产油酵母解脂耶氏酵母代谢工程实现2-苯乙醇高效生物合成

📅 2026-08-31 📰 Bioresource Technology 2024-11-30 📂 研究进展 👁 11

来源：Metabolic engineering of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for 2-phenylethanol overproduction（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

玫瑰香氛分子2-苯乙醇（2-PE）在化妆品、食品和制药行业具有巨大的市场需求。本研究利用CRISPR-Cas9代谢工程策略改造解脂耶氏酵母，通过解除莽草酸途径反馈抑制、强化Ehrlich途径、增加关键基因拷贝数及敲除竞争途径等多层次策略，最终实现2-PE产量2.4 g/L（84 h），产率0.06 g/g葡萄糖，为目前酵母中从头合成2-PE的最高产率。

研究背景

2-苯乙醇具有玫瑰样香气，广泛存在于水果、花卉及其精油中。凭借独特香气，2-PE在化妆品和食品行业应用广泛，还可用于生产苯乙酸、苯乙醛和乙酸苯乙酯等化合物。全球2-PE年需求量超过1万吨，并以每年15–20%的速度持续增长。目前2-PE合成主要依赖化学方法，该方法不环保、可能产生有毒副产物，且不符合"天然"要求。美国和欧盟法规规定，化学工业产品不能用于食品和化妆品。因此，生物技术发酵法合成2-PE日益受到关注。许多酵母细胞（如酿酒酵母、甘油假丝酵母和解脂耶氏酵母）中，2-PE可通过Ehrlich途径和苯丙酮酸途径两种方式天然合成。

研究方法

2.1 材料与培养条件

以酵母菌株Po1f-△ku70为亲本菌株。大肠杆菌DH5α菌株用于质粒构建，在Luria Bertani培养基中、37°C条件下培养，添加特异性抗生素，包括氨苄青霉素（100 mg/L）和卡那霉素（50 mg/L）。质粒提取使用上海Generay小提试剂盒。本研究所用全部酵母菌株列于表1，菌株亲缘关系图谱见附图S1。酵母细胞在YPD培养基（10.0 g/L酵母提取物、20.0 g/L蛋白胨、20.0 g/L葡萄糖）或YPD-琼脂平板（添加2%琼脂）上培养。含质粒的酵母在添加适宜氨基酸的YNB培养基（20.0 g/L葡萄糖、6.7 g/L YNB、0.5 g/L L-亮氨酸或0.5 g/L尿嘧啶）或YNB-琼脂平板（添加2%琼脂）上培养。带有URA3标记的质粒在YPD-琼脂-5FOA培养基上去除，该培养基含1 g/L 5-氟乳清酸（5FOA）。种子液在25 mL摇瓶中培养，含5 mL YPD，30°C、220 rpm条件下培养24 h。此外，250 mL摇瓶含50 mL YPD，以初始OD600为0.1的接种量接种培养物。在指定时间点收集发酵样品用于后续分析。

【数据】培养基：LB（大肠杆菌）、YPD（酵母）、YNB（含质粒酵母）；温度：37°C（大肠杆菌）、30°C（酵母）；转速：220 rpm；时间：24 h（种子液）；抗生素：氨苄青霉素100 mg/L、卡那霉素50 mg/L；5FOA浓度：1 g/L；初始OD600：0.1

2.2 DNA操作

所有内源基因均从Po1f-△ku70菌株基因组DNA扩增获得，AROGfbr和PheAfbr从大肠杆菌K12扩增。基因组装和质粒构建按此前描述的方法进行（Wei et al., 2020）。本研究所用全部质粒列于表1。基因敲除时，CasURA用限制性内切酶SacII和NotI消化，单链引导RNA（sgRNA）及目标基因上下游区域插入CasURA质粒。本研究所用全部sgRNA和引物列于表S1。

【数据】模板DNA：Po1f-△ku70基因组DNA、大肠杆菌K12基因组DNA；限制性内切酶：SacII、NotI

2.3 酵母转化与菌株构建

源自Po1f-△ku70的酵母菌株转化使用Zymogen Frozen EZ酵母转化试剂盒。pINA1312和pINA1269相关质粒分别用限制性内切酶NotI（TaKaRa）和BsrGI（NEB）线性化。基因组整合和敲除通过CRISPR-Cas9完成。

