来源：Systems metabolic engineering of Escherichia coli for high-level branched-chain fatty acid production via dual precursor pathways（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
支链脂肪酸（BCFAs）是高性能生物燃料的理想原料，但革兰氏阴性菌中BCFA合成效率长期受制于前体供应不足、脂肪酸合成途径兼容性差及细胞耐受性低三大瓶颈。本研究在大肠杆菌中构建了异戊酰辅酶A（IV-CoA）合成途径，并发现其与支链α-酮酸脱氢酶（BKD）途径存在强协同效应，据此建立双路线前体供给策略。通过重构中心碳代谢、优化脂肪酸合成模块、增强细胞稳健性，最终工程菌株BCFA产量达2.96 g/L，占总脂肪酸的55%，较此前报道提高约10倍。
研究背景
气候变化压力推动社会寻求可再生替代能源与低碳化学品。生物燃料凭借高能量密度和与现有基础设施的兼容性，在交通电动化浪潮下仍不可替代。相比直链脂肪酸，支链脂肪酸衍生燃料具有更低的凝固点，是先进生物燃料的重要候选分子。然而，在大肠杆菌等革兰氏阴性菌中高效合成BCFA面临三重障碍：支链酰基辅酶A前体供应不足、内源脂肪酸合成途径对支链底物兼容性差、细胞对非天然脂肪酸的耐受性有限。此前研究虽通过异源表达fabH基因或增强脂酰化途径实现BCFA生产，但产量始终处于较低水平。本研究从途径创新与系统代谢工程结合的角度，尝试系统性突破上述瓶颈。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株列于表S1。大肠杆菌DH5α用于质粒维持与扩增，大肠杆菌MG1655作为产脂肪酸工程菌株的底盘。除非另有说明，细胞在Luria–Bertani（LB）培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl；pH 7.4）中、37°C条件下培养。液体培养时，3 mL培养物置于试管或20 mL培养物置于250 mL摇瓶中，在控温轨道摇床中以250 rpm振荡培养。质粒维持所需抗生素按以下终浓度添加：氨苄青霉素（100 mg/L）、壮观霉素（100 mg/L）、氯霉素（30 mg/L）、卡那霉素（50 mg/L）。培养基制备所用试剂均购自生工生物（上海），除非另有说明。细胞密度通过GENESYS 50分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测定600 nm处光密度（OD600）监测。
【数据】培养基：LB；温度：37°C；转速：250 rpm；抗生素浓度：氨苄青霉素100 mg/L、壮观霉素100 mg/L、氯霉素30 mg/L、卡那霉素50 mg/L
2.2 质粒与菌株构建
本研究所用质粒和引物分别列于表S2和表S3。质粒采用T5外切酶依赖性组装方法构建（Xia et al., 2018）。大肠杆菌转化按照此前描述的方案进行（Inoue et al., 1990）。所有构建的质粒均通过限制性酶切和Sanger测序验证。
为表达IV-CoA途径，来自黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）的MxliuC、MxaibA、MxaibB和MxaibC基因（表S4）经密码子优化后由生工生物（上海）合成。atoB和EfmvaS基因分别从大肠杆菌MG1655和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）CICC 23658基因组DNA扩增获得。核糖体结合位点（RBS）序列（表S5）选自iGEM Registry（parts.igem.org）或通过RBS计算器设计（Salis et al., 2009）。硫酯酶基因'tesA和tesB从大肠杆菌MG1655扩增。为在质粒中表达SaFabH或替换内源fabH基因，使用密码子优化的SafabH版本（表S4）。bkd操纵子从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168基因组DNA扩增获得。上述基因组装至源自pACYCDuet-1的载体骨架中。
