来源：Improving CRISPR/Cas9-mediated genome editing efficiency in Yarrowia lipolytica using direct tRNA-sgRNA fusions（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是重要的产油酵母，但固有同源重组能力弱，限制了位点特异性基因组编辑。现有tRNA-sgRNA融合设计在多数染色体位点编辑效率极低甚至失败。本研究通过RNA二级结构预测，发现tRNA与sgRNA之间的9核苷酸间隔序列会破坏tracrRNA茎环1结构，据此设计直接tRNA-sgRNA融合（TG设计），在先前编辑失败的染色体位点实现了高效基因整合与敲除。
研究背景
解脂耶氏酵母天然胞内脂质积累超过细胞干重的30%，并能产生有机酸、多元醇和维生素等非脂类天然产物，还可通过异源表达生产芳香族化合物、生物活性色素、类胡萝卜素及不饱和脂肪酸。然而，该酵母的工程改造受到限制：质粒稳定性低，位点特异性基因组编辑（基因敲入/敲除）效率低下。与酿酒酵母不同，解脂耶氏酵母的同源定向修复（HDR）能力弱，DNA双链断裂主要依赖非同源末端连接（NHEJ）修复，这限制了位点特异性基因编辑的成功率。近期基于tRNA-sgRNA融合的CRISPR/Cas9方法虽能编辑部分基因组位点，但多数位点编辑失败或效率极低。
研究方法
4.1 菌株与培养条件
本研究使用解脂耶氏酵母Po1f双重营养缺陷型、NHEJ感受态菌株（Madzak等，2000）。过夜液体培养在丰富酵母-蛋白胨-葡萄糖（YPD，Difco）培养基中进行，试管旋转培养，28°C孵育1–1.5天。酵母转化子在以下成分组成的极限合成培养基上筛选：无碳氮源的酵母氮碱基（VWR，1.7 g/L）、葡萄糖（20 g/L）、氯化铵（5 g/L），pH 6.8，28°C孵育至少2天。菌株和培养基的更多细节见补充信息。
【数据】菌株：Y. lipolytica Po1f（双重营养缺陷型，NHEJ感受态）；培养基：YPD（丰富培养基）及极限合成培养基（YNB 1.7 g/L + 葡萄糖 20 g/L + 氯化铵 5 g/L，pH 6.8）；温度：28°C；时间：1–1.5天（液体培养），≥2天（筛选培养）
4.2 酵母转化
Y. lipolytica 细胞使用常规醋酸锂法转化DNA材料，本研究对该方法进行了标准化以确保可重复性。标准化转化方法和不同实验中使用的筛选平板的完整细节见补充信息。
【数据】转化方法：醋酸锂法；具体参数：原文未详述（详见补充信息）
4.3 质粒、合成基因和寡核苷酸
所有质粒、合成基因和寡核苷酸列于补充信息表S1、S2和S3中。
【数据】质粒/基因/寡核苷酸清单：见表S1、S2、S3（原文未详述具体内容）
4.4 sgRNA二级结构预测
sgRNA二级结构预测使用“RNAstructure”软件（2018年10月8日更新版）（Reuter和Mathews，2010）的RNAfold和Pseudoknots功能，采用默认参数，但预测温度调整为28°C，即Y. lipolytica的生长温度。CARNA网络工具（Sorescu等，2012）用于预测sgRNA的共有二级结构。该工具在考虑单个碱基配对概率的同时，计算出与所有可能结构最佳匹配的比对结果。
【数据】预测软件：RNAstructure（RNAfold + Pseudoknots）；温度：28°C；比对工具：CARNA；参数：默认（除温度外）
4.5 crRNA克隆
不同crRNA使用Gibson Assembly Ultra Kit（SGI-DNA，美国）按照制造商方案克隆至AvrII线性化的pCRISPRyl（Addgene #70007）中。利用该试剂盒的3′-外切核酸酶活性，可同时克隆gRNA并删除9个额外核苷酸。该试剂盒用于构建携带TG设计的sgRNA表达质粒“pCRISPRyl_靶基因w/o 9nts”。不同质粒构建的完整细节见补充信息。pCRISPRyl_XPR2（含T9G XPR2设计）和CRISPRyl_AXP（含T9G AXP设计）质粒购自Addgene，编号分别为Addgene #84609和Addgene #84608。
【数据】克隆试剂盒：Gibson Assembly Ultra Kit（SGI-DNA）；载体：pCRISPRyl（AvrII线性化，Addgene #70007）；参考质粒：pCRISPRyl_XPR2（Addgene #84609）、CRISPRyl_AXP（Addgene #84608）
4.6 修复模板构建
