来源：Engineering Yarrowia lipolytica via ARTP mutagenesis to boost bioleaching from ion-adsorption type rare earth ore（Journal of Industrial and Engineering Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
稀土元素是高新技术产业不可或缺的战略资源，其中离子吸附型稀土矿中的中重稀土尤为珍贵。传统化学浸出法存在环境污染等问题，生物浸出因其绿色温和的特性受到广泛关注。本研究采用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术对解脂耶氏酵母进行定向育种，获得高产有机酸突变株Y7707，有机酸产量达35.48 g/L，较亲本菌株提高78.16%，稀土浸出效率达71.24%。通过比较基因组学揭示了产酸代谢、线粒体功能及跨膜转运相关关键基因的突变机制，为绿色高效稀土生物提取技术提供了新路径。
研究背景
稀土元素由15种镧系元素以及钪和钇组成，因其独特的物理化学性质和高科技应用被视为关键战略资源。中重稀土主要分布于中国南方的离子吸附型稀土矿中，储量极为稀缺且不可替代。这类矿床由花岗岩风化形成，稀土元素以水合离子或羟基水合离子形式吸附于黏土矿物表面。风化剖面由表土层（<1 m）、全风化层（1–15 m）、半风化层（15–30 m）和基岩构成，其中全风化层含有总稀土含量的80%以上，是稀土最富集的层位。矿中稀土主要以离子交换态存在，因此需要通过离子交换浸出而非物理选矿进行提取。
工业规模提取主要采用无机盐原地浸出法，但这类方法会产生含盐废水、导致土壤污染，且无法回收胶体态稀土。在"双碳"目标和生态发展战略引导下，开发绿色提取技术对稀土资源可持续生产至关重要。生物浸出方法具有反应条件温和、环境友好等优势，而通过ARTP诱变定向选育高效浸出菌株，可进一步提升生物浸出性能并阐明其强化机制。
研究方法
2.1 样品与菌株来源
实验所用矿物样品为离子吸附型稀土矿，经清除杂质后自然晒干。采用化学元素分析测定离子吸附型稀土矿中的稀土含量。总稀土含量为935 mg/kg，其中La（265.47 mg/kg）、Nd（241.23 mg/kg）、Ce（98.59 mg/kg）和Y（110.31 mg/kg）为含量最高的四种元素，合计约占总稀土含量的76%，符合离子吸附型稀土矿的典型特征。
实验所用解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）购自上海工伟科技有限公司。种子培养基成分为：葡萄糖20 g/L、酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L。鉴别培养基在固体培养基中添加溴甲酚绿0.25 g/L。发酵培养基成分为：葡萄糖60 g/L、酵母提取物0.5 g/L、蛋白胨0.5 g/L、硫酸铵1 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁1.5 g/L、氯化钙0.1 g/L、硫酸锌0.02 g/L。用0.3%硫酸溶液和2 mol/L氢氧化钠溶液调节pH。
【数据】总稀土含量：935 mg/kg；La：265.47 mg/kg；Nd：241.23 mg/kg；Ce：98.59 mg/kg；Y：110.31 mg/kg；种子培养基：葡萄糖20 g/L、酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L；鉴别培养基：溴甲酚绿0.25 g/L；发酵培养基：葡萄糖60 g/L、酵母提取物0.5 g/L、蛋白胨0.5 g/L、硫酸铵1 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁1.5 g/L、氯化钙0.1 g/L、硫酸锌0.02 g/L
2.2 ARTP诱变技术
ARTP诱变筛选过程为：将处于对数期的解脂耶氏酵母离心收集，在超净工作台内用生理盐水洗涤两次，稀释至细胞浓度为10⁶–10⁷，取10 μL细胞悬液均匀涂布于无菌金属载片上。将金属载片置于ARTP诱变育种仪中，诱变功率、气流量和照射距离分别设定为100 W、10 SLM和2 mm。照射时间根据致死率曲线选定。照射后，将金属载片置于含1 mL生理盐水的离心管中，充分振荡以确保载片上的细胞完全洗脱至离心管中。将悬液按不同浓度稀释后涂布于鉴别培养基上，于30 ℃培养。对照组为未经ARTP处理的悬液。致死率计算公式如下：
致死率（%）=（未诱变处理菌落数 − 诱变处理后菌落数）/ 未诱变处理菌落数 × 100%
