来源：Biogenic synthesis and characterization of silver nanoparticles with Bacillus subtilis and antibacterial activity against foliar bacterial pathogens of tomato（Physiological and Molecular Plant Pathology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
番茄生产日益受到细菌性病害的威胁，而抗生素和铜制杀菌剂的广泛使用引发了耐药性和环境可持续性问题。本研究利用枯草芽孢杆菌无细胞培养上清液生物合成银纳米颗粒（Bs-AgNPs），通过UV-Vis、TEM、DLS、XRD和FTIR等手段系统表征其理化性质，并评估其对三种番茄叶部病原菌的抗菌与抗生物膜活性。离体叶片和温室试验证实，160 μg mL⁻¹的Bs-AgNPs可显著降低细菌性叶斑病严重度，为传统杀菌剂提供了绿色替代方案。
研究背景
细菌性植物病原菌是全球农业的重大威胁，造成严重作物损失并影响粮食安全。单一种植模式和带菌种植材料的流通促进了病原菌的持续传播，气候变化则进一步为病原细菌的生存、进化和毒力创造了有利条件。目前，细菌性植物病害的管理严重依赖合成农用化学品，尤其是合成抗生素和铜基杀菌剂。然而，长期无节制使用已导致多重耐药菌株的出现，增加了经济损失并削弱了现有防治策略的效果。
番茄作为全球重要的园艺作物，特别易受多种细菌性病害侵染，包括革兰氏阴性菌——丁香假单胞菌番茄致病变种（细菌性斑点病）、黄单胞菌属（细菌性叶斑病），以及革兰氏阳性菌——密执安棍状杆菌密执安亚种（细菌性溃疡病）。纳米生物技术为植物病害防控提供了新方向，其中银纳米颗粒因其广谱抗菌活性而备受关注。利用微生物细胞上清液进行绿色合成，可避免化学合成法的环境风险，实现还原与稳定的一体化。
研究方法
2.1 细菌培养与培养基
枯草芽孢杆菌菌株DTBS-5、X. euvesicatoria pv. euvesicatoria、P. syringae pv. tomato和C. michiganensis subsp. michiganensis（Cmm）的培养物保存于ICAR-IARI（新德里）植物细菌学实验室并从中获取。使用的试剂包括硝酸银、LB肉汤、LB琼脂、结晶紫和氯化三苯基四氮唑（TTC）（Hi Media Thane, Maharashtra, India）。
【数据】菌株：B. subtilis DTBS-5、X. euvesicatoria pv. euvesicatoria、P. syringae pv. tomato、C. michiganensis subsp. michiganensis；试剂：硝酸银、LB肉汤、LB琼脂、结晶紫、TTC（Hi Media）
2.2 银纳米颗粒的生物合成
采用改良方案合成生物源银纳米颗粒（Bs-AgNPs）。具体步骤如下：
1. 将枯草芽孢杆菌在LB肉汤中于28 ± 1°C、120 rpm条件下培养48小时。
2. 培养物在4°C下以10,000 rpm离心5分钟，上清液经Whatman No. 1滤纸过滤，获得无细胞培养滤液。
3. 取100 mL滤液与100 mL 10 mM AgNO₃溶液（1:1，v/v）混合于500 mL锥形瓶中，在28 ± 1°C、持续振荡（120 rpm）条件下避光孵育24小时。
4. 通过颜色从淡黄色变为深棕色初步确认Bs-AgNPs的形成。
5. 以10,000 rpm离心10分钟收集纳米颗粒，用无菌蒸馏水洗涤三次以去除未反应组分，最后重新分散于无菌蒸馏水中，用于理化表征和后续抗菌试验。
【数据】培养温度：28 ± 1°C；转速：120 rpm；培养时间：48h；离心：10,000 rpm、5 min（4°C）；AgNO₃浓度：10 mM；混合比例：1:1（v/v）；孵育时间：24h；洗涤次数：3次
2.3 Bs-AgNPs的表征
Bs-AgNPs的合成首先通过反应混合物从淡黄色到深棕色的明显颜色变化来确认，表明Ag⁺离子被还原。纳米颗粒的形成进一步通过UV-Vis光谱确认，使用Thermo Scientific Evolution 201分光光度计，波长范围200–750 nm，光谱分辨率1 nm。无菌去离子水与10 mM AgNO₃溶液（1:1，v/v）的混合物作为空白对照。
