来源：Genetic Engineering of Yarrowia lipolytica for 1,8-cineole production: A sustainable approach（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
1,8-桉叶素是一种具有广泛工业和医药应用的单萜化合物，传统上依赖植物提取或化学合成，受限于产量不稳定和环境成本。本研究通过CRISPR-Cas9介导的基因组整合，在解脂耶氏酵母中异源表达来自克拉维链霉菌的1,8-桉叶素合酶，并结合甲羟戊酸途径关键基因过表达、Erg20p双点突变及培养基优化，实现了以废弃食用油为碳源的可持续生产，最终产量达4.68 mg/L，同时积累1108.53 mg/L胞内角鲨烯。这是首次报道利用基因工程改造解脂耶氏酵母生产1,8-桉叶素的研究。
研究背景
萜烯是一类天然化合物，在制药、香料、香精及生物燃料添加剂领域应用广泛。1,8-桉叶素（又称桉叶油醇）是一种含氧单萜，主要存在于桉树、薰衣草和互叶白千层的精油中，具有抗炎、抗氧化等药理活性，其高十六烷值使其具备作为生物柴油的潜力，还可作为昆虫驱避剂和谷物保护剂。目前1,8-桉叶素主要从桉树中通过蒸馏提取，或通过蒎烯、萜品醇、松节油等原料经氧化、重排、环化和水解等化学步骤合成。然而植物提取面临产量低和季节性波动的问题，化学合成则存在成本高、纯度低、工艺复杂和环境污染等缺陷。微生物细胞工厂的基因工程改造为1,8-桉叶素的可持续生产提供了替代路径。解脂耶氏酵母天然拥有甲羟戊酸（MVA）途径且乙酰-CoA池含量高，是生产萜烯类化合物的理想宿主。
研究方法
2.1 培养基与培养条件
大肠杆菌DH5α感受态细胞作为质粒扩增的克隆宿主，使用含100 µg/mL氨苄青霉素的Luria Bertani肉汤/琼脂培养基，在37°C下常规培养。本研究中作为基因组修饰宿主菌株的解脂耶氏酵母Po1f菌株购自ATCC。解脂耶氏酵母菌株常规培养于YPD培养基中，组成为10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖（HiMedia），在30°C下持续振荡培养。构建的解脂耶氏酵母转化子在含2%葡萄糖的YNB培养基上筛选，该培养基补充了不含亮氨酸和尿嘧啶的完全合成限定培养基（CSM Leu-Ura-，购自HiMedia）。
【数据】培养基：LB（含100 µg/mL氨苄青霉素）、YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）、YNB（2%葡萄糖，CSM Leu-Ura-）；温度：37°C（E. coli）、30°C（Y. lipolytica）；菌株：E. coli DH5α、Y. lipolytica Po1f（ATCC）
2.2 质粒构建
质粒构建遵循标准流程。编码1,8-桉叶素合酶（CnSA）的克拉维链霉菌基因经密码子优化后，作为合成构建体购自美国Genscript公司。本研究使用了作者实验室先前构建的质粒pHR_HMG1/pHR_tHMG1和pHR_IDI1。聚合酶、DNA连接酶和限制性内切酶均购自New England Biolabs。质粒提取试剂盒和凝胶提取试剂盒分别购自GeneAll和Macherey-Nagel（Takara Bio Inc.）。表1总结了本研究中使用和构建的所有菌株。用于CRISPR-Cas9介导的无标记基因整合到解脂耶氏酵母基因组的质粒由加州大学河滨分校Ian Wheeldon博士实验室惠赠。首先，PCR扩增的MVA途径基因使用BssHII和NheI限制性内切酶克隆到相应的供体质粒中，以实现基因组位点特异性整合。供体质粒中的基因在UAS1B8-TEF（136）启动子下实现组成型表达。本研究中使用和构建的质粒列于表2，所用引物列于表3。
【数据】工具酶：BssHII、NheI；启动子：UAS1B8-TEF（136）；基因来源：S. clavuligerus CnSA（密码子优化，Genscript合成）
2.3 Erg20定点突变
ERG20基因的双点突变采用剪接重叠延伸PCR进行。用于片段扩增的Q5 DNA聚合酶购自New England Biolabs。简言之，设计携带目的突变的引物，通过设计的引物扩增基因内部区域，获得三个片段。将这三个片段以等摩尔浓度混合，在单管中进行剪接重叠延伸PCR。
