来源：Balancing fermentation control and aroma complexity in semi-spontaneous kiwifruit fermentation through Saccharomyces cerevisiae inoculum level（Food Research International）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
猕猴桃酒的风味品质高度依赖于发酵工艺。本研究系统比较了自发发酵、纯种接种发酵及三种梯度接种量的半自发发酵工艺，发现高接种量半自发发酵（SF+100%，1.0×10⁷ CFU/mL）能在有效控制乙酸含量的同时保留野生微生物群落的贡献，实现发酵可控性与香气复杂性的双赢。研究通过理化指标、有机酸、挥发性化合物、微生物群落及感官评价等多维度分析，揭示了接种量梯度调控微生物生态进而驱动风味形成的核心机制。
研究背景
猕猴桃（Actinidia spp.）因其高营养价值和独特风味而广受喜爱。猕猴桃酒作为深加工产品，不仅拓展了水果利用途径，还因其潜在健康益处和怡人风味获得市场青睐。果酒的感官品质——尤其是复杂香气和协调口感——是决定消费者接受度的关键因素，而这些特征显著受发酵过程影响。
发酵是果酒酿造的核心环节，发酵方案直接决定微生物群落的结构和代谢活性。目前主要采用几种典型发酵方式：自发发酵依赖原料表面的天然微生物群落，能持续产生风味复杂、特征鲜明的产品。猕猴桃表面栖息着大量多样的微生物群落，包括具有发酵潜力的酵母菌株。在自发发酵过程中，非酿酒酵母和其他天然微生物通过自然演替促进香气前体物质和风味多样性的形成。
然而，自发发酵存在发酵不可控、易产生异味等缺陷。如何在保留风味复杂性的同时实现发酵过程的有效控制，是果酒酿造领域的关键科学问题。
研究方法
2.1 菌株与样品
本实验使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WSL 21菌株，该菌株保存于西北农林科技大学健康食品生产与安全实验室（中国杨凌）。徐香猕猴桃采自陕西省周至县果园。采收后，仅选择处于商业成熟期、无病虫害、无微生物感染且无机械损伤的果实作为原料。发酵罐在使用前经过清洗和灭菌。
为减少果皮的影响，猕猴桃经人工去皮、破碎、压榨获得原果汁。随后，将果皮浸泡在果汁中，于25°C条件下浸泡24小时，确保果皮上的微生物充分定殖。之后按100 mg/kg的比例添加果胶酶，酶解3小时。最后，混合物经数层无菌纱布过滤以去除果皮和固体残渣，得到下一阶段发酵的起始原料。
【数据】菌株：酿酒酵母WSL 21；浸泡温度：25°C；浸泡时间：24h；果胶酶添加量：100 mg/kg；酶解时间：3h
2.2 实验室规模发酵
参照Liang等（Liang et al., 2023）的方法，猕猴桃酒发酵在1 L发酵罐中进行，每罐装800 mL果汁。为增强菌株活力，葡萄酒酵母（酿酒酵母WSL 21）在YPD培养基中于28°C活化三代，每代24小时。
共建立五种发酵方案：
（I）自发发酵（SF）：不施加任何干预；
（II）接种发酵（IF）：果汁经巴氏杀菌后，添加50 mg/L K₂S₂O₅以护色并抑制杂菌生长。接种实验室筛选菌株酿酒酵母，浓度为10⁷ CFU/mL进行发酵；
（III–V）半自发发酵（SF+20%、SF+50%、SF+100%）：未杀菌果汁分为三组，分别接种相当于IF组标准接种量20%（0.2×10⁷ CFU/mL）、50%（0.5×10⁷ CFU/mL）和100%（1×10⁷ CFU/mL）密度的酿酒酵母WSL 21。过程中不施加额外干预。
接种量基于预实验确定：低于20%（0.2×10⁷ CFU/mL）时与自发发酵（SF）无统计学显著差异；高于1.0×10⁷ CFU/mL时结果与1.0×10⁷ CFU/mL相当，无进一步改善。因此，选择20%、50%和100%三个水平作为关键过渡点，系统研究酿酒酵母接种量的剂量依赖性调控效应。
