来源：Exploring the interactions between polyphenols in the fermented grains of sauce-flavor Baijiu and Saccharomyces cerevisiae based on transcriptomic and metabolomic approaches（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
酱香型白酒酿造原料（高粱与小麦）富含多酚类化合物，但这些多酚与核心酿造微生物酿酒酵母之间的互作关系一直缺乏系统表征。本研究采用转录组与代谢组联合分析策略，发现酒醅多酚对酿酒酵母生长动力学无显著抑制，却诱导了119个差异表达基因（90个上调、29个下调），并驱动22种多酚向20种衍生物的高效生物转化。整合分析提示氧化还原酶、酯酶和水解酶相关基因的上调可能参与这一生物转化过程，为理解酱香型白酒酿造的生化基础提供了理论支撑。
研究背景
中国白酒按香型可分为十二大类，其中酱香型、浓香型和清香型最为突出。酱香型白酒以其优雅细腻的香气和醇厚饱满的口感广受消费者青睐。作为谷物发酵酒，酱香型白酒以高粱和小麦为核心原料：小麦发酵制成大曲（糖化发酵剂），蒸煮后的高粱与大曲混合形成酒醅。高粱和小麦均富含多酚类物质——小麦含有阿魏酸、咖啡酸、丁香酸、槲皮素、二氢槲皮素和对香豆酸，高粱则提供咖啡酸、阿魏酸、3-脱氧花青素、木犀草素、芹菜素、花旗松素和柚皮素。这些谷物中的多酚主要以酯或糖苷等结合形式存在，分子量大、挥发性低、生物利用度有限。在酱香型白酒发酵过程中，表达多酚水解酶的酿造微生物可将结合型多酚代谢为游离型多酚——后者分子量更小、挥发性更高、生物利用度增强。一方面，挥发性多酚被蒸馏进入成品白酒，丰富其香气轮廓；另一方面，多酚与微生物的互作机制尚不清楚。本研究旨在通过转录组与代谢组联合手段，系统解析酒醅多酚与酿酒酵母之间的分子互作。
研究方法
2.1 材料与菌株
酒醅多酚提取物（纯度30.3%）和酿酒酵母由贵州茅台酒厂（集团）有限责任公司菌种保藏中心（中国贵州省遵义市）提供。酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基购自青岛高新区海博生物技术有限公司（中国山东省青岛市）。MJZol总RNA提取试剂盒购自上海美吉生物医药科技有限公司（中国上海市）。所有多酚标准品购自上海源叶生物科技有限公司（中国上海市）。色谱级甲醇、色谱级乙腈、色谱级甲酸、色谱级水和色谱级丙醇购自美国赛默飞世尔科技有限公司。
【数据】酒醅多酚提取物纯度：30.3%；菌株来源：贵州茅台酒厂菌种保藏中心；试剂来源：详见原文
2.2 酒醅提取物中总酚、多糖和蛋白质含量测定
酒醅提取物中的总酚含量采用Folin-Ciocalteu法测定，多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定。
【数据】测定方法：Folin-Ciocalteu法（总酚）、苯酚-硫酸法（多糖）、考马斯亮蓝法（蛋白质）
2.3 酿酒酵母生长曲线测定
将保存于−80°C的酿酒酵母甘油菌种划线接种于YPD固体培养基，于28°C培养72小时。挑取单菌落接种于3 mL液体YPD培养基中，28°C、180 rpm振荡培养24小时制备种子培养液。随后，取300 μL种子培养液（1% v/v）转接至30 mL新鲜液体YPD培养基中，28°C、180 rpm振荡培养。每30分钟取200 μL菌液至96孔板中，三次重复测定600 nm处光密度（OD600）。以时间为横坐标（x轴）、OD600值为纵坐标（y轴）绘制生长曲线。
如图1所示，将花旗松素、原儿茶酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和酒醅多酚提取物分别以预定浓度加入液体YPD培养基中。这些实验浓度根据我们前期报道（Ni et al., 2024）中酱香型白酒生产过程中酒醅内各多酚的实际含量和丰度按比例设计——具体而言，对高丰度的花旗松素设置0.25–2.5 mg/mL的较高浓度梯度，而对丰度较低的酚酸类（如阿魏酸、咖啡酸和对香豆酸）设置0.01–0.5 mg/mL的较低范围。未处理培养基作为对照，所有样品随后培养24小时。
对于转录组和代谢组分析，酿酒酵母在添加2 mg/mL酒醅多酚提取物（JPE）的培养基中培养48小时。JPE的总酚纯度为30.3%，因此在2 mg/mL添加量下，培养基中总溶解酚浓度为0.606 mg/mL。JPE中十二种主要单体成分的计算浓度（包括花旗松素约74.65 mg/L、原儿茶酸约5.58 mg/L、花青素约4.66 mg/L等）详见表S1，该表基于我们前期研究（Ni et al., 2024）中建立的酒醅HPLC定量图谱绘制。该浓度的选择旨在模拟窖内发酵期间酒醅液相中溶解的多酚生理浓度（根据总酚范围150–475 mg GAE/100 g干重和平均水分含量50%计算为1.5–4.75 mg/mL（Ni. D et al., 2024））。采样时间的差异是刻意设计的：24小时足以监测指数生长期的急性动力学响应，而选择48小时时间点是为了让酵母在持续多酚胁迫下达到稳定的代谢状态，从而确保生物转化产物充分积累以进行准确的代谢组学分析，并捕获适应过程中的稳态转录组特征。培养物于4°C、4000 × g离心5分钟，收集酵母细胞沉淀用于转录组分析，上清液保留用于代谢组分析。