删除模板为由各自正向和反向寡核苷酸构建的寡核苷酸，其3′-端携带互补重叠区。这些寡核苷酸通过典型的重叠延伸PCR进行双链化并延伸。同源区域的设计使完整开放阅读框被敲除，仅保留起始密码子和终止密码子，导致本研究靶向基因约2-Kb的缺失。删除模板构建的完整细节见补充信息。
携带外源基因hrGFP cassette的修复模板（供体）使用4片段Gibson组装（NEBuilder® HiFi DNA Assembly）按照制造商方案构建。组装包含左右同源臂（由IDT合成，美国，表S2）、SpeI-AvrII消化的hrGFP cassette，以及pHR_XPR2_hrGFP质粒（Addgene #84614）的BstBI-HindIII线性化片段（质粒骨架）。该方案用于构建pHR系列的不同pHR供体质粒，即pAS153、pAS114、pAS113和pAS154（列于表S1），分别在XPR2位点引导hrGFP整合，同源臂大小分别为50、100、200和400 bp。
【数据】删除模板：重叠延伸PCR构建，敲除约2-Kb ORF（仅保留起始/终止密码子）；供体构建：4片段Gibson组装（NEBuilder® HiFi）；同源臂：50、100、200、400 bp（pAS153、pAS114、pAS113、pAS154）；hrGFP cassette：SpeI-AvrII消化；骨架：pHR_XPR2_hrGFP（BstBI-HindIII线性化，Addgene #84614）
4.7 转化子菌落PCR筛选
阳性克隆使用菌落PCR鉴定。用牙签挑取约1 mm宽的小量菌落，悬浮于PCR管中10 μL NaOH溶液（20 mM），98°C孵育15 min，然后直接转移至冰上。取一定体积的裂解液，加入量为PCR预混液终体积的10%。PCR扩增使用Phire Hot Start II DNA聚合酶（Thermo Scientific，美国）。用于扩增不同片段的引物见补充信息（表S3）。
【数据】裂解：10 μL NaOH（20 mM），98°C，15 min；加样量：终体积的10%；聚合酶：Phire Hot Start II DNA聚合酶；引物：表S3
研究结果
我们研究了当前tRNA-sgRNA融合中的间隔序列是否是其CRISPR/Cas9基因组编辑效率受限的原因。
2.1 现有tRNA-sgRNA融合设计
对用于Y. lipolytica CRISPR/Cas9基因组编辑的合成tRNA^Gly-sgRNA融合设计的回顾，发现了分隔tRNA^Gly与sgRNA的9核苷酸间隔序列（图2）。Schwartz等（2016）（图2c）和Holkenbrink等（2018）（图2b）的设计中均存在相同数量的间隔核苷酸，但序列略有差异。另一项研究在tRNA-sgRNA融合中同时考察了Schwartz等（2016）的9核苷酸间隔序列和4核苷酸间隔序列（Borsenberger等，2018）。在所有这些设计中，该间隔序列与天然tRNA^Gly-5S rRNA融合的间隔序列完全比对（图2b,d）（Holkenbrink等，2018；Borsenberger等，2018）或部分比对（图2c）（Schwartz等，2016），后者包含或不包含下游5S rRNA基因5′-序列的一部分（图2a）。
我们推测这些合成tRNA-sgRNA融合中的间隔序列可能是为了与天然tRNA-5S rRNA融合保持同源性而引入的，但该间隔序列是否在驱动下游天然5S rRNA（以及合成sgRNA）表达或加工中发挥作用尚不清楚。然而，先前研究表明，tRNA招募的转录因子可以驱动天然tRNA-5S rRNA融合中下游5S rRNA的表达（Acker等，2008；Neuvéglise等，2013）。这表明天然间隔序列预计不会在驱动融合到tRNA下游基因的表达中发挥作用。此外，天然间隔区域预计不会在tRNA从其共转录下游基因的3′-端切割中发挥作用，因为已证明植物tRNase Z或酵母Trz1识别tRNA内部二级结构元件，在tRNA最后一个核苷酸后立即切割，并切掉融合到其3′-端的任何尾随序列（Barbezier等，2009；Canino等，2009；Kruszka等，2003；Neuvéglise等，2013；Skowronek等，2014）。