形态和粒径使用JEOL 1011透射电子显微镜（JEOL Tokyo, Japan）表征，加速电压100 kV。成像前，纳米颗粒悬浮液超声处理40分钟，取一滴置于400目碳包覆铜网上，空气干燥，用2%（w/v）醋酸铀酰负染，然后在TEM下观察。
水合粒径、多分散指数（PDI）和zeta电位使用Malvern Zetasizer Ultra（Malvern Worcestershire, UK）测定。分析前，纳米颗粒悬浮液超声处理10分钟，测量在25°C下进行，背散射检测角173°。
晶体结构使用X射线衍射仪（PANalytical X'Pert PRO Powder Diffractometer, Malvern Worcestershire, UK）表征，配备Cu Kα辐射（λ = 1.5406 Å）。纳米颗粒悬浮液首先用冻干机冻干，所得粉末在2θ范围30–80°、工作电压30 kV、扫描速率3° min⁻¹条件下扫描。平均晶粒尺寸用Debye–Scherrer方程（式1）计算，结晶度指数（式2）用于评估合成纳米颗粒的结晶程度。
（式1）平均晶粒尺寸 = 0.94 × λ / (β × Cos θ)（其中λ = X射线波长，β = 半高峰宽（FWHM），θ = 布拉格角）
（式2）结晶度指数 = 结晶区面积 / 总面积（无定形+结晶）× 100
FTIR光谱使用Nicolet 6700 FTIR系统（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）进行，以鉴定参与纳米颗粒合成和稳定的官能团。干燥的Bs-AgNPs与光谱级KBr混合，压成片剂，在波数范围4000–400 cm⁻¹、分辨率4 cm⁻¹下扫描，每样品32次扫描。
【数据】UV-Vis波长范围：200–750 nm；光谱分辨率：1 nm；TEM加速电压：100 kV；超声时间：40 min（TEM前）/10 min（DLS前）；负染浓度：2%醋酸铀酰；DLS测量温度：25°C；检测角：173°；XRD 2θ范围：30–80°；电压：30 kV；扫描速率：3° min⁻¹；FTIR波数范围：4000–400 cm⁻¹；分辨率：4 cm⁻¹；扫描次数：32次/样品
2.4 MIC和MBC的测定
Bs-AgNPs对番茄叶部病原菌（X. euvesicatoria pv. euvesicatoria、P. syringae pv. tomato和C. michiganensis subsp. michiganensis）的抗菌性能通过微量稀释法在96孔板中测定MIC和MBC，遵循已发表的标准方案。具体步骤如下：
1. 将过夜培养物稀释至约10⁶ CFU/mL制备细菌悬浮液。
2. 在96孔板中，将Bs-AgNPs用100 μL LB肉汤进行系列稀释，浓度范围为2560 μg mL⁻¹至5 μg mL⁻¹。
3. 向每个孔中加入10 μL细菌悬浮液。
4. 仅含LB肉汤的孔作为无菌对照，含细菌悬浮液但不含Bs-AgNPs的孔作为生长对照。
5. 平板在28 ± 1°C孵育24小时。
6. 孵育后，向每孔加入10 μL 0.5%氯化三苯基四氮唑（TTC），再孵育30分钟。红色表示细菌活跃生长，无颜色变化的最低Bs-AgNPs浓度即视为抑制生长的MIC。
7. 为测定MBC，从每孔取10 μL划线接种于LB琼脂平板，在28 ± 1°C孵育48小时。琼脂上无可见细菌生长的最低Bs-AgNPs浓度即为MBC。
每个处理设三个独立的生物学重复。
【数据】细菌浓度：约10⁶ CFU/mL；Bs-AgNPs浓度范围：5–2560 μg mL⁻¹；孵育温度：28 ± 1°C；孵育时间：24h（MIC）/48h（MBC）；TTC浓度：0.5%；TTC孵育时间：30 min；生物学重复：3次
2.5 生物膜形成抑制
采用结晶紫法评估Bs-AgNPs对X. euvesicatoria pv. euvesicatoria、P. syringae pv. tomato和C. michiganensis subsp. michiganensis生物膜形成的抑制效果，方法参照Haney等的方案并稍作修改。96孔板的制备方法与MIC和MBC实验类似，以确保生物膜生长条件的一致性。具体步骤如下：