【数据】方法：剪接重叠延伸PCR；聚合酶：Q5 DNA polymerase（NEB）；片段数：3个，等摩尔浓度混合
2.4 转化与菌株构建
无标记1,8-桉叶素生产菌株的构建方法是：将携带相应MVA途径基因和密码子优化的CnSA的pHR供体质粒，连同各自的pCRISPRyl质粒共同转化到解脂耶氏酵母中，实现位点特异性基因整合。解脂耶氏酵母菌株通过醋酸锂转化法构建，如前所述。阳性转化子通过菌落PCR确认，使用Takara Bio Inc.的R-taq聚合酶，随后进行迭代循环的转化和质粒消除，以促进基因整合和途径改造。
【数据】转化方法：醋酸锂法；筛选：菌落PCR（R-taq聚合酶）；整合方式：CRISPR-Cas9无标记位点特异性整合
2.5 工程菌株培养生产1,8-桉叶素
所有菌株首先在5 mL YPD培养基中、30°C持续振荡培养16小时进行预培养。发酵时，将预培养菌株以初始OD600为0.1接种到50 mL YPD培养基中，在30°C下持续振荡培养120小时。接种后，培养基上层覆盖5%十二烷以捕获产生的1,8-桉叶素。酵母提取物和蛋白胨分别用3%大豆蛋白分离物（SPI，购自Fytomax Nutrition Pvt. Ltd.，Aurangabad，并在实验室中水解）和玉米浆（CSL）替代作为氮源。不同碳源如麦芽糖和蔗糖以2%的浓度替代YPD中的葡萄糖。葡萄糖被废弃食用油（WCO，当地获取）以2%、5%、8%和10%的浓度替代作为替代碳源。上述所有变体均测试了生长和萜烯滴度。WCO的脂肪酸谱通过GC-MS测定。使用SPI作为氮源时，水解后的SPI经高压灭菌，取上清液使用，以确保总可溶性蛋白可用于生长。SPI水解物（SPH）按照先前描述的方案获得。在另一组独立实验中，研究了添加不同浓度MgSO4（2 mM、4 mM、6 mM、8 mM和10 mM）对细胞生长和1,8-桉叶素合成的影响。
【数据】预培养：5 mL YPD，30°C，16 h；发酵：50 mL YPD，初始OD600=0.1，30°C，120 h；覆盖层：5%十二烷；氮源替代：3% SPI/SPH、CSL；碳源替代：麦芽糖/蔗糖2%、WCO 2%/5%/8%/10%；MgSO4浓度：2、4、6、8、10 mM；分析：GC-MS（WCO脂肪酸谱）
2.6 糖的HPLC分析
上清液中的葡萄糖浓度通过Agilent HPLC系统监测，配备RID检测器和Aminex HPX-87H色谱柱。5 mM H2SO4以0.6 mL/min的流速通过色谱柱，进样体积为10 µL，柱温50°C。样品浓度通过标准曲线确定。
【数据】色谱柱：Aminex HPX-87H；流动相：5 mM H2SO4；流速：0.6 mL/min；进样量：10 µL；柱温：50°C；检测器：RID
2.7 1,8-桉叶素分析
培养五天后，细胞在3000 g下离心5分钟。上层十二烷层直接用于配备HP-5色谱柱的GC-FID分析。GC条件如下：进样口280°C，检测器280°C，分流比1:10，柱温箱65°C保持4分钟，以2.5°C/min的速率升至80°C，再以2°C/min的速率升至100°C，最后以20°C/min的速率升至280°C并保持2分钟。使用WCO作为碳源的实验中，十二烷和WCO形成单一层；因此，对此类样品进行GC分析时，280°C的最终保持时间延长至10分钟，浓度按总体积计算。不同浓度（100–500 ppm）的标准1,8-桉叶素（Sigma）作为参考标准，用于鉴定和定量工程菌株中1,8-桉叶素的合成。
【数据】离心：3000 g，5 min；GC-FID：HP-5柱，进样口280°C，检测器280°C，分流比1:10；程序升温：65°C（4 min）→2.5°C/min至80°C→2°C/min至100°C→20°C/min至280°C（2 min）；WCO样品：280°C保持10 min；标准品：100–500 ppm
研究结果
3.1 通过表达1,8-桉叶素合酶在解脂耶氏酵母中异源生产1,8-桉叶素
