烯产量提高：44–53%；柠檬酸积累降低：56–69%；葡萄糖消耗降低：23%；β-法尼烯产率提高：106%；进化时间：45天；代数：约57代
3.3 碳代谢抑制因子和葡萄糖激酶的突变对恢复细胞生长至关重要
从ALE中分离出四个克隆并进行基因组测序。四个进化菌株中共鉴定出11个突变（图3a）。YALI1_E18539g（酿酒酵母GLK1的同源基因；GLK1 333_334insT/GLK1 G59E/GLK1 L82P）是所有四个进化菌株（ALE-XP-1至4）共有的突变；YALI1_E09615g突变（酿酒酵母MIG1的同源基因；MIG1 1432delC）在菌株ALE-XP-1和ALE-XP-3中发现；YALI1_B21855g突变（酿酒酵母REG1的同源基因；REG1 R429⁎/REG1 R153Q）在菌株ALE-XP-2和ALE-XP-4中发现。GLK1、MIG1和REG1中鉴定出无义或移码突变，表明这些突变导致功能丧失。
为验证这一点，我们在EAVK∆pfk-XP菌株中分别删除这些基因，并评估突变体在YPD培养基中的表型。MIG1或REG1的单独删除均可挽救PFK1缺失引起的生长缺陷。与EAVK∆pfk-XP菌株相比，Δmig1和Δreg1菌株的最终生物量分别增加了76%和89%，最大比生长速率也分别提高了94%和83%（图3c和图S3a）。Mig1是参与葡萄糖抑制的锌指转录抑制因子。MIG1缺失使葡萄糖消耗速率比PFK1缺失菌株提高3.5倍，比EAVK菌株提高51%。同时，MIG1缺失引起糖醇溢出并降低柠檬酸产量，我们观察到甘露醇和阿拉伯醇分别积累至13.7 g/L和6.8 g/L，显著高于其他菌株。Reg1是I型蛋白磷酸酶Glc7p的调节亚基，通过调节Snf1激酶活性参与葡萄糖抑制（图3b）。REG1缺失菌株的葡萄糖消耗速率比PFK1缺失菌株高118%，但比EAVK菌株低26%。REG1缺失也增加了甘露醇和阿拉伯醇的积累并降低了柠檬酸产量（图3d和g；图S3b）。甘露醇和阿拉伯醇的积累表明碳流被导向PPP。总之，通过MIG1或REG1缺失缓解葡萄糖抑制可以恢复细胞生长。
GLK1编码葡萄糖激酶，是葡萄糖代谢中催化葡萄糖磷酸化的酶（图3b）。虽然其单独缺失未能缓解生长缺陷（图3c），但GLK1与MIG1或REG1的同时缺失产生了协同效应。与MIG1单缺失菌株相比，MIG1-GLK1双缺失菌株的最终生物量增加了25%，最大比生长速率进一步提高，但葡萄糖消耗速率降低了28%。葡萄糖消耗的减少降低了副产物的积累，甘露醇和阿拉伯醇水平分别下降83%和52%。同样，REG1-GLK1双缺失菌株将生长恢复至EAVK菌株的水平。与REG1单缺失菌株相比，其葡萄糖消耗降低了45%，甘露醇和阿拉伯醇积累分别减少了34%和79%。
【数据】总突变数：11个；Δmig1生物量增加：76%；Δreg1生物量增加：89%；Δmig1比生长速率提高：94%；Δreg1比生长速率提高：83%；MIG1缺失葡萄糖消耗速率提高：3.5倍（vs Δpfk）、51%（vs EAVK）；甘露醇积累：13.7 g/L；阿拉伯醇积累：6.8 g/L；REG1缺失葡萄糖消耗速率提高：118%（vs Δpfk）、降低26%（vs EAVK）；MIG1-GLK1双缺失生物量增加：25%；葡萄糖消耗降低：28%；甘露醇降低：83%；阿拉伯醇降低：52%；REG1-GLK1双缺失葡萄糖消耗降低：45%；甘露醇降低：34%；阿拉伯醇降低：79%
讨论与解读
本研究证明，通过理性代谢工程与适应性实验室进化的结合，可以重构解脂耶氏酵母的碳和能量代谢，实现β-法尼烯的过量生产（图7）。NOG途径的引入与PFK1的破坏相结合，将乙酰-CoA的产生从柠檬酸裂解转向PPP和NOG途径，这是一条碳节约型途径。然而，PFK1的破坏导致生长缺陷，因此进行ALE以恢复细胞生长。研究发现GLK1突变与REG1或MIG1突变的组合可恢复生长缺陷并减少柠檬酸等固有代谢物的合成，同时重构细胞代谢并改变能量状态（图7）。GLK1缺失减少了葡萄糖磷酸化，但未能恢复生长，表明仅限制底物供应无法挽救代谢失衡。REG1或MIG1缺失恢复了生长并减少了柠檬酸产量，但引起了糖醇积累，说明碳代谢抑制因子的激活虽恢复了分解代谢，但过量的糖摄取加速了糖醇积累。相比之下，reg1Δglk1Δ双缺失突变菌株在显著减少副产物积累的同时表现出增强的生长。Reg1缺失突变阻止Snf1去磷酸化，导致Snf1激酶组成性激活，驱动细胞代谢向有利于产物合成的方向重塑。
编译者解读：该研究展示了合成生物学中"理性设计+适应性进化"组合策略的典范应用。通过引入NOG途径并利用ALE筛选关键突变，巧妙绕过了解脂耶氏酵母代谢网络的高度鲁棒性。尤为值得关注的是，研究发现碳代谢抑制因子Reg1与葡萄糖激酶Glk1的协同失活是恢复生长和能量稳态的关键节点，这为其他产乙酰-CoA衍生物的宿主菌株提供了可借鉴的通用代谢重塑思路。82.1 g/L的β-法尼烯产量也验证了该策略在工业规模生产中的巨大潜力。然而，菌株对特定突变组合的依赖性是否能在更大规模发酵中保持稳定，仍需进一步评估。
参考来源
Liu X. Rewiring energy homeostasis in Yarrowia lipolytica enables efficient terpenoid biosynthesis. Chemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.cej.2025.171676
DOI: 10.1016/j.cej.2025.171676