【数据】线性化酶：NotI（TaKaRa）、BsrGI（NEB）；转化试剂盒：Zymogen Frozen EZ

2.4 分析方法

酵母细胞生长通过600 nm吸光度（OD600）使用酶标仪（BioTek Instruments）监测。检测葡萄糖浓度时，800 μL发酵样品以12,000 rpm离心2 min，上清液用生物传感器分析仪（西尔曼，中国深圳）分析。向发酵样品中加入等体积无水乙醇，以12,000 rpm离心3 min。上清液用0.22 μm有机滤膜过滤，使用Agilent 1260高效液相色谱系统配合C18色谱柱（Diamonsil Plus 5 μm C18A，250 × 4.6 mm，DiKMA）分析。检测波长为210 nm，流速0.8 mL/min，流动相如下：溶剂A为ddH2O；溶剂B为100%甲醇。洗脱梯度如下：0–3 min，2%溶剂B；3–5 min，2%溶剂B至50%溶剂B；5–12 min，50%溶剂B；12–15 min，70%溶剂B；15–20 min，2%溶剂B。

【数据】离心转速：12,000 rpm；离心时间：2 min（葡萄糖检测）、3 min（2-PE检测）；检测波长：210 nm；流速：0.8 mL/min；色谱柱：C18（250 × 4.6 mm，5 μm）

2.5 统计分析

本研究所有实验均进行三次重复，数据分析使用GraphPad Prism 8软件。组间显著性差异通过t检验确定。

【数据】重复次数：3次；统计软件：GraphPad Prism 8；检验方法：t检验

研究结果

3.1 过表达EcAROGfbr和EcPheAfbr解除莽草酸途径反馈抑制

在酵母细胞中，2-PE从葡萄糖从头合成经由莽草酸途径。该途径利用PEP和E4P，由DAHP合酶催化合成DAHP，再经三步反应产生莽草酸。随后莽草酸进一步转化为苯丙酮酸（图1）。莽草酸途径中的关键酶——DAHP合成酶ARO4和分支酸变位酶ARO7，因酪氨酸的负反馈作用而受到显著抑制，这种抑制大幅降低了莽草酸途径内的代谢通量（Liu et al., 2021; Lyu et al., 2018）。

▲ Schematic showing the biosynthetic pathways of 2-PE production in Y. lipolytica. F6P, fructose-6-phosphate; SHIK, 3-dehydroshikimate; S3IP, shikimate 3-phosphate; EPSP, 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate; PPA, prephenate; F-1,6-P, fructose-1,6-bisphosphate; G-3-P, glyceraldehyde-3-phosphate; E4P, er

为解除莽草酸途径的负反馈抑制，EcAROGfbr和EcPheAfbr分别在强启动子Php4d驱动下表达，并使用pINA1269质粒整合到Po1f-△ku70菌株中。60 h时2-PE产量分别为107.2 mg/L和89.3 mg/L（图2B）。含空质粒pINA1269的Po1f-△ku70检测不到2-PE（图2B）。这表明EcAROGfbr和EcPheAfbr有效解除了负反馈抑制，使2-PE能够在解脂耶氏酵母中合成。然而，2-PE产量仍然偏低，因此采用了"推-拉"策略。令人惊讶的是，EcAROGfbr（推）和EcPheAfbr（拉）的共表达使2-PE产量在60 h时显著提升至326.9 mg/L，分别比单独表达提高了3.04倍和3.66倍（图2B）。这表明EcAROGfbr和EcPheAfbr共表达大幅增加了莽草酸途径的代谢通量。

▲ Alleviation of negative feedback inhibition from the shikimate pathway. (A) Metabolic pathway of 2-PE synthesis from the shikimate pathway. (B) Yield of 2-PE and OD600 by overexpressing EcAROGfb r and EcPheAfbr. (C) Production performance of 2-PE for strain PE01. (D, E) OD600 and consumption of gluc

随后，使用CRISPR-Cas9技术将EcAROGfbr和EcPheAfbr敲入mhy位点，构建菌株PE01，这使解脂耶氏酵母从丝状形态转变为更有利于产量提升的酵母形态（Shang et al., 2023）。结果显示，2-PE产量达到276.3 mg/L（图2C），葡萄糖在60 h内完全消耗（图2E）。