【数据】培养温度：28°C；转速：180 rpm；OD600测定间隔：30 min；种子液接种量：1% v/v；JPE添加浓度：2 mg/mL；总溶解酚浓度：0.606 mg/mL；花旗松素浓度：约74.65 mg/L；原儿茶酸浓度：约5.58 mg/L；花青素浓度：约4.66 mg/L；花旗松素浓度梯度：0.25–2.5 mg/mL；酚酸浓度梯度：0.01–0.5 mg/mL；离心条件：4000 × g、4°C、5 min；模拟窖内多酚浓度：1.5–4.75 mg/mL
2.4 转录组分析
#### 2.4.1 RNA提取
使用MJZol总RNA提取试剂盒和RNA纯化试剂盒（均购自上海美吉生物医药科技有限公司）提取并纯化每个样品中酵母的总RNA。
【数据】RNA提取试剂盒：MJZol总RNA提取试剂盒；RNA纯化试剂盒：购自上海美吉生物医药科技有限公司
#### 2.4.2 质量控制和RNA测序
使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）定量RNA浓度和纯度，通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性。使用Agilent 5300 Bioanalyzer进行全面的RNA质量验证——包括纯度和完整性测量。后续步骤包括RNA纯化、逆转录、文库构建和测序，由上海美吉生物医药科技有限公司按照制造商规程完成。测序在NovaSeq X Plus平台上进行。原始双端读段首先经过接头修剪和质量过滤生成干净读段。这些高质量读段随后以方向模式比对至参考基因组。使用RSEM软件量化基因和转录本表达水平。应用转录本每百万（TPM）标准化计算表达值，并使用该标准化数据鉴定实验组间的差异表达基因（DEGs）。
【数据】测序平台：NovaSeq X Plus；定量软件：RSEM；标准化方法：TPM；RNA定量仪器：NanoDrop 2000；RNA完整性评估：Agilent 5300 Bioanalyzer
#### 2.4.3 差异表达基因分析
获得基因读段计数后，使用DESeq2（http://bioconductor.org/packages/stats/bioc/DESeq2/）进行样本组间的差异表达分析。统计学显著的差异表达基因采用双重阈值鉴定：调整后p值（错误发现率FDR，通过Benjamini-Hochberg校正方法计算）< 0.05以控制多重检验，以及绝对log2倍数变化|log2FC| ≥ 1。同时满足两个标准的基因被认定为DEGs。
【数据】DEG筛选标准：FDR < 0.05且|log2FC| ≥ 1；分析方法：DESeq2；多重检验校正：Benjamini-Hochberg
#### 2.4.4 基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析
GO术语富集分析使用Goatools（https://github.com/tanghaibao/GOatools）进行，以Fisher精确检验作为统计方法，经Benjamini-Hochberg校正后调整p值< 0.05的GO类别视为显著富集。对于KEGG通路富集分析，使用Python SciPy库（https://scipy.org/install/），计算原理与GO富集方法一致。
【数据】GO富集方法：Goatools + Fisher精确检验；显著阈值：调整p < 0.05；KEGG富集工具：Python SciPy库
2.5 代谢组学分析
#### 2.5.1 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析
色谱分离在ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm；Waters，米尔福德，美国）上完成，进样量3 μL，流动相A为含0.1%甲酸的2%乙腈水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈，梯度条件如下：0–0.05 min，2% B；0.50–7.50 min，2–35% B；7.50–13 min，35–95% B；13–14.40 min，95% B；14.40–14.50 min，95–2% B；14.50–16 min，2% B。流速维持在0.40 mL/min，柱温40°C。质谱检测采用Q-Exactive Plus Orbitrap质谱仪（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国），配备电喷雾电离（ESI）源，在正负离子模式下运行，扫描范围m/z 70–1050，喷雾电压设置为+3500 V（正离子）和−3000 V（负离子），鞘气50 psi，辅助气13 psi，离子源温度450°C，阶梯式归一化碰撞能量20-40-60 eV，MS1分辨率达到……