为鉴定IV-CoA途径的潜在瓶颈，将atoB、EfmvaS、MxliuC、MxaibA/aibB或MxaibC分别克隆至pTrc99A质粒（Amann et al., 1988）进行额外表达。为实现NOG途径，编码磷酸酮醇酶（Pk）和磷酸转乙酰酶（Pta）的密码子优化基因——包括来自短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）的Bbfxpk、来自肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）的Lmfxpk、来自克氏梭菌（Clostridium kluyveri）的Ckpta和来自嗜热甲烷八叠球菌（Methanosarcina thermophila）的Mtpta（表S4）——插入低拷贝质粒pSC101进行组合表达。为表达rfaY和yafL，将pCDFDuet-1的选择标记替换为卡那霉素抗性基因，并将从大肠杆菌MG1655扩增的两个基因克隆至所得质粒，在葡萄糖异构酶启动子变体1.6（GI1.6）（Payne et al., 2012）控制下表达。
基因缺失和pcnB突变采用CRISPR-Cas9介导的基因组编辑进行，方法如前所述（Li et al., 2015）。引导RNA（gRNA）间隔序列（20 bp；N20）选自先前研究（Guo et al., 2018）或使用CRISPOR工具（https://crispor.gi.ucsc.edu/）设计，列于表S6。这些N20序列克隆至pGRB质粒（Li et al., 2015）用于gRNA表达。含约500 bp同源臂的线性供体DNA（约1 kb）通过重叠延伸PCR生成，并与相应gRNA质粒共转化至含有pREDCas9（Li et al., 2015）——该质粒表达Cas9核酸酶和λ-Red重组系统——的菌株中。
对于异源基因的染色体整合，使用λ-Red辅助的重组工程。表达盒与从pKD4扩增的卡那霉素抗性基因融合（Datsenko and Wanner, 2000），两侧翼连接约40 bp短同源区用于靶向重组。这些片段转化至含pREDCas9的菌株以获得卡那霉素抗性菌落。验证正确整合后，通过引入供体DNA及表达靶向卡那霉素抗性基因gRNA的质粒pGRB-gRNA.kan去除卡那霉素抗性标记。粗提基因组DNA按此前方法制备（Looke et al., 2011）并用于诊断性PCR。基因敲入和敲除事件通过分析同源臂外侧和/或插入序列内部引物扩增的PCR片段大小来确认。
【数据】组装方法：T5外切酶依赖性组装；转化方法：Inoue法；编辑系统：CRISPR-Cas9（pREDCas9）；同源臂长度：约500 bp（供体DNA）/约40 bp（整合）；RBS来源：iGEM Registry或RBS计算器
2.3 细胞培养与游离脂肪酸（FFA）生产
对于源自大肠杆菌MG1655的工程菌株，从LB琼脂平板挑取单菌落接种至3 mL LB培养基，37°C、250 rpm振荡过夜培养。随后将过夜培养物接种至20 mL改良M9培养基中，该培养基含1 g/L NH4Cl、0.5 g/L NaCl、6.78 g/L Na2HPO4、3 g/L KH2PO4、5 g/L酵母提取物、75 mM MOPS（pH 7.4）、2 mM MgSO4、1 mg/L硫胺素、10 μM FeSO4、0.1 mM CaCl2及微量元素（包括3 μM (NH4)6Mo7O24、0.4 mM硼酸、30 μM CoCl2、15 μM CuSO4、80 μM MnCl2和10 μM ZnSO4），并含20 g/L葡萄糖，配方如前所述（Bentley et al., 2016）。初始OD600为0.1，在30°C、250 rpm条件下培养72小时，除非另有说明。当OD600达到0.6–0.8时，加入1 mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导基因表达。为与先前研究（Bentley et al., 2016）比较，在诱导时补充1 g/L 4-甲基-2-氧代戊酸以供应前体（图2B）。对于菌株H173和H193的延长培养，使用50 mL含40 g/L葡萄糖的改良M9培养基，培养120小时（图5D）。
