来源：Combinatorial iterative method for metabolic engineering of Yarrowia lipolytica: Application for betanin biosynthesis（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是工业重要的产油酵母，但缺乏组合工程工具限制了其多靶点协同优化的效率。本研究开发了EXPRESSYALI组合工程工具盒，支持每轮最多整合三个基因表达盒的连续多轮基因组编辑。利用该工具盒，研究者通过六轮迭代编辑与筛选，将甜菜红素产量从初始约20 mg/L提升至补料分批发酵的1.4 g/L，并敲除三种β-葡萄糖苷酶防止甜菜红素去糖基化。该工具盒可通过AddGene获取，为解脂耶氏酵母的代谢工程提供了系统化平台。
研究背景
解脂耶氏酵母是生产脂质、脂肪醇、脂肪酶、类胡萝卜素等产品的优选细胞工厂。多个菌株已获FDA的GRAS认证，可用于膳食补充剂和甜菊糖苷甜味剂生产。与酿酒酵母相比，解脂耶氏酵母缺乏Crabtree效应，工艺放大更易操作，同时也是研究真菌脂质代谢和烷烃分解的模式生物。尽管CRISPR-Cas9、CRISPRi及DNA组装工具盒等遗传工具已相继开发，但解脂耶氏酵母仍缺乏可同时测试多靶点组合、并以大规模文库筛选（如FACS、生长筛选或快速质谱）为支撑的组合工程工具。酿酒酵母已有此类工具，但主要依赖其卓越的同源重组能力。本研究旨在填补这一空白。
研究方法
2.1 质粒构建与细菌转化
EXPRESSYALI质粒及用于甜菜红素生产工程化的质粒汇总于表S3。EXPRESSYALI工具盒构建所用DNA片段采用Phusion Hot Start II高保真PCR预混液（Thermo Scientific™, F565S）扩增。EXPRESSYALI工具盒载体（单基因表达盒的YALICP载体和多基因表达盒的YALIMP载体）通过Gibson Assembly® Master Mix（New England BioLabs, E2611L）进行Gibson组装生成。启动子、终止子等遗传部件通过TOPO®克隆（Invitrogen™, 450071）克隆至PCR-Blunt II TOPO载体。组合甜菜红素途径库和甜菜红素前体库由EXPRESSYALI工具盒通过Golden Gate组装创建。
用于组合文库构建的所有基因均针对解脂耶氏酵母进行密码子优化，并由Twist Bioscience Corporation（美国）合成。合成基因克隆至PCR-Blunt II TOPO载体，并通过Sanger测序验证序列正确性。启动子、基因和终止子等遗传片段通过BsaI Golden Gate组装装入YALICP载体，生成单表达盒质粒。随后，单表达盒质粒池通过BsmbI Golden Gate组装装入YALIMP载体，形成完整的组合文库池。
Golden Gate方案中，所有部件均标准化为等浓度50 fmol/mL（50 nM），参照Shaw等人的方法（Shaw et al., 2019）。Golden Gate反应按照NEB Golden Gate Assembly Kit手册（New England BioLabs, E1601L和E1602L）制备。反应混合物随后在热循环仪中采用以下程序孵育：（42°C（BsmbI）或37°C（BsaI）2分钟，16°C 5分钟）×30个循环，随后60°C终消化10分钟，最后80°C热灭活10分钟。用于生成组合文库的Golden Gate反应进行120个循环。
反应混合物全部转入E. coli DH5α感受态细胞。转化后的E. coli细胞在含相应抗生素的LB琼脂平板上筛选，抗生素包括卡那霉素（50 μg/mL）、氨苄青霉素（100 μg/mL）、氯霉素（25 μg/mL）或壮观霉素（100 μg/mL）。为生成组合文库，转化后的E. coli细胞直接在250 mL摇瓶的50 mL LB培养基中、37°C、250 rpm连续振荡培养过夜。收获细胞后，使用midi prep试剂盒（MACHEREY-NAGEL GmbH, 740494）从E. coli细胞中提取质粒池。