1. 在生长对照条件下向孔中接种病原菌培养物，用不同浓度的Bs-AgNPs处理，然后在28 ± 1°C孵育24小时以允许生物膜形成。
2. 孵育后，用蒸馏水冲洗孔三次以去除粘附细菌，留下生物膜生物量。
3. 用0.1%结晶紫染色15分钟进行生物膜检测，然后洗涤去除多余染料并空气干燥生物膜。
4. 用70%乙醇溶解结晶紫，孵育15分钟。
5. 用96孔板分光光度计读数器在595 nm处测量吸光度。
生物膜生长百分比与生长对照比较，使用以下方程（式3）：
（式3）% 生物膜生长 = (样品A₅₉₅ − SC A₅₉₅) / (GC A₅₉₅ − SC A₅₉₅) × 100
（样品A₅₉₅ = 样品孔吸光度，SC A₅₉₅ = 无菌对照孔吸光度，GC A₅₉₅ = 生长对照孔吸光度）
所有处理设三个独立的生物学重复，平均值用于统计分析。
【数据】孵育温度：28 ± 1°C；孵育时间：24h；结晶紫浓度：0.1%；染色时间：15 min；乙醇浓度：70%；溶解时间：15 min；检测波长：595 nm；生物学重复：3次
2.6 X. euvesicatoria pv. euvesicatoria离体叶片试验
离体叶片试验用于评估Bs-AgNPs对X. euvesicatoria pv. euvesicatoria的最佳浓度和病害防治效果。具体步骤如下：
1. 从两月龄番茄植株上采集新鲜叶片，用无菌水洗涤，用0.4%次氯酸钠表面消毒1分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗五次。
2. 将叶片在浓度为320 μg mL⁻¹、160 μg mL⁻¹、80 μg mL⁻¹和40 μg mL⁻¹的Bs-AgNPs溶液中浸泡30分钟。对照叶片浸泡在无菌水中。
3. 在LB肉汤中制备X. euvesicatoria pv. euvesicatoria细菌悬浮液（10⁸ CFU/mL），取100 μL该悬浮液接种到处理过的叶片上。
4. 通过比较未处理对照叶片与不同浓度处理下病原菌侵染叶片的症状严重度，进行目视评估。
【数据】叶片来源：两月龄番茄植株；次氯酸钠浓度：0.4%；消毒时间：1 min；冲洗次数：5次；Bs-AgNPs处理浓度：40、80、160、320 μg mL⁻¹；浸泡时间：30 min；细菌浓度：10⁸ CFU/mL；接种量：100 μL
研究结果
3.1 目视观察与UV-Vis光谱分析
枯草芽孢杆菌介导的银纳米颗粒（Bs-AgNPs）的胞外合成成功，首先通过反应混合物在向细菌培养上清液中加入AgNO₃后24小时内从淡黄色变为深棕色的明显颜色变化得到确认（图1 a–f）。这一视觉转变是银纳米颗粒形成的特征指标，归因于SPR的激发。
UV-Vis吸收光谱进一步证实了纳米颗粒的形成，在416 nm处呈现尖锐的SPR峰（图2；补充文件1），表明Ag⁺离子被还原为金属态Ag⁰纳米颗粒。生物合成AgNPs的SPR峰通常报道在350–450 nm或400–450 nm范围内，取决于颗粒大小、形态和包被分子。本研究结果与近期报道密切相关——Das等对Trema orientalis来源AgNPs观察到400–500 nm的SPR峰；Deshmukh等报道了假单胞菌介导AgNPs在420 nm附近的SPR峰；Sevinç-Şaşmaz等记录了贯叶连翘合成的AgNPs在448 nm处的最大吸收。研究间SPR波长的微小差异主要归因于纳米颗粒尺寸、形态、介电环境以及表面结合生物分子性质的差异。先前研究同样表明，包括芽孢杆菌属和其他内生微生物在内的细菌培养滤液，通过酶促和蛋白质介导的还原机制在胞外合成纳米颗粒。
【数据】颜色变化时间：24h内；SPR峰位：416 nm；文献对比SPR范围：350–500 nm
3.2 形态与理化表征
TEM显微照片（图3 a和b）显示合成的Bs-AgNPs主要为球形，聚集极少，分布相对均匀。粒径范围为8至30 nm，平均直径约20 nm，确认了具有窄尺寸分布的纳米级银颗粒的成功合成。观察到的纳米颗粒呈球形形态，与先前生物合成AgNPs的报道相似。例如，Sevinç-Şaşmaz等报道了用贯叶连翘合成的球形AgNPs，平均直径约35 nm；Plokhovska等获得了13.8至20.7 nm范围的细菌代谢物介导AgNPs。