【数据】诱变功率：100 W；气流量：10 SLM；照射距离：2 mm；细胞浓度：10⁶–10⁷；涂布量：10 μL；洗脱液：1 mL生理盐水；培养温度：30 ℃
2.3 突变株筛选
从诱变筛选平板上挑取单菌落接种至种子培养基，于30 ℃、220 rpm条件下培养24 h。将筛选出的菌落接种至发酵培养基中培养6 d，测定有机酸产量。以未接种培养基为对照。选择OD600值显著高于亲本菌株的阳性突变株，进行甘油管保藏并用于进一步筛选。将发酵液离心后，加入经紫外光照射的稀土矿，采用ICP-OES测定稀土浸出效率，以筛选具有产酸性能和浸出能力的突变株。
【数据】种子培养：30 ℃、220 rpm、24 h；发酵培养：6 d；筛选指标：OD600值、有机酸产量、REEs浸出效率
2.4 有机酸测定
采用高效液相色谱（HPLC）系统测定标准样品和发酵液中有机酸的类型和浓度。具体流程为：以反相C18柱（150 cm × 4.6 mm）为固定相，以甲醇、乙腈、水和磷酸盐缓冲液为流动相。使用示差折光检测器在波长215 nm处、流速1 mL/min条件下检测分析物。各有机酸的线性范围为10–500 mg/L。所有样品在HPLC分析前用流动相适当稀释，确保浓度落在线性范围内。计算发酵液中最终有机酸浓度时，乘以相应的稀释倍数。五种有机酸（柠檬酸（1）、苹果酸（2）、葡糖酸（3）、琥珀酸（4）和草酸（5））的标准曲线方程如下：
（1）y = 623715x + 90354，R² = 0.9999
（2）y = 843811x + 332333，R² = 0.9995
（3）y = 269229x + 72725，R² = 0.9998
（4）y = 299921x − 130372，R² = 0.9986
（5）y = 538956x + 1E+07，R² = 0.9937
【数据】色谱柱：C18柱（150 cm × 4.6 mm）；检测波长：215 nm；流速：1 mL/min；线性范围：10–500 mg/L；标准曲线R²：0.9937–0.9999
2.5 稀土浸出浓度测定
采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定稀土浓度。测试过程利用高温等离子体传输样品并产生特征光子辐射光谱，由半导体检测器检测光谱能量。上清液离心后稀释5倍。本实验中稀土浸出效率计算公式如下：
稀土浸出效率 = 浸出液浓度 / 3%硫酸铵浸出液浓度 × 100%
【数据】稀释倍数：5倍；参比：3%硫酸铵浸出液浓度
2.6 培养条件优化实验
将亲本菌株和突变株接种至种子培养基中，于220 rpm、30 ℃培养24 h。将含5%亲本和突变株的种子培养液接种于100 mL发酵培养基中发酵1–7 d。初始pH值设定为4、5、6、7，温度设定为25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，转速设定为120 rpm、180 rpm、220 rpm、260 rpm。每日定时测定OD600和有机酸浓度。
【数据】接种量：5%；发酵体积：100 mL；发酵时间：1–7 d；初始pH：4、5、6、7；温度：25、30、35、40 ℃；转速：120、180、220、260 rpm
2.7 浸出工艺及浸出优化实验
采用三种生物浸出方法浸出稀土，具体如下：
1）一步浸出法。将经紫外光照射的离子吸附型稀土矿与解脂耶氏酵母菌株混合共培养；
2）两步浸出法。待微生物生物量增加后，将经紫外光照射的离子吸附型稀土矿直接加入培养基中；
3）发酵上清液法（Spent medium method）。待微生物生物量增加后，离心取上清液，加入经紫外灭菌处理的离子吸附型稀土矿。
将5%解脂耶氏酵母接种至发酵培养基培养6 d后，离心获得发酵液上清液。液固比设定为2:1、4:1、8:1、10:1，温度设定为25、30、35、40 ℃，转速设定为120、180、220、260 rpm。
【数据】接种量：5%；发酵时间：6 d；液固比：2:1、4:1、8:1、10:1；温度：25、30、35、40 ℃；转速：120、180、220、260 rpm
2.8 比较基因组学测定
从固体培养基上挑取单菌落转移至液体培养基中，于30 ℃培养24 h至对数期。使用天根酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，操作按试剂盒说明书进行。DNA质量在1%琼脂糖凝胶上评估，浓度和纯度用Nanodrop分光光度计测定。测序委托北京擎科生物科技有限公司完成。全基因组测序在Illumina平台上进行。样品质控后，通过Covaris超声打断基因组DNA，再经末端修复、加A尾、连接接头和PCR扩增构建测序文库。构建的文库用Qubit 3.0定量，用Qsep100评估插入片段大小，并通过qPCR精确测定（>3 nM阈值）。合格文库经质控验证后在Illumina HiSeq X上测序。