【数据】抗生素浓度：卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL、氯霉素25 μg/mL、壮观霉素100 μg/mL；Golden Gate循环数：30或120；温度：37°C（BsaI）/42°C（BsmbI）；振荡：250 rpm；培养时间：过夜
2.2 酵母菌株与培养基
本研究构建的所有解脂耶氏酵母菌株均来源于ST6512，即含有KU70位点Cas9的W29（ATCC, 20460）菌株（Marellea et al., 2020）。所有表达盒经NotI消化后，采用标准醋酸锂技术进行酵母转化（Daniel Gietz and Woods, 2002）。在YPD液体培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中恢复2小时后，酵母转化子在含抗生素的YPD琼脂平板（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、10 g/L琼脂）上涂布，抗生素为250 mg/L诺尔丝菌素（Jena Bioscience, AB-101）或400 mg/L潮霉素（Invitrogen, 10687010）。基因整合和基因破坏采用CRISPR技术。酵母菌落PCR使用Phire Plant Direct PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific, F160S）验证转化子的基因整合或基因破坏。基因整合验证中，PCR片段进一步通过Sanger测序（Eurofins Scientific SE）确认。本研究使用的所有菌株汇总于表S4。
甜菜红素生产中，解脂耶氏酵母菌株在矿物培养基（Jensen et al., 2014）中培养，pH 6，每升含7.5 g (NH4)2SO4、14.4 g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O、22 g葡萄糖、2 mL微量元素溶液（3.0 g/L FeSO4·7H2O、4.5 g/L ZnSO4·7H2O、4.5 g/L CaCl2·2H2O、0.84 g/L MnCl2·2H2O、0.3 g/L CoCl2·6H2O、0.3 g/L CuSO4·5H2O、0.4 g/L Na2MoO4·2H2O、1.0 g/L H3BO3、0.1 g/L KI、19.0 g/L Na2EDTA·2H2O）和1 mL维生素溶液（0.05 g/L D-生物素、0.2 g/L对氨基苯甲酸、1.0 g/L D-泛酸钙、1.0 g/L盐酸硫胺素、1.0 g/L盐酸吡哆醇、1.0 g/L烟酸、25.0 g/L肌醇）。
【数据】pH：6；(NH4)2SO4：7.5 g/L；KH2PO4：14.4 g/L；MgSO4·7H2O：0.5 g/L；葡萄糖：22 g/L；诺尔丝菌素：250 mg/L；潮霉素：400 mg/L；恢复时间：2h
2.3 自动化菌落挑选
质粒文库转化后，酵母菌落在含适当抗生素的YPD琼脂平板上、30°C培养两天后出现。菌落由PIXL机器人（Singer Instruments）挑取至Nunc™ OmniTray YPD琼脂平板（Thermo Scientific™）。菌落由PIXL成像软件（2.21.1001.4版）自动识别。
【数据】培养温度：30°C；培养时间：2天
2.4 光密度与甜菜红素吸光度测定
光密度（600 nm，OD600）和甜菜红素吸光度（535 nm）使用微量滴定板读数器BioTek Synergy MX（Holm & Halby）测定，取25 μL酵母培养物稀释8倍。测定在96孔透明底板（Corning）中进行，以稀释培养基作为吸光度空白对照。
