来源：Combining adaptive laboratory evolution and metabolic engineering for efficient erythritol production from crude glycerol by Yarrowia lipolytica（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
赤藓糖醇是一种天然零热量甜味剂，市场需求持续增长。本研究通过高渗胁迫下的适应性实验室进化（ALE），从解脂耶氏酵母中筛选出高产突变株Z，进而结合系统代谢工程改造，最终获得工程菌株Z12。该菌株以纯甘油为底物时赤藓糖醇产量达250.76 g/L，以粗甘油为底物时产量达232 g/L，均为目前报道的最高水平。研究展示了进化工程与理性设计的有效整合策略。
研究背景
赤藓糖醇作为一种广泛应用的功能性糖醇，具有零热量、清凉口感、对血糖浓度影响小及抗氧化特性，已广泛应用于食品甜味剂、制药和工业领域。2024年赤藓糖醇市场规模为2.756亿美元，预计2034年将达到约4.741亿美元。近期研究还揭示了其在储能材料和杀虫性能方面的新兴潜力，不断扩大的市场对赤藓糖醇产量和纯度提出了更高要求。
微生物发酵已成为赤藓糖醇工业生产的主要方式。解脂耶氏酵母因其公认安全（GRAS）地位、代谢稳健性、能利用多种碳源以及耐受高渗透压和低pH等优良工业特性，是赤藓糖醇生产的优良宿主。此外，该酵母遗传背景清晰，先进基因编辑工具进一步促进了高效代谢工程改造。然而，酵母将生物柴油副产物甘油转化为赤藓糖醇时，存在产量低和副产物积累的问题，限制了工业化应用。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
大肠杆菌JM109在LB培养基中于37°C、220 rpm条件下培养。LB培养基含10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，必要时添加100 μg/mL氨苄青霉素或50 μg/mL卡那霉素，固体平板添加15 g/L琼脂。酵母细胞在YPD培养基中培养，该培养基含20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖，培养条件为30°C、220 rpm。酵母转化子在YNB培养基上筛选，该培养基含6.7 g/L YNB、20 g/L葡萄糖、15 g/L琼脂，并添加0.1 g/L尿嘧啶或亮氨酸。URA3标记的反向筛选使用含2 g/L 5-氟乳清酸的YPD琼脂平板。本研究所构建和使用的所有菌株列于表1。
【数据】培养基：LB/YPD/YNB；温度：37°C（大肠杆菌）/30°C（酵母）；转速：220 rpm；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素或50 μg/mL卡那霉素；筛选添加物：0.1 g/L尿嘧啶或亮氨酸；反向筛选：2 g/L 5-氟乳清酸
2.2 质粒与菌株构建
本研究所用质粒构建方法已在前期研究中描述。内源基因：甘油激酶（GUT1）、磷酸二羟丙酮激酶（DAK2）、己糖激酶（HXK1）、阿拉伯糖醇脱氢酶（ADH1）、转酮醇酶（TKL）、赤藓糖还原酶（ER27和YPR1）从解脂耶氏酵母Po1f基因组扩增获得。质粒使用pEASY-Basic无缝克隆和组装试剂盒（TransGen Biotech，北京）构建。限制性内切酶购自Thermo Fisher Scientific（Waltham, MA），按制造商说明使用。PCR扩增使用TransStart KD Plus DNA聚合酶（TransGen Biotech）和2 × Rapid Taq Master Mix（Vazyme Biotech，南京）进行基因扩增和克隆验证。所有引物由擎科生物技术有限公司（北京）合成。质粒和引物列于表S1和S2。
基因GUT1、DAK2、ADH1和HXK1通过CRISPR/Cas9整合到解脂耶氏酵母基因组的A08、A1-2和XPR2位点。甘露醇脱氢酶（MDH2）基因的移码突变通过单gRNA质粒产生。TKL、YPR1和ER27的DNA片段分别克隆到pINA1312和pINA1269衍生质粒中。酵母转化使用Frozen-EZ Yeast Transformation II™试剂盒（Zymo Research, Irvine, CA）。阳性转化子通过PCR和测序验证。
