来源：A homologous recombination-proficient Yarrowia lipolytica chassis for multiplex genome manipulation（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是重要的工业微生物，但其天然偏好非同源末端连接（NHEJ）修复DNA双链断裂，限制了精准基因组编辑的效率。本研究通过系统改造重组机器、调控多入侵诱导重排（MIR）过程、表达同源单链DNA退火蛋白（SSAP）–单链DNA结合蛋白（SSB）配对，成功将该菌转化为同源重组（HR）优势型底盘菌株。与NHEJ缺陷菌株相比，多片段多位点整合效率提升38.9倍，单一位点单片段和多片段整合效率分别提升1.6倍和1.2倍。即使在50 bp同源臂条件下，HR效率仍高达58%，并可同时整合两个巨型DNA片段（18.0 kb和13.5 kb）至两个基因组位点，效率达11%。
研究背景
遗传工程是当代生物技术的基石。基于核酸酶的基因组编辑系统，尤其是CRISPR/Cas系统，通过在特定DNA位点引入双链断裂（DSB），触发细胞修复机制，从而实现靶向突变、序列插入或基因敲除。HR和NHEJ是DSB修复的两条主要途径，二者机制截然不同——HR可实现精准修复，而NHEJ本质上是致突变性的，常导致适应性下降或恶性转化。精准基因组编辑要求底盘生物具有HR主导偏好。酿酒酵母因天然偏好HR而成为重要的真核模式生物，但许多具有工业潜力的微生物（如解脂耶氏酵母、乳酸克鲁维酵母等）天然倾向于NHEJ。如何将NHEJ优势型菌株改造为HR优势型，是合成生物学面临的关键挑战。
研究方法
质粒、片段与菌株构建
本研究所用菌株详见表S1（补充在线信息），引物（TSINGKE生物技术公司，北京，中国）详见表S2，gRNA质粒详见表S5。基因RAD50、RAD51、RAD52、RAD54、RAD59、SAE2、MRE11\**、FUN30、YEN1、MUS81和MMS4从解脂耶氏酵母W29基因组中扩增获得。异源基因Cas9-VPR、LrpRect-LrSSB、MspRect-MsSSB、PapRect-PaSSB、λ-Red β-EcSSB、GFP、mCherry、BFP、CARB和CARRP由TSINGKE合成，并针对解脂耶氏酵母进行了密码子优化，详见表S3。所有基因插入位点已有报道[27,53,54]，用于删除RAD9、MPH1、RAD1、RAD10、SGS1、RMI1、TOP3、URA3和CEX1*以及调控GFP和mCherry表达的gRNA均使用CHOPCHOP网络工具设计，详见表S4。
gRNA表达盒通过重叠延伸PCR将gRNA启动子序列P tRNA Gly与终止子序列T RPR1组合构建。随后使用Golden Gate克隆将表达盒与载体pCfB3405 [27]骨架连接，构建gRNA表达质粒。DNA供体使用重叠延伸PCR组装，删除构建体包含同源臂，整合构建体包含同源臂、启动子、ORF和终止子序列。质粒纯化使用AxyPrep质粒小提试剂盒（货号：Axygen AP-MN-P-50）。为避免其他错误PCR产物污染，所有PCR产物的纯化使用Axygen DNA凝胶回收试剂盒（货号：Axygen AP-GX-50）。质粒和PCR产物的A260/A280比值控制在1.8–2.0范围内，A260/A230比值控制在2.0–2.2范围内。质粒浓度维持在200–400 ng/μL，DNA片段浓度维持在100–200 ng/μL。纯化后的DNA经测序确保无突变。
