来源：Optimized genome-wide CRISPR screening enables rapid engineering of growth-based phenotypes in Yarrowia lipolytica（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是工业生物技术领域的重要非常规酵母，但其全基因组CRISPR筛选长期受限于sgRNA活性不均与文库覆盖不足。本研究利用DeepGuide活性预测算法与约5万条已知活性sgRNA数据集，设计出仅需3倍覆盖即可靶向98.8%基因的紧凑型高活性文库（23,900条sgRNA），并成功用于乙酸及多种烃类底物的耐受性基因鉴定。该工作为工业菌株的快速工程改造提供了高效筛选工作流。
研究背景
高通量功能基因组筛选是优化酵母生产菌株的核心工具。通过筛选与特定表型（如抗微生物耐药性、乙醇耐受性、形态变化等）相关的基因型，功能基因组筛选能够解析与特定细胞功能相关的编码及调控序列。酿酒酵母、解脂耶氏酵母、白色念珠菌及巴斯德毕赤酵母等均已开展全基因组筛选，以深入理解具有工业意义的代谢通路，并取得了提高胁迫耐受性、改善蛋白生产与分泌、拓展替代营养源利用等成果。CRISPR编辑方法（包括CRISPR敲除）的引入极大推动了该领域的发展。然而，全基因组筛选仍面临sgRNA活性差异大、基因组覆盖度不足、转化效率需维持高水平以保证文库完整代表性等设计挑战——这些问题在具有优良工业性状的非常规酵母中尤为突出。本研究针对产油酵母解脂耶氏酵母，设计了一个紧凑型高活性全基因组sgRNA文库，并以其为工具鉴定了与乙酸及多种烃类底物耐受性相关的基因靶点。
研究方法
4.1 微生物菌株与培养条件
本研究使用的所有菌株列于表S1。解脂耶氏酵母PO1f（MatA, leu2-270, ura3-302, xpr2-322, axp-2）为本研究中所有突变体的亲本菌株。除非另有说明，所有酵母培养均在14 mL聚丙烯管或250 mL挡板摇瓶中进行，培养箱条件为30°C、220 RPM。在非选择性条件下，解脂耶氏酵母在YPD培养基（1% Bacto酵母提取物、2% Bacto蛋白胨、2%葡萄糖）中培养。携带sgRNA表达质粒的细胞首先在亮氨酸缺陷型合成定义培养基（SD-leu；0.67% Difco酵母氮碱基（不含氨基酸）、0.069% CSM-leu（Sunrise Science, San Diego, CA）、2%葡萄糖）中培养两天，以允许基因组编辑发生。所有质粒构建和繁殖均在大肠杆菌TOP10中进行。大肠杆菌在含100 mg/L氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）肉汤中、37°C、14 mL聚丙烯管中、220 RPM条件下培养。使用Zymo Research Plasmid Miniprep Kit II从大肠杆菌培养物中提取质粒。
【数据】菌株：Y. lipolytica PO1f（MatA, leu2-270, ura3-302, xpr2-322, axp-2）；培养基：YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）、SD-leu（0.67% YNB、0.069% CSM-leu、2%葡萄糖）；温度：30°C（酵母）、37°C（大肠杆菌）；转速：220 RPM；抗生素：100 mg/L氨苄青霉素；时间：2天（SD-leu培养）
4.2 质粒构建
本研究中使用的所有质粒和引物列于表S2和S3。用于敲除解脂耶氏酵母PO1f基因的质粒构建方法为：将相应的sgRNA作为引物（表S4）订购，其两端各含20 bp与pSC012质粒中AvrII酶切位点上下游同源的序列。订购60 bp的正义链和反义链并退火。退火产物与酶切后的质粒以10:1的摩尔比（插入片段:载体）进行Gibson Assembly组装。组装产物直接转化至电转感受态大肠杆菌TOP10细胞中，随后进行繁殖和Miniprep提取。