发酵在25°C条件下进行，总时长13天。所有处理均发酵相同时间，第13天取样。整个过程中每天监测残糖含量。≤4 g/L的残糖标准仅作为监测发酵进程的操作指标，而非各处理的实际终止条件。样品保存于−20°C，用于后续代谢物和感官分析。
【数据】发酵罐体积：1L；装液量：800mL；YPD活化温度：28°C；活化时间：24h×3代；K₂S₂O₅浓度：50mg/L；IF接种量：10⁷CFU/mL；SF+20%接种量：0.2×10⁷CFU/mL；SF+50%接种量：0.5×10⁷CFU/mL；SF+100%接种量：1×10⁷CFU/mL；发酵温度：25°C；发酵总时长：13天
2.3 基础理化参数测定
猕猴桃酒和猕猴桃汁的理化参数按照Liu、Fu等（Liu, Fu, et al., 2025）的方法分析。pH使用数字pH计测定。可滴定酸度采用中国国标GB/T 12456–2021规定的电位滴定法测定。发酵过程中使用费林试剂按GB 5009.7监测还原糖含量。
果酒中酒精含量采用气相色谱法测定。猕猴桃酒先用色谱级丙酮稀释，然后经0.22 μm尼龙膜过滤。N₂为载气（0.42 mL/min），进样口温度250°C，进样量0.5 μL，分流进样（20:1）。分离在DB-WAX色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，Agilent，美国）上进行，初始温度40°C保持13 min，然后以40°C/min速率升温至240°C，持续12 min。
总酯含量采用国家标准《葡萄酒、果酒通用分析方法》（GB 15038–2006）中描述的皂化法测定。发酵液中总酚含量采用Folin-Ciocalteu法测定，结果以没食子酸当量（GAE）表示。
【数据】载气：N₂；流速：0.42mL/min；进样口温度：250°C；进样量：0.5μL；分流比：20:1；色谱柱：DB-WAX（30m×0.25mm×0.25μm）；升温程序：40°C保持13min→40°C/min升至240°C保持12min；总酚测定：Folin-Ciocalteu法
2.4 有机酸测定
猕猴桃酒和果汁中有机酸（草酸、莽草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、乙酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸）含量使用配备光电二极管阵列检测器的HPLC系统（LC-16，Shimadzu，日本）测定。分析前，1 mL样品经0.22 μm尼龙膜过滤去除杂质。
流动相A为0.1%（v/v）磷酸水溶液，流动相B为色谱级甲醇。分析使用C18色谱柱（Shim-pack VP-ODS，Shimadzu，日本），等度洗脱，进样量10 μL，流速1 mL/min，流动相A与B体积比为95:5。柱温箱温度设为40°C，检测波长为210 nm。
【数据】色谱柱：C18（Shim-pack VP-ODS）；进样量：10μL；流速：1mL/min；流动相A:B=95:5（v/v）；柱温：40°C；检测波长：210nm；样品过滤：0.22μm尼龙膜
2.5 挥发性化合物测定
参照前期研究（Zhou et al., 2025），采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）分析发酵结束时猕猴桃酒样品中的挥发性化合物。
在20 mL顶空瓶中，加入5 mL猕猴桃酒、1 g氯化钠和10 μL内标（54 mg/L，2-辛醇），混合物在40°C平衡15 min。将50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维头（Supelco，Bellefonte，PA，美国）浸入顶空，在40°C、600 rpm条件下搅拌萃取30 min。随后样品在GC进样口230°C解吸5 min，使用DB-WAX色谱柱（60 m × 0.25 mm × 0.25 μm，Agilent J&W，美国）。载气为氦气（99.999%），流速1.5 mL/min。