在自然界中，1,8-桉叶素主要在植物中生物合成，尤其是桉树属如蓝桉，由1,8-桉叶素合酶作用于底物香叶基焦磷酸（GPP）而生成。植物通常同时利用甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径和MVA途径合成GPP。MEP途径存在于叶绿体中，以丙酮酸和3-磷酸甘油醛为前体；MVA途径发生在细胞质中，以乙酰-CoA为前体。与植物不同，酵母仅依赖MVA途径从乙酰-CoA合成GPP。解脂耶氏酵母天然拥有MVA途径，且已知具有天然高乙酰-CoA池（图1）。多项萜烯表达研究也证实了其过量产生GPP的潜力，并能根据特定萜烯合酶的存在将其导向相应的萜烯。虽然编码1,8-桉叶素合酶的基因在植物中很常见，但近年来也在内生真菌Hypoxylon属和细菌中发现了该酶。在细菌中，来自克拉维链霉菌的1,8-桉叶素合酶是首个报道的细菌单萜环化酶。该酶的kcat/kM值（0.46 s⁻¹µM⁻¹）据报道高于植物来源的酶。1,8-桉叶素合酶基因（CnSA）已被用于蓝藻中光合生产1,8-桉叶素，产量达105.6 µg g⁻¹湿细胞重。在本工作中，来自克拉维链霉菌的密码子优化CnSA通过CRISPR-Cas9介导的基因组整合整合到解脂耶氏酵母Po1f菌株基因组中。所得菌株C在含2%葡萄糖的YPD培养基中生长，并覆盖5%十二烷。十二烷能有效捕获微生物产生的挥发性化合物，且对解脂耶氏酵母的生长无显著影响，这与其他研究中的观察一致。菌株C的十二烷层在培养5天后显示1,8-桉叶素滴度为0.07 mg/L（图2）。与不产生桉叶素的对照菌株相比，生长速率无显著下降，总葡萄糖消耗量保持不变。该结果表明异源CnSA在解脂耶氏酵母Po1f中实现了功能性表达，该菌株被进一步用作途径/蛋白质工程和优化以提高产物产量的基础菌株。
【数据】菌株C：1,8-桉叶素滴度0.07 mg/L（5天）；酶动力学：kcat/kM=0.46 s⁻¹µM⁻¹（S. clavuligerus CnSA）；蓝藻参考产量：105.6 µg g⁻¹湿细胞重；碳源：2%葡萄糖；覆盖层：5%十二烷
3.2 通过过表达内源基因进行甲羟戊酸途径工程
单拷贝1,8-桉叶素合酶整合能够在解脂耶氏酵母中诱导其合成，但滴度不理想。为进一步提高1,8-桉叶素滴度，研究策略是过表达途径基因以增加途径通量，从而提高1,8-桉叶素合酶的底物浓度（图1）。尽管最近一项研究中LC-MS和¹³C分析提示解脂耶氏酵母中存在MEP途径，但至今未有酶被报道。因此本研究聚焦于MVA途径进行1,8-桉叶素生产。MVA途径可分为上游和下游两部分。上游部分涵盖从乙酰-CoA形成异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），下游部分是IPP和DMAPP缩合形成萜类骨架，可被萜烯合酶转化为不同萜烯。在上游部分，甲羟戊酸的形成是不可逆的，因此由HMG1编码的HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA形成甲羟戊酸被认为是途径中的限速步骤。过表达HMG1已被报道可提高萜烯产量。HMG1是一种内质网驻留整合膜蛋白，其N端500个氨基酸序列的截短被发现可使其稳定于细胞质中并防止自身降解。这种截短版本HMG1（tHMG1）的过表达已在多种生物中被发现可增加萜烯产量，并被广泛用作萜类生产的工程策略。然而，在解脂耶氏酵母中对此存在相当大的争议——一些报道认为tHMGR优于HMG1，而另一些研究则持相反观点。一些研究甚至表明HMG1的N端截短可能产生不利影响。在本研究中，与仅表达1,8-桉叶素合酶的基础菌株C相比，单独过表达HMG1（菌株HC）和tHMG1（菌株tHC）分别使1,8-桉叶素产量提高了2.8倍和5.3倍（图2）。本研究支持tHMG1是更适合1,8-桉叶素生产的版本，因为其过表达使滴度比表达HMG1的菌株（菌株HC）提高了1.9倍。该结果与其他研究一致，即tHMG1的过表达已被证明可增加MVA途径的通量从而提高萜烯滴度。途径中的第二个酶异戊烯基二磷酸δ-异构酶1（IDI1）将IPP二聚化为DMAPP，平衡IPP/DMAPP的比例。其过表达预期可产生更多GPP而非法尼基焦磷酸（FPP），因为更多DMAPP被加载到Erg20p上，导致GPP/FPP比率升高，使通量导向单萜生产。在菌株HC和tHC中过表达IDI1分别产生了菌株HIC和tHIC，1,8-桉叶素产量分别为0.37 mg/L和1.25 mg/L，比各自的亲本菌株提高了1.9倍和3.4倍（图2）。在不影响细胞生长的情况下，过表达内源酶（各一个拷贝的tHMG1和IDI1）的工程菌株（tHIC）与仅表达1,8-桉叶素合酶的菌株C相比，1,8-桉叶素产量几乎增加了18倍。因此，途径酶的代谢工程已成功应用于引导碳通量，提高葡萄糖上1,8-桉叶素的产量。为进一步提高产量，工程菌株tHIC进一步采用蛋白质工程策略进行改造。