菌株构建方面，首先通过直接HR将CAS9-VPR表达盒整合至酵母基因组的IntC_3位点。CAS9-VPR表达盒、潮霉素抗性基因（HPH）表达盒以及上下游同源臂通过重叠延伸PCR组装为单一片段。HPH表达盒两侧翼各含LoxP序列，便于后续去除。使用基于醋酸锂的转化方案[27]将DNA导入亲本菌株。转化子在YPD+HYG平板上筛选，并通过菌落PCR验证。阳性转化子随后用Cre重组酶附加体质粒转化以去除HPH，生成菌株YLSL01。此后所有遗传修饰均按前述方法通过CRISPR实现[27]。具体而言，供体DNA与gRNA质粒共转化至酵母细胞。转化子在YPD+NTC平板上筛选，使用位于同源臂外侧的引物通过菌落PCR验证。过表达基因的转录水平通过qPCR定量双重验证（补充在线信息图S10）。阳性菌落在YPD液体培养基中培养24小时，使携带诺尔丝菌素抗性基因（NAT）的gRNA质粒丢失。随后将细胞划线至YPD平板，所得菌落再划线至YPD+NTC平板。在YPD+NTC平板上无生长表明质粒成功丢失。最终，正确菌株保存于甘油中或用于后续应用。
【数据】菌株：解脂耶氏酵母W29；引物来源：TSINGKE；质粒浓度：200–400 ng/μL；DNA片段浓度：100–200 ng/μL；A260/A280：1.8–2.0；A260/A230：2.0–2.2；质粒丢失时间：24h；筛选标记：HPH（潮霉素）、NAT（诺尔丝菌素）
RNA提取与实时荧光定量PCR
菌株在YPD琼脂平板上划线培养24小时。随后收集2 × 10⁷个细胞，使用OMEGA（美国）的R6870酵母RNA试剂盒提取RNA。取500 ng RNA用Accurate Biotechnology（中国）的Evo M-MLV RT Premix反转录为cDNA。qPCR引物详见表S2。qPCR在Applied Biosystems 7500实时PCR系统上进行，使用Accurate Biotechnology的SYBR® Green Pro Taq HS，严格遵循制造商指南。以ACT1基因作为参考看家基因。
【数据】细胞数量：2 × 10⁷；RNA用量：500 ng；培养时间：24h；培养基：YPD琼脂；参考基因：ACT1
基因组编辑效率测定
单一位点编辑评估：将1 μg DNA供体（含同源臂和GFP表达盒）和500 ng gRNA质粒转化至对应1 mL OD600为3的培养物的细胞沉淀中。恢复2小时后收集细胞，转移至3 mL含诺尔丝菌素的YPD中，培养48小时。通过流式细胞术（BD Fortessa X-20）分析60,000个细胞，计算荧光细胞百分比，即为HR重组效率。培养后的OD600值代表细胞活力。每次实验设三个生物学重复，使用同一基因型的不同克隆。
单基因组位点多片段整合评估：将3 μg DNA供体（主文图2A）（三个片段摩尔比1:1:1）和500 ng gRNA质粒转化至对应1 mL OD600为3的培养物的细胞沉淀中。恢复2小时后收集细胞，确保铺板过程中每个含诺尔丝菌素的YPD平板的OD600一致。平板上橙色细胞比例代表成功整合的HR效率。
多位点编辑评估：将3 μg DNA供体（主文图3A,F）（三个片段摩尔比1:1:1）和500 ng gRNA质粒（含三个gRNA表达盒）转化至对应1 mL OD600为3的培养物的细胞沉淀中。除非特别注明，恢复时间为2小时。随后收集细胞，转移至3 mL含诺尔丝菌素的YPD中培养48小时。通过流式细胞术分析60,000个细胞，计算显示三种荧光的细胞百分比，即为HR重组效率。另一种评估方法中，转化后细胞分别铺于含诺尔丝菌素的YPD平板和含5-FOA的SC平板，含5-FOA的SC平板上橙色菌落数相对于含诺尔丝菌素的YPD平板上总菌落数的比例，即为HR重组效率。
长片段整合测试：两个长片段（主文图5F）共转化（4 μg，摩尔比1:1）或分别转化（2 μg），与500 ng gRNA质粒（含两个或单个gRNA表达盒）配合使用。通过流式细胞术分析60,000个细胞，计算显示相应荧光的细胞百分比，即为HR重组效率。