GC程序如下：40°C保持3 min，以4°C/min升至160°C，再以7°C/min升至220°C，保持8 min。GC和MS传输线温度220°C，离子源温度200°C。MS采用电子电离（EI）模式，扫描质量范围35至350 m/z，间隔0.2秒。挥发性物质通过将其保留时间和质谱与纯标准品比对，使用NIST 18.0质谱库进行鉴定。挥发性物质的半定量分析使用内标法：挥发性物质浓度按未知样品峰面积与内标峰面积之比乘以2-辛醇浓度计算。
【数据】样品量：5mL猕猴桃酒；NaCl：1g；内标：10μL 2-辛醇（54mg/L）；平衡条件：40°C、15min；萃取条件：40°C、600rpm、30min；解吸条件：230°C、5min；色谱柱：DB-WAX（60m×0.25mm×0.25μm）；载气：He（99.999%），1.5mL/min；GC程序：40°C保持3min→4°C/min升至160°C→7°C/min升至220°C保持8min；MS：EI模式，35-350m/z
2.6 仿生电子鼻分析
根据Xu等（Xu et al., 2019）的描述，电子鼻传感器阵列由10个化学传感器组成（Win Muster Airsense Analytics Inc.，德国），包括W1C（芳香族化合物-苯类）、W5S（氮氧化物）、W3C（芳香族化合物）、W6S（氢化物）、W5C（芳香-烷基化合物）、W1S（甲基化合物）、W1W（硫-有机化合物）、W2S（醇类、醛类和酮类）、W2W（硫-无机化合物）和W3S（长链烷烃）。
将10 mL猕猴桃汁或果酒置于带PTFE/硅胶密封盖的样品瓶中。测量开始时，传感器读数随时间波动，约120秒后趋于稳定。参考检测时间100秒，吹扫时间120秒，预进样时间5秒，进样流速400 mL/min，载气（洁净空气）流速400 mL/min。上述步骤重复六次以消除实验误差。
【数据】样品量：10mL；稳定时间：约120s；检测时间：100s；吹扫时间：120s；预进样时间：5s；进样流速：400mL/min；载气流速：400mL/min；重复次数：6次
研究结果
3.1 基础理化性质与发酵动力学分析
为探究不同发酵方式对猕猴桃酒发酵过程的影响，系统监测了发酵过程中（0–13天）可滴定酸度、总酚、总酯和残糖的动态变化，并基于这些数据分析了各组的发酵动力学。
如图1A所示，SF（自发发酵）表现出最慢的糖消耗速率和发酵结束时最高的残糖量。猕猴桃表面存在的野生酵母和细菌复合群落，其发酵能力和效率远低于经过专门筛选的葡萄酒酵母。该特征表现为初期较长的延滞期和后期糖消耗的提前减缓。这种动力学行为可归因于野生微生物群落内部不同的乙醇耐受性和营养竞争，最终导致发酵不完全和较高的残糖。
半自发发酵的糖消耗速率呈现明显依赖于接种量的梯度：接种葡萄酒酵母的比例与发酵速率和完全程度正相关。接种发酵（IF）启动迅速，主发酵期糖含量下降极快，速率与SF+100%相当甚至略优。
可滴定酸度（图1B）表现出对接种剂量的明显依赖性。SF组中，可滴定酸度在发酵中期（第3–7天）持续增加，平均速率为0.21 g·L⁻¹·d⁻¹，最终值显著高于其他组（p < 0.05）。这种过度酸积累可能归因于野生群落中醋酸菌和其他产酸污染物的不受控生长。半自发发酵组中，随着接种量增加，可滴定酸度的上升逐渐受到抑制。值得注意的是，SF+100%组表现出先适度上升、后期略微下降的趋势，最终酸度与IF组相近。该趋势表明高接种量与发酵过程中酸度的更好控制相关。
总酯动态变化（图2A）显示各组间发酵趋势不同。SF+100%组的总酯含量在开始时稳步增加，随后从第5天到第11天急剧上升，第11天达到最高点，末期有所下降。相比之下，IF组呈波动趋势：先升至第5天峰值，第5至第9天下降，发酵临近结束时再次上升。低接种量组（SF+20%和SF+50%）呈现不稳定波动，而自发发酵SF对照组在整个过程中大部分时间维持在低水平。
酯类是果酒中重要的香气贡献物质，主要由酵母细胞通过乙酰转移酶催化的酰基辅酶A与醇类缩合而成（Saerens et al., 2010）。在自发发酵（SF）组中，野生微生物群的酯合成能力有限，导致合成期酯类产量受限。此外，产酯酶细菌和野生酵母的存在可能加速酯类水解，导致后期酯含量急剧下降（Sumby et al., 2010）。相反，IF组中果汁经过巴氏杀菌并受二氧化硫保护，纯酿酒酵母群体可在无营养竞争的条件下稳定生存，使酯类在末期再次增加。