【数据】同源臂长度：20 bp；组装摩尔比：10:1（插入片段:载体）；宿主菌：大肠杆菌TOP10
4.3 解脂耶氏酵母CRISPR敲除
含有Cas9及相应sgRNA（pSC012）的质粒按照Chen等人（1997）描述的方案转化至解脂耶氏酵母中。简言之，将目标背景菌株的单菌落接种于14 mL培养管中的2 mL YPD液体培养基中，30°C、220 RPM振荡培养22–24小时（最终OD约30）。取300 μL培养物（约10⁸细胞），4,000g离心2分钟收集细胞，然后重悬于300 μL转化缓冲液中。转化缓冲液含有终浓度45% PEG 4000、0.1 M醋酸锂和100 mM二硫苏糖醇。随后加入500 ng质粒DNA，再加入8 μL 10 mg/L ssDNA（Agilent）。反应混合物充分涡旋混匀，39°C孵育1小时。加入1 mL水，离心收集细胞，接种于2 mL SD-ura选择性液体培养基中。3天后，以10⁻⁶稀释度涂布于YPD平板上。30°C孵育一天后进行菌落PCR和Sanger测序，以鉴定移码突变基因敲除体。
【数据】培养体积：2 mL YPD；温度：30°C；转速：220 RPM；时间：22–24 h（培养）、1 h（热激）、3天（SD-ura选择）；OD：约30；细胞量：约10⁸；离心：4,000g、2 min；转化缓冲液：45% PEG 4000、0.1M醋酸锂、100 mM DTT；质粒DNA：500 ng；ssDNA：8 μL（10 mg/L）；热激温度：39°C；稀释度：10⁻⁶
4.4 sgRNA文库设计
使用定制的MATLAB脚本设计优化型Cas9文库，本文报告其关键设计要素。优化型文库针对解脂耶氏酵母CLIB89基因组（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_001761485.1）中全部7919个mRNA编码基因各设计3条sgRNA。这3条sgRNA中，2条拟从先前Cas9筛选（Schwartz等人，2019）中表现最佳的sgRNA池中选取，第3条由DeepGuide预测设计。首先，将Schwartz等人Cas9筛选中CS > 4.0的sgRNA从高到低排序，鉴定出每个基因的最佳2条sgRNA。所有基因的第3条sgRNA，以及那些没有两条高活性sgRNA（CS > 4.0）的基因的补充sgRNA，均来自DeepGuide对该基因的最佳预测。优化型文库中的所有sgRNA均经验证含有独特的种子序列（靠近PAM的11个核苷酸）。文库中还包含360条非靶向sgRNA。通过确保sgRNA的前12个核苷酸不映射到任何基因组位点，确认这些指导RNA不靶向基因组中任何位置。
【数据】靶基因数：7919个mRNA编码基因；每条基因sgRNA数：3条；文库总sgRNA数：23,900条（含360条非靶向）；CS阈值：>4.0；种子序列长度：11 nt；非靶向验证：前12 nt不映射基因组
4.5 sgRNA文库克隆
靶向PO1f蛋白编码基因的Cas9文库以寡核苷酸池形式从Agilent Technologies Inc.订购，并使用Agilent SureVector CRISPR（部件号G7556A）在实验室内部克隆。文库经NextSeq测序以检测各sgRNA的折叠覆盖度和偏斜。克隆DNA转化至NEB 10-beta大肠杆菌并涂板。每个文库进行足够的电穿孔以获得>100X文库覆盖度。短暂增菌后从转化细胞中分离质粒文库。优化型Cas9文库的克隆使用Agilent SureVector CRISPR Library Cloning Kit（部件号G7556A）完成。简言之，骨架pCas9yl-GW经线性化并用引物InversePCRCas9Opt-F和InversePCRCas9Opt-R进行PCR扩增。为验证完全线性化的载体，对扩增产物进行DpnI消化，用Beckman AMPure XP SPRI磁珠纯化产物，并转化至大肠杆菌TOP10细胞。无菌落出现表明无完整骨架污染。随后使用引物OLS-F和OLS-R，按照供应商说明用Q5高保真聚合酶对文库ssDNA寡核苷酸进行15个循环的PCR扩增。