【数据】菌株HC（过表达HMG1）：0.07→0.196 mg/L（2.8倍）；菌株tHC（过表达tHMG1）：0.371 mg/L（5.3倍）；菌株HIC（HMG1+IDI1）：0.37 mg/L（比HC提高1.9倍）；菌株tHIC（tHMG1+IDI1）：1.25 mg/L（比tHC提高3.4倍，比菌株C提高18倍）；碳源：2%葡萄糖
3.3 法尼基焦磷酸合酶的双点突变
与植物不同，在酵母和动物中，FPP的合成由单一酶顺序催化。在酵母中，该酶由ERG20编码，同时具有GPP合酶和FPP合酶活性，且对FPP生产具有更高活性，从而降低了单萜生产所需的GPP浓度。为增强Erg20p对GPP生产的特异性，在菌株tHIC中引入了双突变Erg20p（Erg20F88W-N119W），生成菌株tHIC_E2M，1,8-桉叶素产量达1.73 mg/L（图2）。本研究中引入的两个点突变基于酿酒酵母中的一篇先前报道，其中Erg20p的F96W和N127W突变增强了酶对GPP的特异性，使桧烯产量提高了10.4倍。这些突变的设计目的是部分封闭活性位点，从而降低酶对GPP的亲和力，同时增加其对DMAPP的偏好。这有效地重定向了其催化功能，将其转变为GPP合酶，从而有利于单萜生物合成。类似策略被用于解脂耶氏酵母中改造Erg20p，其中通过序列比对研究确定了F88和N119残基为靶点。表达突变Erg20p（Erg20F88W-N119W）的菌株与亲本菌株相比，芳樟醇产量增加了3.7倍。与先前结果一致，双突变Erg20p的过表达使产量比亲本菌株tHIC提高了1.4倍，比基础菌株C提高了25倍（图2）。由于天然Erg20p仍然具有功能，用双突变体替换它的策略可能有效进一步提高产量。
【数据】菌株tHIC_E2M：1,8-桉叶素1.73 mg/L；比菌株tHIC提高1.4倍；比菌株C提高25倍；突变位点：F88W、N119W（对应S. cerevisiae的F96W、N127W）；参考：S. cerevisiae中桧烯产量提高10.4倍；参考：Y. lipolytica中芳樟醇产量提高3.7倍
讨论与解读
本研究通过途径工程、蛋白质工程和培养基优化的组合策略，成功在解脂耶氏酵母中实现了1,8-桉叶素的生产。tHMG1和IDI1的共表达结合Erg20p突变显著提高了产量，而培养基优化与辅因子补充使产量相比仅表达CnSA的亲本菌株提高了28倍。利用废弃食用油作为碳源，配合蛋白质源，实现了废弃物到价值的转化，增强了可持续性和成本效益。未来研究将聚焦于将途径通量重定向至1,8-桉叶素生产，并建立副产物角鲨烯同步提取的集成系统，以提升整体经济价值。本研究展示了解脂耶氏酵母经济生产1,8-桉叶素的显著潜力。
编译者解读
该研究在合成生物学应用层面有两点值得关注：一是选择解脂耶氏酵母作为底盘——其天然高乙酰-CoA池和强MVA通量为萜烯合成提供了优于酿酒酵母的碳流基础；二是将废弃食用油作为碳源和原位萃取剂"一物两用"，既降低了原料成本又简化了产物捕获流程。然而，4.68 mg/L的绝对产量距离工业化仍有数量级差距，且大量碳流偏向角鲨烯分支而非目标产物，说明GPP向单萜的定向输送仍是瓶颈。未来若能以启动子工程或蛋白支架策略强化GPP通道化，同时开发角鲨烯联产回收工艺，该体系的商业可行性将显著提升。
参考来源
Bhoir K. Genetic Engineering of Yarrowia lipolytica for 1,8-cineole production: A sustainable approach. Enzyme and Microbial Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2025.110659
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2025.110659