【数据】单一位点：供体DNA 1 μg，gRNA质粒 500 ng，OD600=3，恢复2h，培养48h，分析60,000细胞；多片段单一位点：供体DNA 3 μg（摩尔比1:1:1），gRNA质粒 500 ng；多位点：供体DNA 3 μg（摩尔比1:1:1），gRNA质粒 500 ng（含3个gRNA表达盒）；长片段：共转化4 μg（1:1）或分别2 μg
菌株稳健性评估
细胞对氧化应激的抵抗力按先前报道的方法评估[55]。H₂O₂以50 mM终浓度施加以诱导氧化应激。细胞连续1/10梯度稀释，取5 μL稀释液滴于YPD平板上，30°C培养。菌株对温度波动的抵抗力按以下方法评估[56]：将菌株培养至对数中期，取1 OD600生物量，在39°C热激1小时，或50°C热激20分钟。细胞连续1/10梯度稀释，取5 μL稀释液滴于YPD平板上，30°C培养。
【数据】H₂O₂浓度：50 mM；稀释梯度：1/10；滴加量：5 μL；培养温度：30°C；热激条件：39°C 1h 或 50°C 20min；生物量：1 OD600
荧光强度测定
重组菌株在含诺尔丝菌素的YPD培养基中预培养48小时，然后接种（后续内容原文未详述）。
【数据】预培养时间：48h；培养基：含诺尔丝菌素的YPD
研究结果
单片段整合HR效率的提升
解脂耶氏酵母W29（CLIB 89/CBS 7504/ATCC 20460）是基础研究和生物技术研究中广泛使用的模式菌株。为产生DSB并调控基因表达，将内切酶Cas9与人工转录激活子VPR [15]融合，置于TEF启动子控制下，整合至W29基因组的IntC_3位点，生成菌株YLSL01。Cas9与VPR的融合未显著影响Cas9的切割效率，Cas9-VPR的引入对菌株生长无可察觉的影响（补充在线信息图S1）。NHEJ关键基因KU70在W29中被CAS9替换，生成NHEJ缺陷对照菌株YLSL02。验证确认，转化和培养后，基于GFP的流式细胞术分析与菌落PCR在定量HR效率方面等效（补充在线信息图S2A–D），且NHEJ介导的随机整合可忽略不计（补充在线信息图S2E–G）。
Rad51是HR的核心驱动蛋白，结合单链DNA形成核蛋白丝，在基因组中搜索同源序列[16]。基于真核生物中NHEJ和HR的分子机制（图1A），我们首先尝试通过单独过表达Rad51及其辅助蛋白（Rad54、Rad59和Rad52）来增强HR。所有基因均在GPD启动子控制下表达，并分别整合至IntE_1位点。然而，仅过表达Rad52的菌株YLSL46显示出较YLSL01参考菌株近两倍的HR效率提升（图1B）。有趣的是，在YLSL01中同时将两份RAD52拷贝整合至IntE_1位点（分别由GPD启动子和TEFin启动子控制）后，HR效率提升至17%。但引入三份拷贝时未观察到进一步提升（图1B），表明存在其他限制HR效率的因素。
DSB末端 resection（切除）是决定细胞通过HR修复并限制NHEJ使用的关键阶段[17,18]。Mre11-Rad50-Xrs2（MRX）复合物启动DSB末端切除，并维持断裂DNA末端靠近以便修复[19]；Mre11(R10T)通过增强Exo1核酸酶的切除活性加速DSB末端切除[20]。Sae2促进DSB末端的切除和桥接[21]。为促进DSB末端切除的启动，我们构建了在GPD启动子控制下过表达SAE2或MRE11(R10T)并整合至IntE_1位点，以及在TEF启动子控制下过表达RAD50并整合至IntE_3位点的YLSL01衍生菌株。其中，仅过表达MRE11(R10T)和RAD50的菌株YLSL101和YLSL141分别实现了更高的HR效率（分别为12%和14%）（图1C）。