扩增产物在进入下一步前用AMPure XP磁珠进行纯化。sgRNA文库克隆在四个重复管中进行，随后合并并按制造商说明进行纯化。制备一瓶含1L LB培养基和3 g高级低熔点琼脂糖的扩增瓶，高压灭菌并冷却至37°C（Agilent，目录号#5190-9527）。使用Agilent ElectroTen-Blue细胞（目录号#200159）通过电穿孔（0.2 cm比色杯，2.5 kV，1次脉冲）进行十次克隆文库转化。细胞在SOC培养基（2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl₂、10 mM MgSO₄和20 mM葡萄糖）中于37°C恢复并增菌1小时。转化的大肠杆菌细胞随后接种至扩增瓶中，培养两天直至基质中出现可见菌落。通过离心收集菌落，并接种两个250 mL LB培养物进行第二次扩增步骤。4小时后收集细胞，使用ZymoPURE II Plasmid Gigaprep Kit（目录号#D4202）分离合并的质粒文库，获得约1.8 mg编码优化型Cas9 sgRNA文库的质粒DNA。文库经NextSeq测序以检测各sgRNA的折叠覆盖度和偏斜。
【数据】PCR循环数：15；电穿孔条件：0.2 cm比色杯、2.5 kV、1次脉冲；文库覆盖度：>100X；扩增瓶：1L LB + 3 g低熔点琼脂糖；SOC培养基成分：2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl₂、10 mM MgSO₄、20 mM葡萄糖；温度：37°C；时间：1 h（恢复）、2天（首次扩增）、4 h（二次扩增）；质粒产量：约1.8 mg
4.6 解脂耶氏酵母文库转化
sgRNA质粒文库向PO1f和PO1f Cas9A08细胞的转化按照Chen等人（1997）描述的方法并加以修改完成。对于每种目标菌株，取7个14 mL培养管，每管含2 mL YPD，各接种该菌株的单菌落，在14 mL管中于30°C、225 RPM振荡培养22–24小时（最终OD约30）。随后合并培养物，取750 μL等分试样分装至12个1.5 mL离心管中。离心（4,000g）收集细胞，用超纯水洗涤，再次离心，每管重悬于Chen转化缓冲液（53% PEG 4000 w/v、0.1 M醋酸锂、0.1 M DTT）中。每管依次加入3 μL载体DNA（ThermoFisher鲑鱼精子DNA，剪切型，10 mg/mL）和文库质粒储备液（每管1 μg质粒）。轻轻混匀各管，39°C热激1小时进行转化。每管加入1 mL新鲜水回收细胞，离心并吸弃上清。将所有12个沉淀重悬于1 mL新鲜水中，然后合并。将转化产物的稀释液（0.1%、0.01%和0.001%）涂布于固体SD-leu培养基上以计算转化效率……
【数据】培养体积：2 mL YPD/管×7管；温度：30°C；转速：225 RPM；时间：22–24 h；OD：约30；离心：4,000g；转化缓冲液：53% PEG 4000 w/v、0.1M醋酸锂、0.1M DTT；载体DNA：3 μL（10 mg/mL）；质粒：1 μg/管；热激：39°C、1 h；稀释度：0.1%、0.01%、0.001%
研究结果
2.1 紧凑型CRISPR-Cas9文库含有高活性sgRNA
在先前创建的6倍覆盖文库基础上迭代，我们力求创建一个最小规模的高活性"v2"文库。高活性使数据更可信，而较小的规模降低了实现高覆盖文库所需的转化负担。我们设计了一个3倍覆盖的CRISPR-Cas9文库，靶向解脂耶氏酵母PO1f菌株的所有蛋白编码序列。该文库由来自Schwartz等人（2019）设计的现有解脂耶氏酵母CRISPR-Cas9文库（记为"v1"）的高活性sgRNA与活性预测工具DeepGuide（Baisya等人，2022）预测为高活性的sgRNA组合而成（图1a和b）。