【数据】色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；进样量：3 μL；流速：0.40 mL/min；柱温：40°C；梯度时间：0–16 min；质谱仪：Q-Exactive Plus Orbitrap；扫描范围：m/z 70–1050；喷雾电压：+3500 V/−3000 V；鞘气：50 psi；辅助气：13 psi；离子源温度：450°C；碰撞能量：20-40-60 eV
研究结果
3.1 酒醅提取物的主要成分
前期工作中，本实验室采用乙醇提取结合AB-8大孔树脂色谱（一种常用于多酚纯化的弱极性吸附树脂）从酒醅中制备了富含酚类的提取物。比色分析表明，该提取物约含30.3%酚类、10.1%多糖和12.4%蛋白质，累计占其组成的53%。鉴于酿造过程中的高温、长时间发酵条件以及大曲的添加，该提取物可能含有美拉德反应产物，以及其他物质如色素、木质素、纤维素和有机酸。酚类被确定为该提取物的主要成分。AB-8树脂工艺有效去除了大多数高极性物质，包括无机盐、糖类和某些有机酸。我们预计残余组分——即木质素、多糖、疏水性蛋白质、色素和类黑精——对酵母生长无显著影响。此外，使用这种复合提取物而非分离的纯单体，更准确地反映了实际应用，并能更好地模拟酒醅来源酚类与酿酒酵母之间的互作。因此，选择该酒醅提取物添加到酵母培养基中用于进一步研究。
【数据】提取物组成：30.3%酚类、10.1%多糖、12.4%蛋白质；总占比：53%；提取方法：乙醇提取 + AB-8大孔树脂色谱
3.2 酒醅多酚对酿酒酵母生长的影响
酿酒酵母是乙醇生产的关键工业微生物，也是影响酱香型白酒产量的关键物种之一。在发酵过程中，酿酒酵母代谢葡萄糖产生乙醇——这一过程直接决定基酒产量。在酱香型白酒发酵中，酒醅中的酿酒酵母通过自然环境接种高度富集，在整个酿造过程中成为优势微生物种群。我们前期的研究表明，酒醅样品富含多酚，总酚含量范围为150至475 mg GAE/100 g干重（DW）。这些多酚主要包括十二种化合物，如花旗松素、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸和对香豆酸（Ni et al., 2024）。多酚已被广泛报道具有显著的抗菌活性，可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等微生物的生长（Gómez-Maldonado et al., 2020）。为探究酒醅来源多酚是否抑制酵母生长（从而可能影响乙醇产量），本研究考察了酿酒酵母在高浓度多酚条件下的生长情况。
如图1所示，暴露于低浓度和高浓度的花旗松素（图1A）、原儿茶酸（图1B）、对香豆酸（图1C）、咖啡酸（图1D）、阿魏酸（图1E）和酒醅提取物（图1F）对酿酒酵母的生长动力学均无显著影响。尽管某些组在24小时时的最终OD600值看起来略高（例如图1A中的2.5 mg/mL花旗松素和图1F中的酒醅多酚提取物），但统计分析（单因素方差分析）确认这些微小差异无统计学显著性（p > 0.05），属于平行实验重复间的预期变异范围。这表明酵母对酒醅中存在的多种多酚表现出强耐受性。即使在高多酚条件下，酿酒酵母仍维持正常生长。因此，酒醅中的多酚在酱香型白酒发酵过程中不会显著影响乙醇产量。
值得注意的是，我们分离的酿酒酵母菌株对JPE的强耐受性与先前发现形成对比——先前研究表明多酚显著抑制了在营养丰富、无胁迫培养基中驯化的标准实验室酵母菌株的生长（Li et al., 2023）。由于我们的菌株分离自酱香型白酒酒醅，它在高强度选择压力下经历了长期进化适应，这些压力包括高浓度高粱单宁、小麦多酚、有机酸和乙醇。这种生态位特异性适应可能驱动了强大胁迫防御系统的进化，如细胞壁加固和主动转运解毒（详见3.3节），这解释了为何即使在2 mg/mL JPE胁迫下生长动力学仍不受阻碍。
【数据】总酚含量范围：150–475 mg GAE/100 g DW；多酚种类：12种主要化合物；最高测试浓度：2.5 mg/mL（花旗松素）、2 mg/mL（JPE）；统计方法：单因素方差分析；p值：> 0.05（差异不显著）
3.3 酿酒酵母对多酚的转录谱及基因组响应