这使我们提出，在含有该间隔序列的合成tRNA-sgRNA融合中，tRNase Z介导的tRNA加工将释放出在5′-端携带9个核苷酸的尾随sgRNA。迄今为止合成tRNA-sgRNA中使用的tRNA为tRNA^Gly（Holkenbrink等，2018；Schwartz等，2016），在Y. lipolytica CLIB89（W29）中大多数（29个中的28个）以tRNA^Gly-5S rRNA融合形式存在。我们对Y. lipolytica CLIB89（W29）中28个天然tRNA^Gly-5S rRNA融合的间隔区域的研究显示，间隔区域分别为4个（n=15）和5个（n=11）核苷酸，以及先前未报道的由6个（n=1）和8个（n=1）核苷酸组成的间隔距离。我们在参考菌株Y. lipolytica CLIB122（原CLIB99）中发现了相同的统计结果，但多了一个间隔距离为4个核苷酸的tRNA^Gly-5S rRNA融合（表S4）。
除间隔距离较大（6和8个核苷酸）的情况外，这些统计结果与先前关于Y. lipolytica中tRNA^Gly-5S rRNA的报道（Acker等，2008）以及Y. lipolytica CLIB122（原CLIB99）的在线基因组tRNA数据库（http://lowelab.ucsc.edu/GtRNAdb/Yarr_lipo_CLIB99/）一致。间隔区域的比对揭示了T富集共有序列，在间隔距离为4个核苷酸（图3a）和5个核苷酸（图3b）的天然tRNA^Gly-5S rRNA融合中分别为“GTTT”和“GCTC/TT”。文献中，天然tRNA^Cys-snRNA52-1融合中也发现了T富集间隔序列，并被认为可能作为RNA聚合酶III的弱终止子（Neuvéglise等，2013）。这表明当前tRNA-sgRNA合成融合中发现的T富集间隔序列（图2b,c,d）可能降低下游sgRNA基因的表达，从而限制其基因组编辑效率。
【数据】间隔序列长度：9 nt（Schwartz 2016、Holkenbrink 2018）、4 nt（Borsenberger 2018）；天然融合间隔区：4 nt（n=15）、5 nt（n=11）、6 nt（n=1）、8 nt（n=1）；共有序列：4 nt间隔“GTTT”、5 nt间隔“GCTC/TT”；菌株：CLIB89（W29）与CLIB122（原CLIB99）统计一致
2.2 当前tRNA-sgRNA融合中sgRNA的结构预测
如前所述，我们提出合成tRNA^Gly-sgRNA融合的间隔9核苷酸序列在内源酶加工tRNA后仍会附着在sgRNA的5′-端。我们随后假设该5′-悬垂可能产生不利于sgRNA功能的非预期二级结构。为验证该假设，我们根据Holkenbrink等（2018）、Schwartz等（2016）和Borsenberger等（2018）设计中的具体序列，对含或不含5′-悬垂的sgRNA二级结构进行了建模。我们重点关注该5′-悬垂可能对sgRNA中tracrRNA二级结构的影响。在预测中，我们将crRNA序列替换为20个空白核苷酸（20个N），以避免靶标特异性crRNA（protospacer）对sgRNA二级结构预测的干扰（图4）。
引人注目的是，Holkenbrink等（2018）和Schwartz等（2016）设计中的9个额外核苷酸导致了tracrRNA茎环1的完全扰动（图4b和c）。在Schwartz等（2016）的设计中，茎环1的完全扰动与茎环重复:抗重复（RAR）双链的部分扰动（失去重复-抗重复结构）（图4c）或茎环2的完全消除（图4d）相结合，两者具有接近的最小自由能（MFE）。总体而言，9个额外核苷酸序列被预测会消除茎环1结构，伴随或不伴随茎环RAR或茎环2结构的完全或部分扰动（图4）。有趣的是，Borsenberger等（2018）在其合成tRNA-sgRNA融合中引入的4核苷酸间隔序列的特定序列未引起tracrRNA二级结构的任何预测扰动（图4e）。
先前研究表明，tracrRNA完整的茎环重复:抗重复（RAR）双链和茎环1结构对于Cas9-sgRNA核蛋白复合物的形成不可或缺（Jiang和Doudna，2017），这些结构的扰动完全消除Cas9催化的基因编辑效率（Jinek等，2012）。尽管tracrRNA的其余二级结构进一步支持稳定的Cas9-sgRNA复合物形成并增强sgRNA的稳定性（Nishimasu等，2014），但接头区域、茎环2和茎环3的扰动仅降低而非消除Cas9催化基因编辑的体内效率（Jinek等，2013）。
令人困惑的是，尽管间隔9核苷酸对tracrRNA二级结构具有预测的负面影响，但在某些tRNA-sgRNA融合中仍报道了携带9间隔核苷酸的功能性sgRNA实例（Holkenbrink等，2018；Schwartz等，2017c）。为得出sgRNA的二级结构-活性关系，我们预测了功能性和失败sgRNA的二级结构，这次在恒定9核苷酸5′-悬垂之外还包含了可变的crRNA序列（图S1）。然而，预测的二级结构在tracrRNA二级结构元件上具有多种扰动，因此仅通过目视观察单个sgRNA的二级结构很难建立二级结构-活性关系（图S1）。因此，我们转而推导并比较功能性和失败sgRNA的共有二级结构。