【数据】整合位点：A08、A1-2、XPR2；基因：GUT1、DAK2、ADH1、HXK1、TKL、YPR1、ER27、MDH2；转化试剂盒：Frozen-EZ Yeast Transformation II™
2.3 适应性实验室进化
酵母细胞先在2 mL YPD培养基中活化，然后以初始OD600为0.4转接至胁迫培养基。为确定菌株YL7的适宜高渗条件，测试了含恒定25 g/L NaCl和不同甘油浓度（20、50和100 g/L）的胁迫培养基。基于干重显著下降和碳源利用明显减缓的观察结果，确定100 g/L甘油为施加渗透胁迫的最佳条件（图S1）。因此，YL7的ALE胁迫培养基配方为100 g/L甘油、25 g/L NaCl和1 g/L酵母提取物。在30°C、220 rpm条件下培养168 h后，将培养物涂布于YPD琼脂平板进行分离。挑选单菌落作为候选进化菌株。这些候选菌株进一步在摇瓶中培养并评估赤藓糖醇产量，以筛选最优菌株。
【数据】初始OD600：0.4；NaCl浓度：25 g/L；甘油浓度：20/50/100 g/L；培养时间：168 h；温度：30°C；转速：220 rpm
2.4 基因组DNA测序与变异发现
菌株YL7和Z的15 mL YPD培养物细胞沉淀通过200g离心5 min（4°C）收集。基因组DNA使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）方法提取。基因组DNA使用TruSeq Nano DNA HT Sample Prep Kit（Illumina，美国）测序。双端测序在Illumina NovaSeq平台（上海美吉生物医药科技有限公司，上海）上进行。用于比较和注释的参考基因组为解脂耶氏酵母CLIB89。SNPs和InDels使用sentieon基因组学工具中的Haplotyper和Gvcftyper程序检测。结构变异由Manta报告。拷贝数变异通过CNVkit检测。所有变异使用SnpEff进行注释。
【数据】离心条件：200g、5 min、4°C；测序平台：Illumina NovaSeq；参考基因组：Y. lipolytica CLIB89；分析工具：sentieon/Manta/CNVkit/SnpEff
2.5 摇瓶发酵
菌株从−80°C甘油保藏管中复苏，在YPD琼脂平板上划线，30°C培养2天。单菌落接种至2 mL YPD中培养24 h。随后，500 μL培养物转接至50 mL种子培养基YPG20中，该培养基含20 g/L甘油、10 g/L酵母提取物和20 g/L蛋白胨。种子培养在30°C、220 rpm条件下培养12 h。发酵在250 mL挡板摇瓶中进行，含50 mL EPF培养基，组成为100 g/L甘油、25 g/L NaCl、1 g/L酵母提取物、2.3 g/L (NH4)2SO4、1 g/L MgSO4·7H2O、0.23 g/L KH2PO4和3 g/L CaCO3，初始OD600为0.4。CaCO3单独分装。培养物在30°C、220 rpm条件下维持7天。所有摇瓶发酵实验使用三个独立的生物学重复。根据需要每24 h取样。
【数据】种子培养基：YPG20（20 g/L甘油、10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨）；种子培养：30°C、220 rpm、12 h；发酵培养基：EPF（100 g/L甘油、25 g/L NaCl、1 g/L酵母提取物、2.3 g/L (NH4)2SO4、1 g/L MgSO4·7H2O、0.23 g/L KH2PO4、3 g/L CaCO3）；初始OD600：0.4；发酵时间：7天；温度：30°C；转速：220 rpm；生物学重复：3次
2.6 5-L生物反应器发酵