DNA对修复蛋白的可及性影响DSB修复结果。Rad9在DSB末端充当物理屏障，保护DNA断裂点免受外切降解，限制HR的发生[22–25]。它还限制Rpa1、Rad52和Rad51向ssDNA丝3'端的招募[24]。染色质重塑因子Fun30有助于克服Rad9形成的屏障[26]。为增强HR修复相关蛋白对DSB的可及性，在GPD启动子控制下过表达FUN30并整合至IntE_1位点，同时敲除RAD9。FUN30的过表达未导致更高的HR效率，而RAD9的破坏使HR效率较YLSL01提高4.1倍，达到35%（图1C）。
随后进行了MRE11(R10T)、RAD52、RAD50过表达与RAD9删除的组合实验。MRE11(R10T)与RAD52和/或RAD50的组合过表达未显著改善HR效率。然而，过表达RAD50和RAD52的菌株YLSL142表现出25%的HR效率提升。此外，在YLSL142中敲除RAD9（YLSL143）使HR效率较YLSL01参考菌株进一步增加11.1倍，达到82%。
最后，我们评估了YLSL143菌株中缩短同源臂的DNA片段整合的HR效率。50 bp、100 bp和500 bp同源臂的HR效率分别为41%、62%和79%，较YLSL01参考菌株分别提高27.8倍、31.1倍和18.5倍（图1E）。与YLSL02相比，YLSL143在这些缩短的同源臂条件下也表现出增强的HR效率（图1E）。重要的是，培养后YLSL143在不同同源臂条件下的OD600值与YLSL01相当，且高于NHEJ缺陷菌株YLSL02（图1F）。结合这三种菌株的生长曲线和CFU（补充在线信息图S3），我们推测YLSL143 HR效率的提升并非以细胞活力为代价，而NHEJ缺陷菌株YLSL02确实存在适应性缺陷。综合这些结果，对HR通路中关键蛋白的组合调控可将解脂耶氏酵母转变为HR优势型菌株。
【数据】YLSL143 HR效率：82%（较YLSL01提高11.1倍）；50 bp同源臂HR效率：41%（27.8倍提升）；100 bp同源臂HR效率：62%（31.1倍提升）；500 bp同源臂HR效率：79%（18.5倍提升）；RAD9敲除HR效率：35%（4.1倍提升）；YLSL142 HR效率：25%；YLSL101 HR效率：12%；YLSL141 HR效率：14%；YLSL46 HR效率：近2倍提升；双拷贝RAD52 HR效率：17%
单基因组位点多片段整合HR效率的提升
能够在单个基因组位点精准整合多个DNA片段的宿主菌株将加速遗传工程进程。为评估HR优化菌株中的多片段整合效率，我们将β-胡萝卜素合成基因分为三个独立片段，带同源臂靶向IntC_2位点[27]。CARB和CARRP在其开放阅读框中段被打断，便于识别随机整合——随机整合不会导致功能性CARB和CARRP表达，因此不产生β-胡萝卜素（图2A）。
与单片段整合不同，多DNA片段整合通过称为MIR的过程实现（图2B）[28]。Mph1和Sgs1-Top3-Rmi1（STR）复合物可破坏新生置换环（D-loops），后者是MIR过程中的关键中间体[29–31]。MPH1、SGS1、TOP3或RMI1的删除分别将多片段整合的HR效率提升至27%、26%、33%和29%（图2C）。Rad1-Rad10核酸酶复合物特异性切割内部入侵产物中含同源性的3'端瓣，从而减少多入侵的潜力[28,32]。RAD1或RAD10的删除分别将HR效率提升至29%和25%（图2C）。结构选择性内切酶Yen1通过结构特异性切割促进Holliday连接（HJs）的精准解析，而Mus81-Mms4复合物促进异常连接中间体（如错配重组或复制中间体）的移除，确保MIR进程的进行[28]。在GPD启动子控制下过表达YEN1并整合至B3位点，对多片段整合的HR效率提升有限（33%）。然而，在GPD启动子控制下过表达MUS81、在EXP1启动子控制下过表达MMS4（均整合至B3位点）的菌株YLSL216，多片段整合HR效率达68%，与YLSL143在相同同源臂长度下的单片段整合效率相当。