先前在解脂耶氏酵母PO1f菌株中使用v1文库进行的生长筛选为每条sgRNA定义了一个称为切割评分（CS）的指标——衡量其切割效率——通过比较sgRNA在PO1f Cas9 ΔKU70菌株与不含Cas9的对照菌株中的丰度获得。在实验菌株中成功切割的指导RNA会随着细胞死亡而耗竭，因为KU70的破坏抑制了非同源末端连接——解脂耶氏酵母中主要的DNA修复机制——而未发生切割的指导RNA则会富集。通过比较每条指导RNA在实验菌株与对照菌株中的丰度，即可计算CS。v1文库的sgRNA序列以及解脂耶氏酵母PO1f的MNase-seq核小体占据数据作为DeepGuide sgRNA预测的输入数据。核小体占据被纳入DeepGuide计算，因为高核小体占据可通过物理阻断Cas9-sgRNA复合物与DNA结合而抑制Cas9切割活性。
为了挑选v2文库的sgRNA，首先将v1文库过滤，仅保留CS大于4.0的sgRNA（该值接近Ramesh等人先前确定的高活性sgRNA最优CS阈值）。v2文库因此设计为包含来自过滤后v1文库的每个基因CS > 4.0的前两条最佳指导RNA，以及该基因DeepGuide预测CS最高的一条指导RNA。如果某个基因在v1文库中CS > 4.0的sgRNA少于2条，则纳入相应数量的DeepGuide预测CS高的sgRNA，以维持3倍的文库覆盖度（见材料与方法）。最终文库包含每个基因3条sgRNA，靶向99.8%的基因（图S1a）。
除了使用DeepGuide预测CS等设计标准来挑选指导RNA外，我们还确保最终文库中的每条sgRNA在基因组中具有唯一性、不靶向内含子区域，并且与靶向同一基因的其他sgRNA在空间上分开，以最大化所产生敲除体的多样性，更多细节见Ramesh和Wheeldon（2021）及Trivedi等人（2023）。此外，对克隆的未转化文库进行下一代测序显示sgRNA丰度呈紧密的正态分布，表明文库中指导RNA的分布接近均匀且对称（中位数≈平均值）（图S1b）。
v2文库的sgRNA切割评分使用与获得v1文库指导RNA CS相同的筛选框架生成。v2文库中所有指导RNA的CS见补充文件1。除基因靶向指导RNA外，v2文库还包含360条非靶向sgRNA（约占文库总量的1.5%），作为阴性对照。靶向和非靶向sgRNA的归一化CS（即指导RNA原始CS与非靶向指导RNA平均CS之差）分布在第2天几乎重叠（平均CSnorm，靶向 = 0.12 ± 0.09；平均CSnorm，非靶向 = 0 ± 0.06），因为CRISPR诱导的双链断裂对细胞生长无可观察效应。然而在第4天，两个群体明显分离（平均CSnorm，靶向 = 5.96 ± 2.04；平均CSnorm，非靶向 = 0 ± 0.34），表明靶向和非靶向指导RNA具有不同的活性谱（图1c）。v2文库中靶向与非靶向群体之间的差异在统计学上显著高于v1文库（单尾非配对t检验p < 0.0001，t值 = 58.81对比43.49），为v2文库是比v1文库更高活性的文库提供了证据（图1d）。同样值得注意的是用于构建v2文库的实验验证和DeepGuide预测sgRNA的基因组位点在基因组中均匀分布（图1e）。
这些数据表明我们构建了一个紧凑的高活性文库，可用于解脂耶氏酵母的功能基因组筛选。小规模使得由于较低的转化负担而实现高文库覆盖度，高活性则允许近乎完全保证基因组覆盖。
【数据】文库覆盖度：3倍（v2）对比6倍（v1）；基因覆盖：99.8%；CS阈值：>4.0；非靶向sgRNA：360条（约1.5%）；第2天CSnorm：靶向0.12±0.09、非靶向0±0.06；第4天CSnorm：靶向5.96±2.04、非靶向0±0.34；t检验：p<0.0001，t值58.81（v2）对比43.49（v1）
2.2 乙酸耐受性筛选鉴定改善生长的基因靶点
手握优化型全基因组CRISPR文库，我们接下来着手鉴定在乙酸上生长所必需的基因。使用补充了三种不同碳源的极限培养基进行功能基因组筛选——葡萄糖（0.125 M）作为对照条件，低和高乙酸（分别为0.25和0.5 M）作为实验条件（图2a）。这些筛选使我们能够计算每种培养基条件下每条sgRNA的适应度评分（FS）。高FS值表明该基因的敲除赋予适应度优势（前提是发生切割）。相反，低FS值表明由于靶基因被破坏而导致细胞适应度下降。FS以PO1f Cas9菌株中sgRNA丰度与PO1f对照菌株中丰度之比的对数（log2）计算。