预培养程序与摇瓶方法相同。种子培养在30°C、220 rpm条件下培养24 h，然后以10%（v/v）接种量接种至含3 L发酵培养基的5-L生物反应器（百仑生物科技，江苏）中，初始OD600达到0.9–1.0。纯甘油培养基含300 g/L或400 g/L甘油、25 g/L NaCl、10 g/L酵母提取物、4.6 g/L (NH4)2SO4、1 g/L MgSO4·7H2O和0.23 g/L KH2PO4。粗甘油培养基含350 g/L或400 g/L粗甘油（纯度88.5%，密度1.263 g/mL）、25 g/L NaCl、10 g/L酵母提取物、4.6 g/L (NH4)2SO4、1 g/L MgSO4·7H2O和0.23 g/L KH2PO4。培养条件设置如下：温度30°C、搅拌速度800 rpm、通气量4 vvm。培养基初始pH不控制，自然降至3后，通过4 M HCl和4 M NaOH维持pH为3。发酵进行144 h，尾气连接冷凝器以减少水分蒸发。每24 h收集2 mL样品进行分析。
【数据】接种量：10%（v/v）；工作体积：3 L；初始OD600：0.9–1.0；纯甘油浓度：300/400 g/L；粗甘油浓度：350/400 g/L（纯度88.5%，密度1.263 g/mL）；NaCl：25 g/L；酵母提取物：10 g/L；(NH4)2SO4：4.6 g/L；MgSO4·7H2O：1 g/L；KH2PO4：0.23 g/L；温度：30°C；转速：800 rpm；通气量：4 vvm；pH：3（4 M HCl/NaOH维持）；发酵时间：144 h
2.7 发酵参数测定
发酵后，2 mL样品以12,000 rpm离心10 min。细胞上清液适当稀释后用高效液相色谱（HPLC）分析。细胞沉淀洗涤两次，105°C干燥24 h，称重测定干重（DCW）。甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇和甘露醇使用配备示差折光检测器（RID）的Agilent 1260 HPLC系统定量。RID温度为50°C。分离在Aminex HPX-87H色谱柱（300 mm × 7.8 mm；Bio-Rad）上进行，使用5 mM H2SO4作为流动相，流速0.4 mL/min，柱温50°C。比生长速率（μ）和比甘油消耗速率（qgly）根据Yang等（2014）的方法计算，但DCW被OD600替代，因为不溶性CaCO3妨碍了DCW的准确测定。细胞生长以OD600对培养基空白监测。因此，qgly以g·L−1·h−1·OD600−1报告。赤藓糖醇对甘油的得率和赤藓糖醇的生产率按Rywinska等（2015）描述的方法计算。组间显著差异通过T检验确定。
【数据】离心：12,000 rpm、10 min；干燥：105°C、24 h；HPLC系统：Agilent 1260 + RID（50°C）；色谱柱：Aminex HPX-87H（300 mm × 7.8 mm）；流动相：5 mM H2SO4；流速：0.4 mL/min；柱温：50°C；统计方法：T检验
研究结果
3.1 通过ALE筛选赤藓糖醇产量提高的突变株
ALE是微生物菌株开发、发酵性能提升和抗逆性改良的有力工具，为在特定选择压力下获得理想表型提供了定向策略。在100 g/L甘油和25 g/L NaCl施加的渗透胁迫下，我们使用168 h ALE分离出赤藓糖醇产量提高的解脂耶氏酵母突变株（图1a）。
值得注意的是，菌株YL7暴露于高渗胁迫后，观察到两种表型明显可区分的变体。突变株Z形成奶油色、粗糙、皱褶的菌落，主要表现为酵母形态细胞；而突变株M呈现白色、丝状菌落，完全由延长的菌丝组成（图1b）。摇瓶发酵显示，菌株Z和M从100 g/L甘油中分别产生25.84 g/L和21 g/L赤藓糖醇，较亲本菌株YL7分别提高66%和35%（图1c）。
重要的是，两个突变株在YPD平板上连续传代三次（无渗透胁迫）后，均保持稳定的菌落形态和赤藓糖醇产量（图S2），表明自发适应成功且表型稳定。酵母样形态不仅与改善的产物合成相关，而且更适合工业发酵。因此，选择菌株Z进行进一步分析。
在EPF培养基中比较了YL7和Z菌株的生长曲线以评估适应指标。菌株YL7表现出较长的延滞期，24 h时OD600仅为0.63（图1d）。qgly峰值在144 h达到0.118 h⁻¹（图1e）。相比之下，突变株Z在早期生长阶段快速消耗甘油用于生物量积累，24 h时OD600达到2.9（图1d），相应的最大比生长速率μ为0.083 h⁻¹（图1e）。其比甘油消耗速率（qgly）在72 h达到峰值0.138 h⁻¹，并在8天内完全利用100 g/L甘油。YL7在早期培养阶段较慢的甘油同化和生长可能反映了其在高渗条件下更强的生理抑制。相比之下，ALE来源的菌株Z表现出显著增强的生长动力学。