【数据】培养条件：30 ℃、24 h；琼脂糖凝胶：1%；文库定量：Qubit 3.0；插入片段评估：Qsep100；qPCR阈值：>3 nM；测序平台：Illumina HiSeq X
研究结果
3.1 ARTP诱变剂量分析
ARTP诱变生物浸出技术与其他稀土提取方法的比较见表S1。与其他提取技术相比，ARTP诱变生物浸出技术在环境友好性、选择性浸出和工艺灵活性方面具有显著优势。因此，应用该技术强化生物浸出性能是可行的。
如图1A a所示，以诱变时间为横坐标、菌株致死率为纵坐标，得到解脂耶氏酵母致死率随诱变时间的变化及致死率曲线。如图1A b所示，当照射时间为75 s时，致死率达到79.30%；77 s时致死率为89.31%；79 s时致死率超过96.43%。研究表明90%致死率可达到最大突变效率，是正突变株筛选的最适阈值。因此，本研究采用的最佳处理时间为77 s。
【数据】75 s致死率：79.30%；77 s致死率：89.31%；79 s致死率：96.43%；最佳处理时间：77 s
3.2 突变株初筛与复筛
如图S1所示，选择生长快速、菌落形态大且在鉴别培养基上产生明显颜色变化的菌落进行后续实验。将突变株接种至发酵培养基，以解脂耶氏酵母Y1为对照。如图1B a和b所示，筛选出的四株突变株的有机酸浓度显著提高。具体而言，解脂耶氏酵母Y1的有机酸浓度为19.27 g/L，Y7704为31.43 g/L，Y7707为33.71 g/L，Y7708为30.59 g/L，Y7710为30.09 g/L。选择上述四株突变株进行进一步筛选和验证。
为避免假阳性和产酸不稳定的情况，需要对突变株的产酸能力进行进一步筛选。如图1B c所示，亲本菌株和突变株的有机酸浓度均随时间增加，在第6天达到最大值。突变株Y7707的有机酸浓度相对最高（32.46 g/L），较亲本菌株提高78.16%，与初筛结果一致。
突变株的稀土浸出效率如图1B d所示，Y7707的浸出效率相对最高（63.36%），较亲本菌株提高39.71%。综合有机酸和浸出实验发现，有机酸浓度越高，稀土浸出能力越强。研究表明，有机酸等代谢产物可降低体系pH值，从而促进稀土矿的溶解。在生物浸出过程中，酸解是生物浸出的主要机制，通过向稀土矿释放质子起作用。络合作用取决于溶液中稀土离子和阴离子的浓度，通过官能团与稀土形成可溶性络合物。螯合作用还能破坏稀土矿中化学键的稳定性，持续促进稀土的溶解。本实验选择Y7707突变株作为进一步研究的对象。
【数据】Y1有机酸：19.27 g/L；Y7704有机酸：31.43 g/L；Y7707有机酸：33.71 g/L（初筛）/32.46 g/L（复筛）；Y7708有机酸：30.59 g/L；Y7710有机酸：30.09 g/L；Y7707较亲本提高：78.16%；Y7707浸出效率：63.36%；较亲本提高：39.71%；最大产酸时间：第6天
3.3 突变株遗传稳定性
如图2A a所示，对Y1和Y7707菌株分别进行比较，两者主要产生苹果酸和柠檬酸。由于细胞具有自身修复机制，只有遗传特性稳定的菌株才能用于工业生产。因此，需要对Y1和Y7707进行连续传代培养，监测发酵过程中的有机酸浓度，验证遗传稳定性。如图2A b所示，Y1和Y7707的有机酸浓度保持相对稳定。如图2B a和b所示，细胞形态无明显变化，表明通过ARTP诱变获得的突变株具有良好的遗传稳定性。
【数据】主要有机酸类型：苹果酸、柠檬酸；传代中有机酸浓度：相对稳定；细胞形态：无明显变化
3.4 培养条件优化
pH、温度、转速等环境条件对解脂耶氏酵母的生长和有机酸代谢有显著影响。如图3所示，比较Y1和Y7707在不同初始pH、温度和转速条件下OD600值和有机酸浓度的变化，以获得相对最优的培养条件。
微生物在不同pH条件下分泌不同种类和浓度的代谢产物，生长活性也受到影响。如图3A所示，在初始pH为6时，Y1和Y7707的生长活性和有机酸浓度相对高于其他pH条件。Y1的最大有机酸浓度为20.30 g/L，Y7707为34.71 g/L。当初始pH为5时，OD600值出现相对明显下降。这可能是由于质子浓度增加可能破坏细胞膜完整性，损害营养吸收并诱导渗透胁迫，导致生长暂时受抑。这表明初始pH影响微生物细胞生长，过高或过低都会损害微生物的营养吸收和代谢产物分泌。
温度直接影响微生物的生长和代谢过程，从而影响有效代谢产物的分泌。如图3B所示，在30 ℃条件下，Y1和Y7707的生长活性和有机酸浓度相对高于其他温度条件。Y1的最大有机酸浓度为20.30 g/L，Y7707为34.71 g/L。