莽草酸途径已被用于生产多种氨基酸衍生物，包括白藜芦醇（Shang et al., 2023）、柚皮素（Li et al., 2023; Mao et al., 2023）、甜菜碱（Rodriguez et al., 2017）和对香豆酸（Kumokita et al., 2022; Li et al., 2023）。然而，由于酪氨酸对相关酶的负反馈抑制，莽草酸途径的代谢通量仍然相对较低。通过引入酿酒酵母ARO4和ARO7的突变体可解除负反馈抑制，从而增强解脂耶氏酵母中该途径的代谢通量（Li et al., 2023）；解脂耶氏酵母内源ylARO4和ylARO7的突变体也表现出类似效果（Larroude et al., 2021）。酿酒酵母ARO3突变体最近被证实可提高酪醇和2-PE的生物合成（Liu et al., 2023）。研究人员还将EcAROGfbr和EcPheAfbr引入酿酒酵母，以解除莽草酸途径中2-PE和酪醇合成的负反馈抑制（图2A）（Zhu et al., 2021b）。EcAROGfbr和EcTyrAfbr也已被用于提高白藜芦醇产量（Shang et al., 2023），EcAROGfbr已被引入解脂耶氏酵母以改善2-PE合成（Gu et al., 2020b）。本研究证明EcAROGfbr（推）和EcPheAfbr（拉）的共表达能有效解除解脂耶氏酵母中的负反馈抑制，显著提高2-PE产量，为莽草酸途径衍生物合成研究提供了有价值的补充。

【数据】2-PE产量（单独表达EcAROGfbr）：107.2 mg/L（60 h）；2-PE产量（单独表达EcPheAfbr）：89.3 mg/L（60 h）；2-PE产量（共表达）：326.9 mg/L（60 h）；提高倍数：3.04倍（vs EcAROGfbr单独）、3.66倍（vs EcPheAfbr单独）；PE01菌株2-PE产量：276.3 mg/L；葡萄糖消耗：60 h内完全消耗

3.2 Ehrlich途径优化提高2-PE产量

虽然成功解除莽草酸途径的负反馈抑制使2-PE得以合成，但产量仍然较低。来自莽草酸途径的苯丙酮酸进入Ehrlich途径（图1），ARO10催化其转化为苯乙醛，再由醇脱氢酶还原生成2-PE（图3A）。这些酶此前已被强化以促进苯丙氨酸向2-PE的转化。例如，Hassing等人（2009）通过在酿酒酵母中过表达ARO10和ADH2实现了2-PE产量的提高。解脂耶氏酵母拥有八种苯乙醛还原酶和九种醇脱氢酶，其中ylPAR4（YALI0D07062g，编码苯乙醛还原酶）被鉴定为合成2-PE特别有效的酶（Gu et al., 2020a）。

▲ Effect of ylARO10 and ylPAR4 overexpression on 2-PE yield. (A) Metabolic pathway of 2-PE synthesis from PPY in the Ehrlich pathway in Y. lipolytica. (B) Production of 2-PE and OD600 resulting from ylARO10 and ylPAR4 overexpression. (C) Production performance of 2-PE in strain PE02. (D) OD600 and con

为评估ylARO10（YALI0D06930g，编码丙酮酸脱羧酶）和ylPAR4对Ehrlich途径2-PE生物合成的影响，首先在PE01菌株中过表达ylPAR4，由Php4d驱动整合。与含pINA1269载体的PE01菌株相比，2-PE产量略微增加至211 mg/L（图3B）。该结果表明ylPAR4不是Ehrlich途径中2-PE生物合成的限速步骤。随后在PE01中过表达ylARO10，观察到2-PE产量显著增加，达到523 mg/L（图3B）。这一发现表明ylARO10是Ehrlich途径中的限速步骤。接着，使用Ptefin和Php4d启动子分别在PE01中共表达ylARO10和ylPAR4，通过pINA1269整合。ylARO10和ylPAR4的同时过表达使2-PE产量达到578 mg/L，比对照高3.21倍，比仅过表达ylPAR4高2.73倍（图3B）。此外，高产菌株的OD600比低产菌株略有下降（图3B），可能是因为2-PE对细胞的毒性作用（Zhan et al., 2022）。

进一步实验使用CRISPR-Cas9将ylARO10和ylPAR4整合到A08位点，构建菌株PE02。该菌株中，2-PE在60 h达到峰值产量452 mg/L，与PE01相比生产力显著提高，产率为0.02 g/g葡萄糖（图S2）。这表明ylARO10是2-PE下游合成的关键限速步骤。