为确定突变株Z的生长优势在不同条件下是否一致，将菌株Z和YL7在添加不同NaCl浓度的丰富YPG培养基中培养。突变株Z始终表现出优异的生长，特别是在较高盐胁迫下（图S3）。总体而言，菌株Z在生长和甘油利用方面均优于YL7。这些结果表明，即使仅168 h的ALE也能在特定选择压力下快速产生性能更优的突变菌株。酿酒酵母中也报道了类似的快速适应，其多细胞"雪花"表型仅在选择7天后出现。需要指出的是，本研究在单一固定渗透压条件下应用ALE作为初步尝试，而逐步增加渗透压或连续传代等常规策略有望进一步探索。
【数据】赤藓糖醇产量：菌株Z 25.84 g/L、菌株M 21 g/L、菌株YL7约15.56 g/L（推算）；产量提升：66%（Z）和35%（M）；OD600（24 h）：YL7为0.63、Z为2.9；μ最大值：0.083 h⁻¹（Z）；qgly峰值：0.118 h⁻¹（YL7，144 h）、0.138 h⁻¹（Z，72 h）；甘油完全利用时间：8天
3.2 突变株Z的基因组变异特征
鉴于ALE持续时间较短，观察到的适应可能源于生理驯化。为区分遗传进化与这种瞬时反应并鉴定潜在突变，对亲本菌株YL7和ALE来源突变株Z进行了全基因组测序（WGS）。共检测到628个遗传变异。如图2a所示，单核苷酸多态性（SNPs）和小片段插入/缺失（InDels）构成最丰富的变异类别（n = 617）。虽然分布在各染色体上，但SNPs/InDels特别集中在1号染色体和5号染色体中央区域。相比之下，涉及大片段基因组重排的结构变异（SVs）和拷贝数变异（CNVs）相对稀少（图2b）。
菌株Z与YL7的差异包括5个SVs（4个缺失和1个倒位）和6个CNVs（4个重复和2个缺失）。CNV重复主要定位于染色体末端区域，大小约为5至30 kb。为进行功能分析，使用KEGG和GO数据库对变异进行注释。KEGG通路注释和分类如图2c所示，翻译通路富集程度最高，涉及14个基因。详细分析显示，所有相应变异都定位到基因上游区域，提示其表型影响可能通过基因表达介导。
GO注释方面，选择包含4个以上基因的条目（图2d）。细胞组分（CC）类别最丰富，包含162个条目。在CC类别中，与膜相关的基因（GO:0016020）代表最大子集，共66个基因。这种GO:0016020富集与先前在甘油压力下进行的ALE研究观察结果一致。膜相关变异的高频率表明膜功能改变是关键驱动因素。这可能解释了观察到的形态变化，更重要的是，增强了细胞在胁迫下的渗透调节和底物运输。这些综合适应最终可能改善细胞生长和赤藓糖醇产量。
推定影响分析显示，仅7.6%的变异被归类为高影响，其余变异被分配至中等、低、修饰因子或其他推定影响类别。在蛋白编码区变异中，基因YALI1A06530g因SV中存在36个氨基酸缺失而引人注目，其编码序列内含有31个SNPs/InDels位点，其中5个被预测具有高功能影响。然而，该基因目前在公共数据库中缺乏功能注释。
另一个发现是菌株Z中两个热休克蛋白70（HSP70）相关基因的破坏性突变。YALI1E41647g在其终止密码子附近携带65-bp SV缺失，YALI1E00115g通过SNPs/InDels积累移码突变。HSP是一类进化上保守的、普遍存在的分子伴侣，在多种生物过程中发挥关键作用，包括促进多肽折叠、介导跨膜转运以及通过多种机制影响mRNA代谢。此外，HSPs促进酿酒酵母热应激后的恢复，并在解脂耶氏酵母高渗胁迫下在转录组和蛋白质组水平均上调。鉴于HSPs在急性应激反应中的已知作用，HSP70相关基因中的这些破坏性突变出乎意料，可能反映了适应高渗环境过程中蛋白质稳态网络的重构，而非简单的功能获得或丧失。
然而，突变株Z的改良表型可能源于多个调控和编码变异的耦合效应。这种复杂性在一项前期研究中得到例证，该研究对五个已鉴定突变进行逆向代谢工程未能重现高产表型，证实适应性突变通常作为相互依赖的网络而非加性基因发挥作用。这些发现强调了仅依赖WGS进行理性通路工程的固有局限性。因此，未来工作需要更深入地研究适应性突变之间的协同相互作用。