我们使用acCRISPR——一种CRISPR筛选分析流程，可根据筛选中使用的每条指导RNA的活性校正筛选结果——来鉴定葡萄糖中的必需基因，以及两种乙酸条件下的高、低FS值基因。分析流程鉴定出以葡萄糖为唯一碳源生长所需的1580个必需基因，而我们的v1文库鉴定出1903个；这些必需基因中有1214个重叠。我们分别发现868个和901个分别降低或改善乙酸生长的基因（图2b）。
尽管v2文库主要包含高活性切割子，我们仍希望确保筛选流程末端几乎不产生假阳性结果。为此，我们使用高活性（CS > 1.5）的指导RNA来判定命中基因（图2c）。这将两种乙酸条件之间的共同显著基因集缩减至428个（13个高FS值和415个低FS值）。细胞中发生的任何双链断裂至少会引起适度的适应度效应。此外，解脂耶氏酵母中可能很少有基因敲除能改善乙酸耐受性。这些原因可能解释了我们移除低靶向指导RNA后阳性FS命中基因损失86%的现象（高FS从94降至13）。这些假阳性代表对照菌株细胞未经历双链断裂的适应度劣势。
接下来，我们想排除任何在葡萄糖培养基中降低适应度的显著基因。我们推断最相关的命中基因应仅归因于乙酸适应度效应，而非整体适应度。葡萄糖生存力在上游应用中也很重要——用于进行进一步的菌株修饰——以及下游应用中——如果需要补充葡萄糖来增加细胞内还原力。因此，我们从乙酸的显著基因列表中排除了在葡萄糖中被鉴定为必需的基因，进一步将共同显著基因集压缩至47个基因。这47个基因中有13个具有正FS值……
【数据】碳源条件：0.125 M葡萄糖、0.25 M乙酸、0.5 M乙酸；必需基因数（葡萄糖）：1580（v2）对比1903（v1），重叠1214；乙酸降低生长基因：868个；乙酸改善生长基因：901个；CS阈值：>1.5；共同显著基因集：428个（13个高FS + 415个低FS）；阳性FS命中损失：86%（94→13）；最终共同显著基因集：47个（13个正FS）
讨论与解读
原文讨论要点
全基因组CRISPR筛选在解脂耶氏酵母等工业宿主中的应用能够实现基于生长的表型的快速工程改造。此前开发的v1文库含有活性范围广泛的sgRNA，需要6倍覆盖才能覆盖基因组中几乎所有基因。本研究创建的新优化型高活性sgRNA文库规模紧凑，仅需3倍基因组覆盖即可靶向98.8%的基因。将文库规模减半，降低了产生需要高转化效率才能获得的大型文库的负担。对文库中每条指导RNA活性的定量显示，除少数几条外，所有指导RNA均具有高活性。紧密的正态分布指导RNA活性使得高精度筛选成为可能，因为所有（或几乎所有）指导RNA都可用于鉴定基因命中。该优化型CRISPR-Cas9筛选工具使我们能够对多种替代碳源（包括乙酸、十二烷、1-十二烯、油酸和十七烷酸）上的生长进行高通量菌株工程实验。乙酸筛选鉴定出多个在乙酸为唯一碳源时缩短培养时间的单突变体和双突变体菌株。烃类筛选揭示了22个……
编译者解读
本研究在文库设计策略上体现了合成生物学的"精简高效"理念——用DeepGuide算法替代纯实验筛选，将文库规模减半的同时提升单条sgRNA活性，显著降低了转化门槛。乙酸与烃类底物的筛选直接对接工业废弃碳源利用的痛点，所鉴定的单/双基因敲除靶点具备明确的菌株改造价值。值得肯定的是，作者通过CS阈值过滤与葡萄糖必需基因排除双重策略控制假阳性，体现了功能筛选数据处理的严谨性。局限在于：3倍覆盖虽够用，但对低活性sgRNA的依赖仍可能漏检部分基因；双敲除组合的验证范围有限，其普适性有待更多组合测试。总体而言，该工作为非常规酵母的全基因组筛选提供了可复制的设计范式。
参考来源
Robertson, N. R. (2024). Optimized genome-wide CRISPR screening enables rapid engineering of growth-based phenotypes in Yarrowia lipolytica. Metabolic Engineering. DOI: 10.1016/j.ymben.2024.09.005
DOI: 10.1016/j.ymben.2024.09.005