对于SF+100%组，虽然高接种量有助于在峰值期（第11天）产生大量酯类，但野生微生物的存在导致后期糖分耗尽时对有限前体（如酰基辅酶A和醇类）的激烈竞争。这种竞争加上高乙醇浓度驱动的化学水解，导致了后期总酯的下降。这表明控制起始酵母与野生微生物之间的平衡是发酵过程中保护香气化合物的有效途径（Mikuš et al., 2026; Sun et al., 2024a; Vanderhaegen et al., 2006）。
尽管SF+100%组的总酯含量在末期有所下降，但该组在第11天达到的峰值浓度远高于IF组。这表明酿酒酵母与野生微生物群的共存可能在活跃发酵阶段产生更高的香气化合物产量，比纯种接种发酵具有更高的风味潜力。
对于总酚（图2B），所有组在第1天均表现出总酚含量增加。发酵过程中，微生物及其酶可以分解果实细胞壁，促进结合态酚类化合物释放到酒中（Boban et al., 2024; Hou et al., 2023; Zhang et al., 2022）。SF组中，总酚在第3天下降，随后保持在相对稳定的水平。有趣的是，IF组呈现不稳定趋势：第1天上升，但从第1天到第11天持续下降，末期略有回升。
半自发发酵组中，SF+100%组呈现独特而显著的趋势：初期缓慢增加，但从第5天到第7天急剧上升，第7天达到非常高的峰值（3.2 g/L）。第7天后，SF+100%组酚类含量迅速下降至第9天，末期再次上升，最终值居所有组之首。这表明酿酒酵母与野生微生物群的共存可在发酵中期（第5–7天）触发强烈的酚类提取爆发，可能归因于野生微生物群提供的丰富胞外酶（Belda et al., 2016）。然而，第7至第9天的急剧下降可能是由于随着乙醇浓度升高，这些高浓度酚类化合物发生化学聚合、缩合或沉淀所致。总体而言，SF+100%方案表现出最高的终末总酚浓度，并伴随明显的发酵中期提取峰，提示发酵过程中酚类积累和稳定的复杂动态。
为定量评估连续增加酿酒酵母接种量对猕猴桃酒品质的影响，对四个实际接种水平（0、0.2、0.5和1.0×10⁷ CFU/mL）下测得的终点理化指标（残糖、总酯、总酚和可滴定酸度）进行非线性回归分析。结果如图3所示。
残糖符合单相指数衰减模型。模型显示，接种量超过约0.2×10⁷ CFU/mL后，进一步增加酵母浓度仅使终点残糖产生边际减少，表明糖消耗存在饱和阈值。可滴定酸度和总酚对酵母剂量均呈现明显的非单调数学响应。较高接种水平（1.0×10⁷ CFU/mL）成功控制了终点酸度并实现最高酚类保留，可能通过在早期确保更强的起始菌优势实现。总酯方面，随酵母剂量增加观察到持续上升趋势，证实增加接种量直接有利于酯类积累。
需要指出的是，由于这些非线性拟合曲线基于四个实际接种水平建立，它们作为描述性趋势模型而非精确优化工具。更细梯度的接种量研究将有助于进一步提高模型精度。
【数据】SF组酸度增速：0.21g·L⁻¹·d⁻¹（第3-7天）；SF+100%组总酚峰值：3.2g/L（第7天）；SF+100%组总酯峰值时间：第11天；接种量水平：0、0.2、0.5、1.0×10⁷CFU/mL；残糖拟合模型：单相指数衰减；总酚拟合模型：三次多项式（R²=0.998）；残糖拟合R²=0.988
3.2 有机酸组成分析
（注：由于原文节选未提供3.2节完整内容，以下根据可获得的图表信息进行呈现。）
不同发酵方式生产的猕猴桃酒中有机酸含量存在显著差异。有机酸组成直接影响果酒的口感和风味协调性。
【数据】有机酸种类：草酸、莽草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸（原文未详述各酸具体数值）
3.3 挥发性化合物分析
通过HS-SPME-GC-MS分析，在样品中鉴定出多种挥发性化合物。图5A展示了已鉴定挥发性化合物的层次聚类热图，图5B展示了不同化学类别在样品中的相对丰度。
对ROAV >0.1的挥发性香气成分与猕猴桃酒主要成分进行PCA载荷分析（图6）。结果表明不同发酵方式的样品在香气特征上存在明显区分。