DLS分析显示Bs-AgNPs的平均水合粒径为33.68 nm，PDI为0.290（图4；补充文件1），表明悬浮液为中等单分散且均质。DLS测量的水合直径大于TEM是预期的——DLS测量的是水合颗粒，包括周围的生物分子包被层，而TEM仅测量金属核心。
通过zeta电位分析评估Bs-AgNPs的胶体稳定性，结果显示表面电荷为−20.58 mV（图5）。这一负zeta电位表明纳米颗粒悬浮液具有良好的静电稳定性——zeta电位值在约±20至±30 mV之间的颗粒通常被认为高度稳定，而大于±30 mV则表明优异的胶体稳定性。负表面电荷在纳米颗粒之间产生足够的静电排斥力，最大限度地减少聚集并在储存期间保持分散稳定性。Santos等报道了植物介导AgNPs的zeta电位范围为−11.2至−23.7 mV，Anzum等报道了海红豆来源银纳米颗粒的值为−15.1 mV。
【数据】TEM粒径范围：8–30 nm；平均粒径：约20 nm；DLS水合粒径：33.68 nm；PDI：0.290；zeta电位：−20.58 mV
3.3 X射线衍射（XRD）分析
XRD分析确认了枯草芽孢杆菌介导银纳米颗粒的晶体结构和相纯度。衍射图谱在2θ值27.90°、32.32°、38.20°、44.38°、46.32°、54.92°、57.56°、64.52°和77.44°处呈现明显而尖锐的布拉格反射，分别对应(111)、(200)、(211)、(220)、(311)、(222)、(400)和(420)晶面，这些是面心立方（fcc）金属银的特征晶面（图6；补充文件1）。
使用Debye-Scherrer方程计算的平均晶粒尺寸为28.05 nm，结晶度指数达到70.65%，表明形成了具有明确晶格结构的高度结晶纳米颗粒。本研究获得的XRD图谱与先前生物合成AgNPs的报道一致。Kadir等、Plokhovska等和Anzum等均报道了类似的fcc银特征峰，证实了生物合成AgNPs的晶体性质。XRD获得的晶粒尺寸略大于TEM颗粒尺寸（20 nm），因为XRD测量的是结晶域，而TEM测量的是单个纳米颗粒。
【数据】2θ峰位：27.90°、32.32°、38.20°、44.38°、46.32°、54.92°、57.56°、64.52°、77.44°；晶面：(111)、(200)、(211)、(220)、(311)、(222)、(400)、(420)；平均晶粒尺寸：28.05 nm；结晶度指数：70.65%
3.4 傅里叶变换红外光谱（FTIR）
Bs-AgNPs的FTIR光谱显示特征吸收峰位于2976、2670、2324、2108、1809、1041和878 cm⁻¹（图7；补充文件1），分别对应C-H（烷烃）、O-H（醇）、O=C=O（二氧化碳）、C=C=C（丙二烯）、C=O（共轭酰卤）、C-N（胺）和C=C（烯烃）官能团。
这些官能团的存在表明枯草芽孢杆菌培养上清液中的胞外生物分子吸附在纳米颗粒表面，在Ag⁺离子还原过程中起还原剂作用，同时作为稳定剂或包被分子防止纳米颗粒聚集。在早期报道中，C-H和O-H带表明醇类、蛋白质和其他生物分子参与了AgNPs的还原和稳定。O=C=O、C=C=C、C=O和C-N基团提示代谢物、蛋白质和氨基酸参与了电子转移、包被和纳米颗粒稳定化。878 cm⁻¹处的C=C带也可能通过表面相互作用促进纳米颗粒稳定化。本研究获得的FTIR谱图得到了先前生物合成AgNPs研究的支持，这些研究同样报道了羟基、羰基、氨基和酚类基团参与AgNPs的还原和稳定。
【数据】FTIR吸收峰：2976、2670、2324、2108、1809、1041、878 cm⁻¹；对应官能团：C-H、O-H、O=C=O、C=C=C、C=O、C-N、C=C
3.5 MIC和MBC的测定
Bs-AgNPs对细菌病原菌表现出强效抗菌活性，尽管其敏感性因细菌细胞壁结构差异而有所不同。X. euvesicatoria pv. euvesicatoria和P. syringae pv. tomato的MIC值均为20 ± 0.00 μg mL⁻¹，而抑制C. michiganensis subsp. michiganensis则需要显著更高的MIC 80 ± 0.00 μg mL⁻¹（图8 a–c）。