【数据】OD600：600 nm；甜菜红素吸光度：535 nm；样品量：25 μL；稀释倍数：8倍
2.5 甜菜红素提取与HPLC定量
解脂耶氏酵母菌株培养48小时后，在BioTek Synergy MX（Holm & Halby）上测定OD600。随后，1 mL细胞培养物转移至含0.5–0.75 mm玻璃珠的2 mL螺口微量管中。胞内甜菜红素通过细胞破碎仪（Percellys 24, Bertin Instruments）裂解细胞提取。细胞-玻璃珠混合物随后在10,000 g、4°C离心10分钟分离。取上清液等分试样，通过高效液相色谱（HPLC）分析测定总甜菜红素浓度。
甜菜红素、异甜菜红素、甜菜素苷元、甜菜醛酸和葡萄糖均使用Dionex UltiMate 3000 HPLC系统（Thermo Fisher Scientific）定量。系统配备DAD-3000 UV/Vis检测器（Dionex）和RI-101示差折光检测器（Dionex）。流动相采用HPLC级溶剂。目标化合物对应峰的鉴定通过与Sigma-Aldrich来源的标准品比对完成。化合物定量分析基于外标校准法的峰面积测定。HPLC结果使用Chromeleon 7软件（Thermo Fisher Scientific）分析。
甜菜红素、甜菜素苷元和甜菜醛酸检测中，HPLC系统使用2.1 × 150 mm Zorbax Eclipse Plus C18反相柱（粒径3.5 μm，孔径95 Å，4.6 × 100 mm），柱温30°C。进样量10 μL，流速1 mL/min。溶剂组成初始设定为A相（0.1%甲酸）= 98.0%、B相（乙腈）= 2.0%，保持2分钟。随后按线性梯度变化，至5.0分钟时A = 90.0%、B = 10.0%。接着调整梯度斜率，至8.0分钟时达到A = 85.0%、B = 15.0%。8.2分钟时，溶剂比例改为A = 2.0%、B = 98%，保持至9.5分钟。最后，9.6分钟时溶剂组成恢复至初始值A = 98.0%、B = 2.0%，稳定保持至11.5分钟分析结束。样品定量校准曲线使用不同浓度的甜菜红素标准品（Sigma-Aldrich, 901266）建立。
葡萄糖定量使用Aminex HPX-87H柱（Bio-Rad Laboratories, USA），参照Borja等人描述的方法（Borja et al., 2019），修改为柱温60°C。
【数据】离心：10,000 g、4°C、10 min；进样量：10 μL；流速：1 mL/min；柱温：30°C（C18）/60°C（HPX-87H）；分析时间：11.5 min；梯度：98% A/2% B→90% A/10% B（5 min）→85% A/15% B（8 min）→2% A/98% B（8.2–9.5 min）→98% A/2% B（9.6–11.5 min）
研究结果
3.1 EXPRESSYALI工具盒描述
EXPRESSYALI工具盒采用Golden Gate方法对解脂耶氏酵母整合质粒进行组合组装（图1）。每个整合质粒组设计整合至染色体特定基因座——间区或开放阅读框（ORF，若需同时基因敲除）。工具盒由三个层级质粒组成：生物砖或生物部件质粒（Level 0）、单表达盒质粒（Level 1）和多表达盒质粒（Level 2）。
Level 0包含四个启动子质粒，携带以下启动子：TEF、8UASTEF、GPD和EXP。此外，Level 0还有三个终止子质粒，携带以下终止子：LIP2、SYNGUO和SYN8。本项目专门构建了31个基因质粒（Level 0），包含甜菜红素生物合成基因或前体生物合成基因。Level 0载体中的生物砖两侧翼有BsaI限制性位点。酶切后，这些位点暴露4-bp粘性末端，将启动子、基因和终止子生物砖连接至Level 1载体。Level 1载体经BsmbI消化后生成三个Level 1载体——CP-A、CP-B和CP-C。这些载体携带不同悬突的插入转录单元，通过Golden Gate反应组装至Level 2载体。Level 2载体最多容纳三个转录单元。