接下来，我们评估了YLSL216在其他基因组位点的多片段整合效率。位于D染色体上的IntD_1位点的三片段整合HR效率和CFU数量与IntC_2位点相当（图2C,D），表明多片段整合在不同染色体的不同基因组位点间具有普适性。最后，我们研究了减少同源臂长度对多片段整合效率的影响（后续内容原文未详述）。
【数据】MPH1删除HR效率：27%；SGS1删除HR效率：26%；TOP3删除HR效率：33%；RMI1删除HR效率：29%；RAD1删除HR效率：29%；RAD10删除HR效率：25%；YEN1过表达HR效率：33%；YLSL216（MUS81+MMS4过表达）HR效率：68%
多片段多位点整合效率的提升
（此部分原文节选未完整提供，基于可获取内容忠实翻译。原文图3描述了两站点同时基因组整合的HR效率评估，涉及引入同源SSAP–SSB配对以增强多位点编辑效率。）
【数据】原文未详述（此段对应原文内容在节选中不完整）
HR效率复核与HR优势底盘菌株稳健性评估
（此部分原文节选未完整提供，基于可获取内容忠实翻译。原文图4描述了YLSL143和YLSL236中50 bp同源臂的单片段单一位点整合评估，以及多片段同时整合评估。）
【数据】原文未详述（此段对应原文内容在节选中不完整）
YLSL236作为多重基因组操作与细胞工厂构建底盘的探索
（此部分原文节选未完整提供，基于可获取内容忠实翻译。原文图5描述了使用Cas9-VPR进行基因编辑、抑制和激活的示意图，以及长片段整合测试。）
【数据】原文未详述（此段对应原文内容在节选中不完整）
讨论与解读
破坏NHEJ是使生物体更适于HR遗传工程的常用策略。然而，NHEJ破坏并不总能带来足够的可操作性提升，且伴随着高效DNA修复丧失相关的若干缺陷。这对于解脂耶氏酵母等工业底盘菌株尤为重要。与已报道的改善解脂耶氏酵母HR效率的研究[11,13,14]相比，本研究开发的HR优势型菌株在较短同源臂条件下表现出显著优势——50 bp同源臂时HR效率达58%，100 bp同源臂时达62%。此外，首次在解脂耶氏酵母中实现了单一位点三片段整合和三位点同时整合，使用200 bp和500 bp同源臂时HR效率分别为60%和50%。两个长DNA片段（500 bp同源臂）同时整合至两个基因组位点的效率达10%，为细胞工厂构建提供了便利。DSB修复在大多数物种中是保守过程[34]，因此本研究中使用的部分策略在其他酵母中也有报道[10,12,35–37]。但新构建的HR优势型解脂耶氏酵母菌株在多片段、巨型片段乃至多位点整合方面展现出更大优势，能在短同源臂条件下维持高HR效率，并具备精细调控基因表达的能力。
编译者解读
本研究通过系统组合策略——而非单一基因操作——将解脂耶氏酵母从NHEJ偏好型转化为HR优势型，这一思路值得借鉴。值得注意的是，作者并未简单依赖NHEJ缺陷策略，而是通过过表达HR关键蛋白、删除HR屏障因子、调控MIR过程等多管齐下，最终实现了82%的单片段整合效率，且不牺牲细胞活力。从合成生物学应用角度看，50 bp同源臂即达58%效率意味着引物合成成本大幅降低，而多片段多位点同时整合能力为复杂代谢通路的模块化组装提供了实用工具。但需指出，文中部分结果段落（图3–5对应内容）在原文节选中信息不完整，可能影响对这些策略细节的全面评估。未来若能将SSAP–SSB配对策略与MIR调控进一步组合，或可突破当前多片段整合的效率上限。
参考来源
Shan, L. (2025). A homologous recombination-proficient Yarrowia lipolytica chassis for multiplex genome manipulation. Trends in Biotechnology. DOI: 10.1016/j.tibtech.2025.06.009
DOI: 10.1016/j.tibtech.2025.06.009