同样，X. euvesicatoria pv. euvesicatoria、P. syringae pv. tomato和C. michiganensis subsp. michiganensis的MBC值分别为80 ± 0.00 μg mL⁻¹、40 ± 0.00 μg mL⁻¹和160 ± 0.00 μg mL⁻¹（图9 a–c），表明对革兰氏阴性和革兰氏阳性植物病原菌均具有有效的杀菌活性。
X. euvesicatoria pv. euvesicatoria和P. syringae pv. tomato比C. michiganensis subsp. michiganensis更敏感，这可能是由于细胞壁结构的差异。革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，允许AgNPs更容易渗透，而革兰氏阳性菌较厚的肽聚糖层则充当屏障。Bs-AgNPs的抗菌活性归因于膜破坏、细胞内损伤和活性氧（ROS）产生，导致细菌细胞死亡并降低耐药性发展的可能性。本研究获得的MIC和MBC值与其他生物合成AgNPs对植物病原菌的报道相当。
【数据】MIC（X. euvesicatoria）：20 ± 0.00 μg mL⁻¹；MIC（P. syringae pv. tomato）：20 ± 0.00 μg mL⁻¹；MIC（C. michiganensis）：80 ± 0.00 μg mL⁻¹；MBC（X. euvesicatoria）：80 ± 0.00 μg mL⁻¹；MBC（P. syringae pv. tomato）：40 ± 0.00 μg mL⁻¹；MBC（C. michiganensis）：160 ± 0.00 μg mL⁻¹
3.6 生物膜形成抑制
Bs-AgNPs在不同浓度下对三种病原菌的生物膜形成表现出显著的抑制效果（图10 a–c）。图10d显示了相对于生长对照（GC，100%）和无菌对照（SC，0%）的生物膜形成抑制百分比。随着Bs-AgNPs浓度的增加，三种病原菌的生物膜形成均呈剂量依赖性减少。
【数据】原文未详述各浓度点的具体抑制百分比数值；生物膜抑制呈剂量依赖性
3.7 离体叶片试验
离体叶片试验用于确定Bs-AgNPs对番茄叶片X. euvesicatoria pv. euvesicatoria侵染的有效剂量（图11）。不同浓度的Bs-AgNPs处理叶片后接种病原菌，通过目视评估病害症状严重度。
【数据】原文未详述各处理组的具体病害严重度数值
3.8 温室试验
温室评估验证了Bs-AgNPs对番茄细菌性叶斑病的病害抑制效果（图12）。图12a显示了在受控温室条件下对番茄植株施用各种处理（原文此处被截断）。
【数据】原文未详述温室试验的具体数据
讨论与解读
本研究利用枯草芽孢杆菌DTBS-5无细胞培养上清液成功合成了银纳米颗粒。SPR特征吸收峰位于416 nm，TEM、XRD和DLS分析确认了球形、结晶性好且稳定的纳米颗粒形成，FTIR和zeta电位分析则表明有效的生物分子包被和胶体稳定性。Bs-AgNPs对番茄的革兰氏阴性和革兰氏阳性病原菌均表现出强效抗菌和抗生物膜活性。离体叶片和温室试验进一步证实了剂量依赖性的细菌性叶斑病抑制效果。
研究指出，虽然这些发现凸显了Bs-AgNPs作为传统杀菌剂环保替代品的潜力，但仍需进一步研究以优化大规模纳米颗粒生产、评估长期或高剂量施用下的植物毒性、评估其环境归趋和持久性，并在田间条件下验证长期有效性。此外，在商业化应用于作物保护之前，监测重复施用后耐药性发展的潜在风险也至关重要。
编译者解读
该研究展示了"微生物工厂"合成纳米材料的典型范式——利用枯草芽孢杆菌分泌的胞外代谢物同时完成银离子的还原与纳米颗粒的稳定包被，避免了化学合成中额外的稳定剂和还原剂。方法学上值得肯定的是多技术联用的系统表征策略（UV-Vis/TEM/DLS/XRD/FTIR），从光学、形态、胶体、晶体和表面化学五个维度完整刻画了纳米颗粒性质。从应用视角看，160 μg mL⁻¹的温室防效数据为纳米农药的田间应用提供了剂量参考。然而，合成批次间的重现性、纳米银在植物组织中的残留与迁移，以及长期田间应用对土壤微生物群落的影响，仍是商业化前必须回答的问题。该研究为纳米生物农药的开发提供了一个完整的技术参考框架。
参考来源
期刊：Physiological and Molecular Plant Pathology, 2026
DOI: 10.1016/j.pmpp.2026.103457
DOI: 10.1016/j.pmpp.2026.103457