【数据】2-PE产量（仅过表达ylPAR4）：211 mg/L；2-PE产量（仅过表达ylARO10）：523 mg/L；2-PE产量（共表达ylARO10+ylPAR4）：578 mg/L；提高倍数：3.21倍（vs对照）、2.73倍（vs仅ylPAR4）；PE02菌株2-PE产量：452 mg/L（60 h）；产率：0.02 g/g葡萄糖

3.3 增强关键酶表达提高2-PE产量

PE02中已成功构建完整的2-PE合成途径，并鉴定出四个关键步骤基因：EcAROGfbr、EcPheAfbr、ylARO10和ylPAR4。为进一步提高2-PE产量，尝试增强这些关键酶的表达，这通常通过多拷贝策略实现（Wang et al., 2019）。对于2-PE合成，将合成途径分为两个模块：第一个模块表达来自大肠杆菌的EcAROGfbr和EcPheAfbr基因，第二个模块表达来自Ehrlich途径的内源基因ylARO10和ylPAR4。

▲ 增加关键基因拷贝数对2-PE产量的影响。(A) 增加关键基因拷贝数的示意图。(B) 菌株PE03、PE04和PE05中2-PE产量及OD600。(C) 菌株PE03、PE04和PE05的葡萄糖消耗。

EcAROGfbr和EcPheAfbr整合到DGA2位点构建菌株PE03，而ylARO10和ylPAR4使用CRISPR-Cas9整合到D17位点构建菌株PE04（图4A）。在菌株PE03和PE04中，2-PE产量分别达到548 mg/L和537 mg/L，分别比PE02菌株提高1.21倍和1.18倍（图4B）。最后，将全部四个基因同时以增加的拷贝数整合，构建PE05菌株，其2-PE产量达到605 mg/L，比PE02提高1.33倍。因此，增加关键基因拷贝数有效提高了2-PE产量。

【数据】PE03菌株2-PE产量：548 mg/L（1.21倍 vs PE02）；PE04菌株2-PE产量：537 mg/L（1.18倍 vs PE02）；PE05菌株2-PE产量：605 mg/L（1.33倍 vs PE02）

3.4 CRISPR-Cas9敲除竞争途径进一步提高2-PE产量

虽然强化Ehrlich途径有效提高了2-PE的产量，但PE204菌株中可检测到的酪醇产量达到440 mg/L（图S3）。在苯丙酮酸下游，有两种酶参与2-PE和酪醇的生物合成。首先，ylPHA2合成苯丙酮酸，随后通过Ehrlich途径生成2-PE。

▲ Knockout of TYR1 and TRP2 from competitive pathways. (A) Competitive pathways for 2-PE in Y. lipolytica. (B) Production of strains PE05, (Production of strains PE05, PE06 and PE07 at 60 h). (C) OD600 of strains PE05, PE06 and PE07.

▲ 优化莽草酸途径对前体供应的影响。(A) 苯丙酮酸代谢途径。(B) 菌株PE08的2-PE产量和OD600。(C) 菌株PE09、PE10和PE11的2-PE产量。(D) 菌株PE11在20 g/L和40 g/L葡萄糖浓度下的2-PE产量表现。

Metabolic engineering of the oleaginous yeast Yarrowia lipol — ▲ 论文配图

【数据】酪醇产量（PE204菌株）：440 mg/L

讨论与解读

本研究通过基因工程和代谢途径优化在解脂耶氏酵母中高效生物合成了2-苯乙醇。采用解除莽草酸途径关键酶反馈抑制、强化Ehrlich途径、增强关键酶表达以及应用CRISPR-Cas9敲除竞争途径等策略，对2-PE生物合成途径进行了系统优化。最优菌株在84 h时实现了2.4 g/L的高产量，产率为0.06 g/g葡萄糖，为目前酵母从头合成2-PE的最高产率。该策略有助于提高2-PE产量并推动其工业化应用。

编译者解读

本研究展示了典型的"推-拉-阻断"代谢工程策略在非常规酵母中的系统应用。值得注意的是，研究者从解除反馈抑制入手，逐步识别限速步骤、增加拷贝数、敲除竞争途径，逻辑递进清晰。2-PE对细胞具有毒性，高产菌株OD600下降的现象提示产物耐受性可能是后续提升瓶颈。0.06 g/g葡萄糖的产率虽为目前酵母最高，但距理论产率仍有差距。该工作为莽草酸途径衍生物（如白藜芦醇、柚皮素等）的高效生物合成提供了可借鉴的策略框架。

参考来源

期刊：Bioresource Technology, 2024

DOI: 10.1016/j.biortech.2024.131354

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