该设计通过不同Level 1 YALICP（a）、（b）和（c）质粒的随机组合，促进组合文库的构建。EXPRESSYALI载体初始含绿色荧光蛋白（GFP），克隆过程中被移除，产生非荧光的E. coli菌落。Golden Gate反应后这些非荧光菌落的高比例表明组装效率高，意味着文库覆盖率良好。不同载体组装所用悬突详见图S1。对于含一个或两个转录单元的Level 2载体，可使用填充序列替代部分转录单元。EXPRESSYALI所用整合位点在本研究前期工作中已验证，整合效率超过50%（Holkenbrink et al., 2018）。
【数据】整合效率：>50%；Level 0基因质粒数：31个；Level 2最大转录单元数：3个
3.2 在解脂耶氏酵母中表达组合甜菜红素生物合成基因文库
为验证工具盒，研究者选择红色素甜菜红素作为目标产物。酵母中甜菜红素的生物合成需要三种异源酶以及前体酪氨酸和UDP-葡萄糖的供应。该途径为分支途径，可能需要通过优化基因拷贝数或酶变体来平衡。酵母中酪氨酸生物合成在转录和酶动力学水平受到严格调控。因此，前体供应优化也可能是必要的。
研究者首先将多拷贝甜菜红素途径文库转入解脂耶氏酵母菌株ST11662。该菌株已通过过表达抗反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶Aro4pK229L和分支酸变位酶Aro7pG139S优化了酪氨酸供应（Sáez-Sáez et al., 2020）。该菌株还携带Streptococcus pyogenes cas9表达盒替换解脂耶氏酵母KU70基因（编码ATP依赖性DNA解旋酶II亚基）。KU70或KU80缺失可减少非同源末端连接的发生，提高基因组编辑效率（Kretzschmar et al., 2013; Verbeke et al., 2013）。若读者希望将工具盒用于自选菌株，可使用质粒pCfB6364（AddGene ID #106151（Holkenbrink et al., 2018））生成KU70:cas9编辑。
选择先工程化甜菜红素生物合成而非前体优化的原因是利用红色简单筛选，且起始菌株的酪氨酸供应已有所优化。每轮工程化后，研究者选择2–3个表现最佳的菌株。对这些菌株，通过PCR扩增和Sanger测序验证该轮靶向的基因组区域，确认预期基因组编辑是否发生。然而，由于该流程繁琐，未对前几轮靶向区域进行测序。由于每轮2–3个最佳菌株以单锅转化而非分别转化方式处理，在最终对少数终菌株进行Nanopore全基因组重测序之前，无法获知循环中每个中间菌株的完整遗传标记。
甜菜红素生物合成（图2）中，研究者选择了六个酪氨酸羟化酶编码基因（TyH）、六个DOPA-4,5-双加氧酶编码基因（DOD）和十个葡萄糖基转移酶编码基因（GT）。所有基因变体来源于植物，唯GdDOD和YgiD分别来自Gluconacetobacter diazotrophicus和E. coli（表2）。六个TyH基因变体分别克隆至CP-A质粒，DOD基因克隆至CP-B质粒，GT基因克隆至CP-C质粒（图S2）。此阶段每个质粒使用相同的启动子-终止子对，即带有八个重复上游激活序列的TEF1启动子（Pr8UASTEF）和LIP2终止子（tLip2）。
随后，所有Level 1质粒组合组装为三个Level 2载体组（图S2），靶向整合位点IntE_3、IntC_3和IntE_2（Holkenbrink et al., 2018）。这些组合途径文库应各包含360种甜菜红素生物合成酶组合。文库随后与gRNA载体（在特定基因组位置切割，如IntE文库对应IntE_3位点）共转化至酵母，产生不同途径基因组合整合至该位点的酵母克隆文库。选择目标酵母克隆后，在不含抗生素的条件下培养去除gRNA载体，克隆可再次转化——这次使用靶向另一位点的文库和gRNA载体（如IntC_3）。克隆选择和向其他基因组位点的转化可持续进行，直至获得目标表型。为避免gRNA载体去除步骤，可在连续转化中交替使用携带诺尔丝菌素或潮霉素选择标记的gRNA载体。