【数据】遗传变异总数：628；SNPs/InDels：617；SVs：5（4个缺失、1个倒位）；CNVs：6（4个重复、2个缺失）；CNV重复大小：约5–30 kb；翻译通路富集基因数：14；膜相关基因（GO:0016020）：66个；高影响变异比例：7.6%；YALI1A06530g：36个氨基酸缺失、31个SNPs/InDels位点、5个高影响位点；YALI1E41647g：65-bp SV缺失；YALI1E00115g：移码突变
3.3 工程菌株的构建与摇瓶发酵评估
基于突变株Z的基因组分析结果，对菌株Z进行了系统代谢工程改造。改造策略包括：提高甘油利用效率（过表达GUT1、DAK2、HXK1）、减少竞争性糖醇合成（破坏MDH2、ADH1）、补充营养缺陷型标记以及增强前体供应（过表达TKL、YPR1、ER27）。图3a展示了从甘油到赤藓糖醇的生物合成途径及途径简化策略。
通过逐步整合上述遗传改造，构建了一系列工程菌株。摇瓶发酵评估结果显示，在150 g/L甘油条件下，工程菌株Z7、Z8、Z11和Z12的赤藓糖醇产量逐步提高（图4a）。甘油消耗的时间曲线显示，工程菌株比亲本突变株Z具有更快的甘油利用速率（图4b）。其中，菌株Z12表现出最优的赤藓糖醇生产性能。
【数据】甘油浓度：150 g/L；工程菌株：Z7、Z8、Z11、Z12
3.4 不同发酵条件下工程菌株的赤藓糖醇生产评估
为进一步优化赤藓糖醇生产，在不同发酵条件下评估了工程菌株的生产性能。在150 g/L甘油条件下，菌株Z、Z7、Z8、Z11和Z12的摇瓶发酵结果显示（图4a），逐步代谢工程改造显著提高了赤藓糖醇产量。甘油消耗时间曲线（图4b）显示工程菌株具有更快的底物利用速率。
在5-L生物反应器中进行了两阶段补料分批发酵。在纯甘油条件下（图5a），当甘油浓度为300 g/L时（图5b），菌株Z12的赤藓糖醇产量达到250.76 g/L。当甘油浓度提高至400 g/L时（图5c），产量略有变化。在粗甘油条件下，菌株Z12利用350 g/L或400 g/L粗甘油（纯度88.5%）进行发酵，赤藓糖醇产量达到232 g/L。整个发酵过程中未检测到多元醇副产物积累。
【数据】纯甘油发酵：300 g/L甘油条件下赤藓糖醇产量250.76 g/L；粗甘油发酵：赤藓糖醇产量232 g/L；副产物：未检测到多元醇积累；生物反应器：5-L；发酵时间：144 h；pH：3；温度：30°C；转速：800 rpm；通气量：4 vvm
讨论与解读
本研究成功将ALE与系统代谢工程相结合，构建了高性能工程菌株Z12。利用甘油作为廉价原料，该菌株在不积累任何多元醇副产物的情况下实现250.76 g/L的高赤藓糖醇产量，显著提高了产物纯度和下游分离的经济可行性。同时，Z12利用粗甘油生产232 g/L赤藓糖醇，实现了工业废弃物的资源化利用。这项工作不仅提供了具有工业应用前景的赤藓糖醇生产策略，更重要的是，展示了将进化工程与理性设计相结合用于改造非常规酵母的有力方法。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于"先进化、后解析、再改造"的技术路线——先用ALE快速获取目标表型，再通过全基因组测序解析变异基础，最后用代谢工程将有益突变固化并延伸。这种策略规避了传统理性设计对通路认知的依赖，特别适合底盘细胞抗逆机制复杂、多基因协同作用的场景。不过，ALE获得的表型优势往往源于多基因互作网络，单点逆向工程难以完全重现，这在本研究对HSP70突变的分析中也有体现。未来若能将ALE与高通量筛选及机器学习相结合，有望进一步缩短育种周期。从产业化角度看，Z12在粗甘油上的232 g/L产量和零副产物积累极具吸引力，但800 rpm转速和4 vvm通气量在放大规模时的能耗成本仍需评估。
参考来源
Zhao, L.-X. (2026). Combining adaptive laboratory evolution and metabolic engineering for efficient erythritol production from crude glycerol by Yarrowia lipolytica. Journal of Biotechnology. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.08.006
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.08.006