此外，解脂耶氏酵母作为严格好氧酵母，其代谢活性与培养环境中的氧浓度密切相关。如图3C所示，在转速180 rpm条件下，Y1和Y7707菌株的生长活性和有机酸浓度持续增加。Y1的最大有机酸浓度为20.63 g/L，Y7707为35.48 g/L。这可能是由于过高转速产生的高剪切力对剪切力敏感的微生物具有致死作用。
综上所述，在30 ℃、220 rpm、pH 6条件下，Y1和Y7707的生长活性和有机酸浓度在研究中相对最高。
【数据】最优初始pH：6；pH 6时Y1最大有机酸：20.30 g/L；pH 6时Y7707最大有机酸：34.71 g/L；最优温度：30 ℃；30 ℃时Y1最大有机酸：20.30 g/L；30 ℃时Y7707最大有机酸：34.71 g/L；180 rpm时Y1最大有机酸：20.63 g/L；180 rpm时Y7707最大有机酸：35.48 g/L；最优条件组合：30 ℃、220 rpm、pH 6
3.5 浸出条件优化
解脂耶氏酵母Y1和Y7707在三种浸出方法下的稀土浸出效率结果如图4A a1和b1所示。第3天，Y1在一步浸出法下的稀土浸出效率为20.11%（24.1 mg/L），两步浸出法下为25.08%（30.1 mg/L）。Y7707使用一步浸出法的稀土浸出效率为23.46%（28.2 mg/L），使用两步浸出法的稀土浸出效率为29.52%（35.4 mg/L）。第5天，Y1使用发酵上清液法的稀土浸出效率为45.63%（54.8 mg/L），Y7707为63.57%（76.28 mg/L）。这表明发酵上清液法表现出相对最佳的浸出性能。
浸出液的pH如图4A a2和b2所示。第5天，Y1和Y7707在发酵上清液法下的浸出液pH均为2.60。在浸出过程中，发酵上清液法避免了金属毒性。在一步法和两步法中，稀土矿和释放的稀土离子直接与微生物细胞接触，可能抑制微生物代谢和有机酸分泌。发酵上清液法将微生物菌株的培养与浸出过程分离，使菌株能够在无金属胁迫条件下产生更多关键代谢产物。此外，发酵上清液法避免了植物毒性（原文为"phy"结尾，根据上下文推断为"phytotoxicity"或类似表述，但原文截断，此处按原文内容忠实呈现——原文未完整给出，故仅翻译已给出的内容）。
【数据】第3天Y1一步法浸出效率：20.11%（24.1 mg/L）；第3天Y1两步法浸出效率：25.08%（30.1 mg/L）；第3天Y7707一步法浸出效率：23.46%（28.2 mg/L）；第3天Y7707两步法浸出效率：29.52%（35.4 mg/L）；第5天Y1上清液法浸出效率：45.63%（54.8 mg/L）；第5天Y7707上清液法浸出效率：63.57%（76.28 mg/L）；第5天上清液法浸出液pH：2.60（Y1和Y7707）
讨论与解读
本研究通过ARTP诱变技术获得高效突变株解脂耶氏酵母Y7707。与亲本菌株相比，Y7707有机酸产量提高78.16%，总稀土浸出效率提高39.71%。比较基因组分析鉴定出2163个SNP和1052个InDel突变，关键突变发生在gapA、thiC、CyoB/ClsC和SmeB/TonB基因中。这些遗传变异协同优化了碳代谢并增强了分泌能力，揭示了Y7707优异浸出性能的分子机制。本研究进一步建立了突变株有机酸代谢能力与浸出效率之间的直接相关性，为合理构建高效工程菌株提供了明确的基因改造靶点。未来研究应着重通过基因工程验证关键突变基因的功能，推进该工艺的工业规模放大，并利用代谢工程技术开发下一代高性能工程菌株。
【数据】SNP数量：2163个；InDel数量：1052个；关键突变基因：gapA、thiC、CyoB/ClsC、SmeB/TonB；有机酸产量提高：78.16%；总稀土浸出效率提高：39.71%
编译者解读
本研究将ARTP诱变技术系统性地引入稀土生物浸出领域，方法链条完整——从诱变剂量优化、高通量筛选到基因组机制解析，为解脂耶氏酵母的菌株改良提供了可复制的技术范式。发酵上清液法将菌株培养与浸出过程解耦，巧妙规避了金属离子对微生物的毒性抑制，这一工艺设计值得借鉴。然而，浸出周期较长（6天发酵+5天浸出）仍是工业化放大的瓶颈。后续若能结合关键突变基因（如gapA、SmeB/TonB）的定向改造，或可进一步缩短浸出时间、提高浸出效率。
参考来源
Zhou H. Engineering Yarrowia lipolytica via ARTP mutagenesis to boost bioleaching from ion-adsorption type rare earth ore. Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 2026. DOI: 10.1016/j.jiec.2026.07.036
DOI: 10.1016/j.jiec.2026.07.036