将组合甜菜红素途径文库转化至基础菌株ST11662的IntE_3位点后，选择性平板上出现红色菌落。还有若干黄色菌落，可能携带某些无功能基因变体，主要产生甜菜黄素。22个红色菌落在液体矿物培养基中培养，通过HPLC测定甜菜红素浓度（图S5 A）。两个最佳生产菌株分别产生18.46 ± 0.36和19.68 ± 0.48 mg/L甜菜红素（图3A）。此后的甜菜红素滴度均按甜菜红素与异甜菜红素滴度之和计算。随后对这两个菌株IntE_3位点整合的基因进行PCR扩增和Sanger测序，分别携带EvTyH、HmoDOD、BgGT2和AnTyH、McDOD、BgGT2（图3B）。
接下来，研究者测试添加第二和第三拷贝途径是否可进一步提高甜菜红素产量。将靶向IntC_3位点的组合途径文库转化至第一轮基因组编辑筛选出的两个菌株。使用PIXL机器人系统（Singer Instruments）挑选颜色最深的100–200个菌落。菌落在96孔板中培养，在微量滴定板读数器上测定光密度和甜菜红素吸光度（补充数据）。将归一化甜菜红素吸光度（甜菜红素吸光度/OD600）最高的20–30个克隆在24深孔板中培养，通过HPLC分析测定甜菜红素浓度（图S5 B, C）。选择产生24–27 mg/L甜菜红素的三个最佳分离株，并对新整合的基因组合进行测序。
【数据】甜菜红素滴度：18.46 ± 0.36 mg/L、19.68 ± 0.48 mg/L（第一轮）；24–27 mg/L（第二轮）；途径组合数：360种；TyH基因变体：6个；DOD基因变体：6个；GT基因变体：10个
讨论与解读
本研究报道了用于解脂耶氏酵母的组合迭代代谢工程基因组编辑方法EXPRESSYALI，并展示了其在开发甜菜红素生产细胞工厂中的应用。多种遗传工具盒已开发用于解脂耶氏酵母工程化（表1）。组合文库组装方面，Golden Gate技术因克隆保真度高而适用。Tong等人利用基于Golden Gate的yaliGG工具盒构建了五个基因在三个不同启动子下的组合紫色杆菌素途径文库（Tong et al., 2021），该文库构建于附加型载体上。然而，迭代工程轮次需要将构建体整合至基因组。整合可靶向已定义的特征化位点（如EasyCloneYALI系统（Holkenbrink et al., 2018）），或靶向重复转座子ZETA元件（如Yarrowia lipolytica GG工具盒（Larroude et al., 2019））。EXPRESSYALI工具盒选择Golden Gate克隆组合组装整合载体文库，用于cas9介导的基因组靶向。EXPRESSYALI工具盒需要在E. coli中进行三轮克隆以创建Level 0（部件）、Level 1（单表达盒）和Level 2（多基因表达盒）质粒。但Level 1和Level 2质粒无需测序验证，可组合组装。Level 0质粒（启动子、编码序列和终止子）可在后续工程中重复使用。
编译者解读
EXPRESSYALI工具盒的亮点在于将组合文库策略与迭代基因组整合相结合——每轮最多三个表达盒、可连续多轮叠加，配合自动化颜色筛选，形成了"构建—筛选—再构建"的闭环。从约20 mg/L到1.4 g/L的产量跃升，体现了组合迭代策略在多基因途径平衡中的实际效力。值得注意的是，工具盒通过GFP丢失指示组装效率、利用KU70缺失提高编辑效率等细节设计，降低了操作门槛。局限在于初始轮次中间菌株未逐一测序，依赖终末全基因组测序回溯，可能掩盖中间表型与基因型的对应关系。工具盒通过AddGene公开获取，对解脂耶氏酵母的途径工程具有直接推广价值。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2024
DOI: 10.1016/j.ymben.2024.09.003
DOI: 10.1016/j.ymben.2024.09.003