【数据】预测条件：20个N替换crRNA序列；MFE：接近（Schwartz 2016设计）；扰动类型：茎环1完全扰动、RAR部分/完全扰动、茎环2完全消除；4 nt间隔序列：无预测扰动
2.3 直接tRNA-sgRNA融合（TG）对GFP整合效率的影响
基于上述结构预测结果，我们设计并测试了直接tRNA-sgRNA融合（TG设计，即不含间隔序列），在AXP和XPR2两个染色体位点比较了含与不含9核苷酸间隔序列的CRISPR-Cas9介导GFP整合效率（图6）。结果显示，对于sgRNA^AXP，TG设计与T9G设计之间未观察到显著差异。然而，对于sgRNA^XPR2，TG设计的GFP整合效率显著高于T9G设计，这与二级结构预测一致——XPR2位点的T9G设计存在结构扰动，而AXP位点未显示明显扰动。
【数据】GFP整合效率：AXP位点TG vs T9G无显著差异；XPR2位点TG显著高于T9G（具体数值原文未详述）
2.4 修复模板同源臂长度与递送形式对基因敲入效率的影响
我们进一步表征了TG设计在XPR2位点的基因敲入效率，考察了修复模板同源臂长度和递送形式的影响（图7）。修复模板（携带于pHR供体质粒上，含URA3标记）的同源臂长度分别为50、100、200和400 bp。质粒以环状形式或经线性化后递送。结果显示，同源臂长度和递送形式均影响敲入效率。
【数据】同源臂长度：50、100、200、400 bp；递送形式：环状质粒与线性化质粒（具体效率数值原文未详述）
2.5 TG设计对基因敲除效率的影响
在POX2和IntE两个染色体位点比较了含与不含9核苷酸间隔序列的tRNA-sgRNA融合的基因敲除效率（图8）。对于靶向POX2位点的sgRNA^POX2，TG设计的基因敲除效率比T9G设计提高了约10倍。结构预测显示，T9G设计在该位点存在tracrRNA结构扰动，而TG设计保持了完整的二级结构。
【数据】POX2位点敲除效率：TG设计约为T9G设计的10倍；IntE位点：原文未详述具体数值
2.6 删除模板浓度、同源臂长度与删除片段大小对基因敲除效率的影响
使用TG设计在XPR2位点考察了删除模板浓度、同源臂长度和删除片段大小对基因敲除效率的影响（图9）。当使用浓度为20 pmol的删除模板时，同源重组率比使用100或1000 pmol时高约3倍。
【数据】删除模板浓度：20 pmol vs 100/1000 pmol；HR率：20 pmol时约为100/1000 pmol的3倍
讨论与解读
本研究证明，直接tRNA-sgRNA融合（TG设计）在解脂耶氏酵母中实现了高效的CRISPR/Cas9基因组编辑。RNA二级结构预测揭示了当前T9G设计的关键缺陷——9核苷酸间隔序列附着于sgRNA 5′-端后，会破坏tracrRNA茎环1等关键结构元件，而茎环1和RAR双链对Cas9-sgRNA核蛋白复合物形成不可或缺。TG设计消除了这一干扰，使先前编辑失败或效率极低的染色体位点实现了高效基因整合与敲除。此外，修复模板的同源臂长度、递送形式及浓度均对编辑效率有显著影响，20 pmol删除模板浓度可获得最佳敲除效率。Borsenberger等（2018）曾通过TIDE分析证明直接tRNA-sgRNA融合具有更高的插入缺失基因型同质性和表型可预测性，并证实了tRNA 3′-端的精确切割释放下游sgRNA，与本研究结果相互印证。
编译者解读
本研究展示了计算预测驱动实验设计的典范路径——通过RNA二级结构预测精准定位了现有工具的效率瓶颈，并以最小改动（删除间隔序列）获得显著增益。从合成生物学应用角度看，该方法无需改造Cas9或筛选突变体，仅优化RNA元件设计即实现约10倍效率提升，具有高度可推广性。局限在于结构预测与体内效率的关联仍需更多位点验证，且修复模板参数优化仍依赖经验性筛选。该策略为其他HDR能力弱的工业菌株的基因编辑工具优化提供了可借鉴的思路。
参考来源
Abdel-Mawgoud A M. Improving CRISPR/Cas9-mediated genome editing efficiency in Yarrowia lipolytica using direct tRNA-sgRNA fusions. Metabolic Engineering, 2020. DOI: 10.1016/j.ymben.2020.07.008
DOI: 10.1016/j.ymben.2020.07.008