#### 3.3.1 转录组测序的数据质量验证
表1展示了所有样品的原始数据和质控（QC）后数据。结果表明，所有清洁数据集的平均碱基错误率为0.016%，满足低于0.1%的阈值要求。此外，质量分数高于Q20和Q30的碱基比例分别超过99%和96%，GC含量（即清洁数据中G和C碱基占总碱基的比例）高于40%，共同证明测序质量高，适用于后续基因表达分析。
【数据】平均碱基错误率：0.016%；Q20比例：> 99%；Q30比例：> 96%；GC含量：> 40%
#### 3.3.2 多酚暴露驱动转录谱的显著分化
如图2A所示，暴露于2 mg/mL酒醅多酚提取物诱导了酿酒酵母转录谱的显著变化。在主成分1（PC1）方向上，SC组与PSC组之间观察到明显分离。维恩图分析进一步揭示了SC组中有51个独特基因，PSC组中有42个独特基因（图2B）。这些结果表明，虽然酿酒酵母的生长在酒醅多酚胁迫下未被显著抑制，但多个基因的表达被显著重编程——表明酵母对此多酚胁迫存在实质性的转录适应。这一发现与Li等人（2023）的先前研究一致，他们报道暴露于1.6 g/L鞣酸在酿酒酵母中引发了2890个差异表达基因，其中1499个上调，1391个下调。
【数据】JPE浓度：2 mg/mL；SC组独特基因数：51；PSC组独特基因数：42；文献对比数据：1.6 g/L鞣酸、2890个DEGs（1499上调/1391下调）
#### 3.3.3 DEGs的分布与特征分析
我们的分析共检测到7127个表达基因。基于这些表达基因的定量数据，使用DESeq2软件进行组间差异基因表达分析，筛选阈值设为绝对倍数变化> 2且调整后p值< 0.05。如图2C所示，相对于SC组，PSC组表现出90个基因上调和29个基因下调——进一步证实含有酒醅多酚提取物的生长环境改变了酿酒酵母的转录谱和基因表达动态。图2D展示了SC组与PSC组之间的DEGs，揭示了每组三个生物学重复之间的高重现性。聚类分析清晰地将PSC组的三个重复与SC组的重复分开，表明酒醅多酚提取物暴露显著改变了酿酒酵母的转录谱。具体而言，YGR279C和YPL265W等基因显著上调，而YJL020W-A和YPL257W-B显著下调。
【数据】检测表达基因总数：7127；上调基因数：90；下调基因数：29；筛选阈值：|倍数变化| > 2、调整p < 0.05
#### 3.3.4 响应基因的功能分类与细胞定位
使用GO数据库对两组间的DEGs进行功能注释。如图3A所示，在GO分类的一级水平上，基因功能大致分为三个主要领域：生物学过程、细胞组分和分子功能。该图主要展示二级水平上的主要富集通路。具体而言，在生物学过程中，DEGs主要与细胞过程（73个DEGs）和代谢过程（41个DEGs）相关。在细胞组分方面，DEGs主要……
【数据】细胞过程相关DEGs：73；代谢过程相关DEGs：41
3.4 代谢组学分析
3.5 多酚生物转化分析
3.6 多酚水解酶相关基因表达分析
讨论与解读
本研究系统阐明了酒醅多酚与酿酒酵母之间的互作机制。核心发现包括三个方面：其一，酒醅多酚对酿酒酵母生长动力学无显著影响，表明该酵母对多酚胁迫具有强耐受性——这与其长期在酱香型白酒酒醅这一富含多酚、有机酸和乙醇的严苛环境中进化适应密切相关。其二，转录组分析揭示酿酒酵母通过上调细胞壁完整性和跨膜转运相关基因来维持细胞内稳态，这是一种主动适应而非被动耐受。其三，代谢组分析表明酿酒酵母能高效水解黄酮类和酚酸类化合物，促进其向挥发性酚类衍生物的生物转化，该过程可能与编码氧化还原酶、水解酶和酯酶的基因上调相关。
然而，本研究也存在明确局限性：所用酒醅提取物仅含30.3%多酚，因此所阐明的生物转化途径不能完全确定在实际酱香型白酒工业酿造中以相同方式发生。未来研究应利用先进的分离纯化技术从酒醅中选择性分离多酚，以更精确地解析其转化机制。
编译者解读：该研究采用"复合提取物+多组学联用"的策略颇具工业相关性——直接使用酒醅来源的粗提物而非纯单体，虽增加了体系复杂度，却更真实地模拟了实际酿造场景。值得关注的是，作者将菌株耐受性与生态位适应联系起来，提示工业菌株的胁迫耐受机制可能显著异于实验室菌株，这对合成生物学菌株改造具有参考价值——在设计和构建耐受性底盘细胞时，应重视来源菌株的进化背景。不过，30.3%的纯度确实为因果推断带来不确定性，未来若能在纯化单体与粗提物之间进行平行比较，将更有说服力。
参考来源
Chen, C. (2026). Exploring the interactions between polyphenols in the fermented grains of sauce-flavor Baijiu and Saccharomyces cerevisiae based on transcriptomic and metabolomic approaches. Food Bioscience. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109566
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109566