【数据】培养基：改良M9（含20 g/L葡萄糖）；培养条件：30°C、250 rpm、72h；诱导剂：1 mM IPTG（OD600约0.6–0.8时）；前体补充：1 g/L 4-甲基-2-氧代戊酸；延长培养：50 mL M9 + 40 g/L葡萄糖，120h
2.4 代谢物定量
脂肪酸（FAs）从培养液中提取，方法参照此前描述（Sostare et al., 2018）并稍作修改。简要流程如下：向摇瓶中加入0.5 mL 500 g/L KOH溶液，充分重悬沉淀的脂肪酸。用100 μL浓HCl中和后，取1.5 mL培养液转移至10 mL玻璃管中。随后依次加入100 μL含内标（2 mg/mL十一烷酸，Nu-Chek Prep）的冰醋酸、2 mL甲醇和2.6 mL甲基叔丁基醚（MTBE），充分混匀。加入0.8 mL双蒸水（ddH2O）诱导分相，然后700 × g离心10分钟。取200 μL上层有机相转移至干净的萃取管中，加入1.75 mL甲醇和50 μL 8% HCl-甲醇溶液进行酯交换，45°C孵育60分钟（Ichihara and Fukubayashi, 2010）。反应后加入1 mL ddH2O和1 mL己烷，混合物在1600 rpm涡旋10分钟以萃取脂肪酸甲酯（FAMEs）。上层有机相转移至1.5 mL样品瓶中进行气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析。
FAME样品用GC-MS仪器（TRACE 1600-ISQ 7610，Thermo Fisher Scientific）分析。使用TraceGOLD TG-5SilMS毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）分离分析物。进样口温度设为240°C，氦气为载气，恒流1.2 mL/min。每个样品以不分流模式进样1 μL。柱温程序如下：初始温度45°C保持2分钟，以40°C/min升至165°C并保持1分钟，然后以4°C/min升至195°C并保持2分钟，最后以3°C/min升至240°C并保持4分钟。MS传输线和离子源温度分别设为250°C和300°C。质谱数据采集与处理按标准程序进行。
【数据】皂化：0.5 mL 500 g/L KOH；中和：100 μL浓HCl；内标：2 mg/mL十一烷酸；酯交换：45°C、60min、8% HCl-甲醇；萃取：1600 rpm涡旋10min；GC-MS条件：进样口240°C、载气1.2 mL/min、不分流进样1 μL；程序升温：45°C（2min）→165°C（40°C/min）→195°C（4°C/min）→240°C（3°C/min）
研究结果
3.1 表达替代IV-CoA途径实现BCFA生产
研究首先在野生型大肠杆菌MG1655中构建了异源IV-CoA途径（Li et al., 2013），为BCFA合成提供前体异戊酰辅酶A（图1A）。该途径包含来自大肠杆菌的乙酰辅酶A乙酰转移酶（AtoB）、来自粪肠球菌的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶（EfMvaS）、来自黄色粘球菌的3-甲基戊烯二酰辅酶A水合酶（MxLiuC）、3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶复合物（MxAibA/B）及NADPH依赖性脱氢酶（MxAibC）。同时在大肠杆菌细胞质中表达了无前导肽硫酯酶（'TesA）用于游离脂肪酸生产（Steen et al., 2010），但菌株LMJ05未产生可检测的长链BCFA。与仅表达'TesA的对照菌株（LMJ04）相比，引入IV-CoA途径增加了异戊酸产量，表明前体合成功能正常。此外，共表达底物特异性广泛的硫酯酶TesB（Barnes et al., 1970）进一步增强了异戊酸的形成（图1B）。