【数据】挥发性化合物鉴定方法：HS-SPME-GC-MS；ROAV阈值：>0.1（原文未详述各化合物具体浓度值）
3.4 电子鼻分析
不同猕猴桃酒和果汁的电子鼻雷达图（图7A）和电子鼻PCA载荷图（图7B）显示，五种发酵方案在电子鼻传感器响应上可清晰区分。W1S、W1W、W2S、W1C、W5S、W2W、W3S、W3C、W6S和W5C分别代表不同的电子鼻传感器。
电子鼻数据明确区分了五种发酵方案，证实不同发酵方式产生的整体挥发性特征存在显著差异。
【数据】电子鼻传感器：10个（W1C、W5S、W3C、W6S、W5C、W1S、W1W、W2S、W2W、W3S）；区分能力：可清晰区分五种发酵方案
3.5 感官评价
图8A展示了不同猕猴桃酒代表性香气描述符的修正频率（MF）得分热图，其中“Total”代表总体感官可接受性得分。图8B为香气描述符对总分的PLSR回归模型。
感官评价证实，SF+100%组在果香、酯香和总体可接受性方面获得最高得分。
【数据】SF+100%组感官得分：果香、酯香、总体可接受性均为最高（原文未详述具体评分值）
3.6 微生物群落分析
发酵结束时丰度前10的微生物属如图9所示。图9A为细菌群落，图9B为真菌群落。SF：自发发酵；SF+20%、SF+50%、SF+100%：接种量递增的半自发发酵。平均相对丰度<1%的属归入“其他”类别。
在未接种的SF组中，野生酵母活性低且存在其他污染微生物，导致发酵过程中无法抑制腐败微生物，发酵结束时醋酸菌占优势（13.6%），进而产生过量乙酸（3.93 g/L）。
【数据】SF组发酵结束时醋酸菌相对丰度：13.6%；SF组乙酸含量：3.93g/L；SF+100%组乙酸含量：0.28g/L
讨论与解读
本研究系统比较了自发发酵（SF）、接种发酵（IF）和不同酿酒酵母接种量的半自发发酵（SF+20%、SF+50%、SF+100%）对猕猴桃酒品质的影响，揭示了接种量梯度调控微生物生态系统并驱动风味形成的核心机制。
在未接种的SF组中，野生酵母活性低且存在其他污染微生物，导致发酵过程中无法抑制腐败菌，发酵结束时醋酸菌占优势（13.6%），产生过量乙酸（3.93 g/L）。因此，SF组虽然产生了一些独特风味，但也表现出令人不悦的异味。相比之下，IF组使用纯酿酒酵母培养物，发酵过程更稳定，结果良好，具有浓郁的玫瑰、蜂蜜和柑橘香气。半自发发酵介于两种方式之间，通过在自发条件下接种酿酒酵母并控制接种量实现混合发酵，从而产生更具特色的风味。
随着接种量增加，酿酒酵母的竞争优势增强，腐败微生物（如醋酸菌）的丰度显著下降，乙酸含量大幅降低。更重要的是，高接种量方案（SF+100%）保留了可检测的天然微生物群组分，这可能有助于酚类化合物和关键香气活性酯类（如己酸乙酯、乙酸异戊酯）及萜烯类化合物（如香叶醇、大马士酮）的积累。ROAV分析显示，该处理在果香和花香特征的香气活性化合物丰度和贡献方面最为突出。
编译者解读：该研究巧妙地在“自发发酵的不可控”与“纯种发酵的风味单一”之间寻找中间路径，通过接种量梯度实现了对混合发酵体系的方向性引导。从合成生物学应用角度看，这种“以量控生态”的策略比基因工程改造菌株更易落地——无需复杂的菌株构建，仅通过调整接种参数即可在工业规模上实现风味优化。SF+100%方案将乙酸从3.93 g/L降至0.28 g/L的同时保留了野生菌群的风味贡献，为果酒酿造提供了一种实用且成本可控的发酵调控思路。不过，野生菌群在不同批次原料间的波动性仍是该策略面临的实际挑战。
参考来源
Yan W. Balancing fermentation control and aroma complexity in semi-spontaneous kiwifruit fermentation through Saccharomyces cerevisiae inoculum level. Food Research International, 2026.
DOI: 10.1016/j.foodres.2026.120457
DOI: 10.1016/j.foodres.2026.120457