此前研究表明，β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶III（FabH）是BCFA生物合成的关键决定因素（Choi et al., 2000）。来自枯草芽孢杆菌（Haushalter et al., 2014; Choi et al., 2000; Jiang et al., 2015）和金黄色葡萄球菌（Jiang et al., 2015）的异源fabH基因已成功在大肠杆菌中表达以实现BCFA生产。因此，本研究将内源fabH基因替换为来自金黄色葡萄球菌的密码子优化版本（SafabH）。此外，编码酰基辅酶A脱氢酶的fadE基因被删除以阻断β-氧化（图1C），此策略与此前报道一致（Steen et al., 2010）。然而，在质粒上表达IV-CoA途径和'TesA的菌株LMJ08仍未产生可检测的长链BCFA。
为增强BCFA合成通量，SaFabH在强组成型proD启动子（Davis et al., 2010）下与'TesA和IV-CoA途径在同一质粒上过表达。该策略使菌株LMJ09产生约6 mg/L长链BCFA，包括11-甲基十二烷酸（C13 iso）和13-甲基十四烷酸（C15 iso）（图1D）。染色体替换fabH可能影响脂肪酸生物合成，导致细胞生长受损，而质粒过表达SafabH缓解了这一生长缺陷（图S2）。考虑到整合的SafabH基因可能干扰下游基因表达，研究构建了替代菌株（LMJ15），仅将fabH的前350 bp替换为SafabH，类似于此前报道的菌株CL111（Jiang et al., 2015; Lai and Cronan, 2003）。然而，这种部分替换降低了BCFA产量，表明内源fabH位点的不完全破坏对BCFA生物合成不利（图1D）。
【数据】BCFA产量（LMJ09）：约6 mg/L；BCFA种类：C13 iso（11-甲基十二烷酸）、C15 iso（13-甲基十四烷酸）；fabH替换策略：全长替换 vs 前350 bp部分替换
3.2 BKD与IV-CoA途径共表达的协同前体供应
bkd操纵子编码的BKD复合物从α-酮酸生成支链酰基辅酶A，α-酮酸可来自支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）的降解，也可来自丙酮酸、乙酰辅酶A或磷酸烯醇式丙酮酸的从头合成（图2A和S1）。来自枯草芽孢杆菌的bkd操纵子（包含ipdV、bkdAA、bkdAB和bkdB）与'tesA和SafabH共表达，使菌株LMJ11产生21.7 mg/L长链BCFA。bkd操纵子与IV-CoA途径共表达进一步将BCFA产量提高至菌株LMJ12的55.7 mg/L，分别比仅表达bkd操纵子（LMJ11）或仅表达IV-CoA途径（LMJ10）的菌株提高2.6倍和13.8倍。该结果表明BKD和IV-CoA途径在增强BCFA生物合成的前体供应方面具有协同作用（图2B）。
在菌株LMJ10和LMJ12中，IV-CoA途径由强组成型proD启动子驱动。与IV-CoA途径在诱导型lacUV5启动子下表达的LMJ09相比，这一修饰似乎略微降低了BCFA产量。值得注意的是，表达BKD的菌株LMJ11和LMJ12产生了多种源自异戊酰辅酶A、异丁酰辅酶A和2-甲基丁酰辅酶A的BCFA种类（图S1）。为便于比较，分析中仅纳入两种主要BCFA种类iso-C13和iso-C15，因为它们是BKD表达菌株和含IV-CoA途径菌株中的主要BCFA产物。
为与先前研究（Jiang et al., 2015, 2017; Bentley et al., 2016）比较，在菌株LMJ12培养期间补充1 g/L 4-甲基-2-氧代戊酸，使长链BCFA产量达到374.5 mg/L（图2B）。据报道，2-氧代酸脱氢酶的蛋白脂酰化是BCFA生物合成的限制因素。过表达脂酰连接酶A（LplA）并结合补充硫辛酸和4-甲基-2-氧代戊酸，可显著将BCFA滴度提高至220 mg/L（Bentley et al., 2016）。然而，本研究未工程化脂酰化途径，也未补充硫辛酸，却在使用与前述研究（Bentley et al., 2016）相同培养基的条件下获得了可比的BCFA滴度（图2B）。
有趣的是，bkd操纵子的表达还改善了细胞生长和总脂肪酸产量（图S3），可能归因于乙酸盐积累减少。与此一致，表达IV-CoA途径的菌株LMJ09积累了8.9 g/L乙酸盐（图S5C），而同时表达IV-CoA途径和bkd操纵子的菌株LMJ12仅形成3.9 g/L乙酸盐（图S7B）。此外，两条途径的共表达在存在TesB的情况下也增强了异戊酸产量（图S4）。
【数据】BCFA产量：LMJ11（仅BKD）21.7 mg/L、LMJ12（BKD+IV-CoA）55.7 mg/L；提高倍数：2.6倍（vs LMJ11）、13.8倍（vs LMJ10）；补充前体后：374.5 mg/L；乙酸盐积累：LMJ09 8.9 g/L、LMJ12 3.9 g/L；文献对比：220 mg/L（Bentley et al., 2016）
3.3 重构中心碳代谢以增强乙酰辅酶A供应
在通过IV-CoA途径生产BCFA的过程中，观察到显著的生长抑制和大量乙酸盐积累（图S3和S5）。为减轻乙酸盐溢流，首先删除了ackA-pta操纵子并同时整合fadR，因为磷酸转乙酰酶（Pta）和乙酸激酶（AckA）构成主要的乙酸盐形成途径（Enjalbert et al., 2017），而过表达转录调控因子FadR已被证明可增强脂肪酸生物合成（Zhang et al., 2012）。然而，这些修饰既未减少乙酸盐形成，也未改善脂肪酸产量（图S5）。
因此，研究扩大了途径删除范围，消除其他副产物形成途径，包括负责乙酸盐、乳酸盐、乙醇和甲酸盐产生的途径（ackA-pta、poxB、ldhA、adhE和pflB；图3A）。删除ackA-pta和poxB几乎完全消除了乙酸盐形成，但细胞生长有所降低。随后删除ldhA、adhE和pflB对生长仅产生边际效应，但改善了细胞质量积累（图S6）。携带全部删除的菌株HMF09被选作进一步工程改造。
为进一步增强乙酰辅酶A供应，研究实施了NOG途径，该途径通过磷酸酮醇酶（Pk）生成乙酰磷酸，再通过磷酸转乙酰酶（Pta）将其转化为乙酰辅酶A（Bogorad et al., 2013; Lin et al., 2018）。这种碳守恒途径已被广泛探索作为乙酰辅酶A生成的替代路线（Qin et al., 2023; Hellgren et al., 2020）。为引导通量流向NOG，删除了edd和pfkA以分别阻断Entner–Doudoroff途径和Embden–Meyerhof–Parnas途径，并表达异源Pk和Pta酶的组合（图3B）。使用了两种Pk酶——来自短双歧杆菌的BbFxpk和来自肠膜明串珠菌的LmFxpk，两者对果糖-6-磷酸和木酮糖-5-磷酸均有底物偏好（Bergman et al., 2016）——以及两种Pta酶——来自克氏梭菌的CkPta（Meadows et al., 2016）和来自嗜热甲烷八叠球菌的Mtpta。
讨论与解读
本研究建立了大肠杆菌BCFA生产的微生物平台，将途径创新与系统级代谢工程相结合。最终工程菌株实现2.96 g/L BCFA产量，占总脂肪酸的55%，得率为0.08 g/g葡萄糖，较此前报道的研究有大幅提升（表S7）。该工作证明，协调前体供应、碳通量再分配、途径优化和宿主适应性的策略能够增强BCFA生物合成，为设计生产BCFA及相关先进生物燃料和化学品的微生物细胞工厂提供了宝贵见解。
编译者解读：本研究的核心价值在于发现了IV-CoA途径与BKD途径之间的协同效应——这不是简单叠加，而是2.6倍和13.8倍的显著放大，提示前体供给的"双通路"设计可能比单一途径强化更有效。从合成生物学应用角度看，最终2.96 g/L的产量虽较此前提升显著，但0.08 g/g葡萄糖的得率仍意味着大规模生产需要进一步优化碳流分配。此外，研究中通过删除多个副产物途径和引入NOG途径来缓解乙酸盐溢流的思路，对其它乙酰辅酶A衍生化学品的微生物生产具有直接借鉴意义。细胞稳健性工程（PcnB突变与rfaY/yafL过表达）作为产量提升的辅助手段，也提示在代谢工程中"让宿主更耐受"与"让途径更高效"同等重要。
参考来源
Hu M. Systems metabolic engineering of Escherichia coli for high-level branched-chain fatty acid production via dual precursor pathways. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102509
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102509