来源：Metabolic adaptation enabling D-xylose assimilation via the entner-doudoroff pathway in glycolysis-impaired Escherichia coli strains（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
大肠杆菌的EMP糖酵解是碳水化合物代谢的主要通路，但替代代谢路线可在特定遗传背景和碳源条件下被激活。本研究对缺失磷酸甘油酸激酶（Pgk）或烯醇化酶（Eno）的大肠杆菌菌株进行长期连续培养适应性进化，发现突变菌株通过激活Entner-Doudoroff途径实现了以D-木糖为唯一碳源的原养型生长。通过¹³C标记实验、全基因组突变鉴定及转录组/蛋白质组分析，揭示了多层级的调控与代谢适应机制，展示了适应性进化在优化代谢网络功能方面的潜力。
研究背景
生物碳同化依赖一套高度保守且相互关联的代谢通路，为生物量合成提供代谢中间体、还原力和能量。普遍存在的碳代谢途径包括糖异生、磷酸戊糖途径（PPP）和三羧酸（TCA）循环，而EMP糖酵解和Entner-Doudoroff途径是碳水化合物分解代谢的主要糖酵解路线。在工程微生物底盘细胞中，中心碳网络的代谢物通常是生物生产途径的起点，因此替代同化途径有望扩大可用前体代谢物的范围。然而，细胞代谢网络复杂且调控精密，对扰动的响应难以预测，这构成代谢工程的主要制约。本研究通过在E. coli中实施基因敲除扰动碳同化途径，探索代谢网络的可塑性。
研究方法
2.1 化学试剂
化学试剂一般购自Sigma-Aldrich。寡核苷酸由Eurofins（德国埃伯斯贝格）合成。筛选PCR使用DreamTaq聚合酶（Thermo Fisher Scientific）。基因克隆和缺失 cassette 的扩增使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（Takara）。
【数据】试剂来源：Sigma-Aldrich；寡核苷酸合成：Eurofins；PCR酶：DreamTaq（Thermo Fisher Scientific）、PrimeSTAR GXL（Takara）
2.2 培养基与培养条件
细菌常规在37°C有氧条件下于LB丰富培养基（1% NaCl、0.5%酵母提取物、1%胰蛋白胨）中培养，用于菌株保藏、克隆和分子遗传学操作。根据需要添加卡那霉素（25 μg/mL）、氨苄青霉素（100 μg/mL）、氯霉素（30 μg/mL）或链霉素（100 μg/mL）。培养基MX（M9 + 5 g/L酪蛋白氨基酸、40 mM琥珀酸、4 mM甘油）用于维持糖酵解缺失菌株Δeno和Δpgk。矿物MA培养基（31 mM Na₂HPO₄、25 mM KH₂PO₄、18 mM NH₄Cl、1 mM MgSO₄、40 μM次氮基三乙酸三钠、3 μM CaCl₂、3 μM FeCl₃·6H₂O、0.3 μM ZnCl₂、0.3 μM CuCl₂·2H₂O、0.3 μM CoCl₂·2H₂O、0.3 μM H₃BO₃、1 μM MnCl₂、0.3 μM CrCl₃·6H₂O、0.3 μM Ni₂Cl·6H₂O、0.3 μM Na₂MoO₄·2H₂O、0.3 μM Na₂SeO₃·5H₂O）用于长期连续培养。生长分析使用M9矿物盐培养基（50 mM Na₂HPO₄、20 mM KH₂PO₄、1 mM NaCl、20 mM NH₄Cl、2 mM MgSO₄、100 μM CaCl₂、134 μM EDTA、13 μM FeCl₃·6H₂O、6.2 μM ZnCl₂、0.76 μM CuCl₂·2H₂O、0.42 μM CoCl₂·2H₂O、1.62 μM H₃BO₃、0.081 μM MnCl₂·4H₂O）。矿物培养基根据后续说明补充不同碳源。
【数据】培养温度：37°C；LB培养基：1% NaCl、0.5%酵母提取物、1%胰蛋白胨；抗生素浓度：卡那霉素25 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL、氯霉素30 μg/mL、链霉素100 μg/mL；MX培养基：M9 + 5 g/L酪蛋白氨基酸、40 mM琥珀酸、4 mM甘油；MA培养基组分：31 mM Na₂HPO₄、25 mM KH₂PO₄、18 mM NH₄Cl、1 mM MgSO₄、40 μM次氮基三乙酸三钠、3 μM CaCl₂、3 μM FeCl₃·6H₂O、0.3 μM ZnCl₂、0.3 μM CuCl₂·2H₂O、0.3 μM CoCl₂·2H₂O、0.3 μM H₃BO₃、1 μM MnCl₂、0.3 μM CrCl₃·6H₂O、0.3 μM Ni₂Cl·6H₂O、0.3 μM Na₂MoO₄·2H₂O、0.3 μM Na₂SeO₃·5H₂O；M9培养基：50 mM Na₂HPO₄、20 mM KH₂PO₄、1 mM NaCl、20 mM NH₄Cl、2 mM MgSO₄、100 μM CaCl₂、134 μM EDTA、13 μM FeCl₃·6H₂O、6.2 μM ZnCl₂、0.76 μM CuCl₂·2H₂O、0.42 μM CoCl₂·2H₂O、1.62 μM H₃BO₃、0.081 μM MnCl₂·4H₂O
2.3 菌株、基因缺失与反向遗传学
本研究所用和构建的菌株均为SIJ488（Jensen et al., 2015）的衍生菌株，SIJ488是E. coli K12野生型菌株MG1655的衍生物。相关基因型和谱系列于补充表S1。染色体基因缺失通过λ Red介导的缺失cassette重组实现（Datsenko and Wanner, 2000）。以pKD3（氯霉素抗性）或pKD4（卡那霉素抗性）质粒为模板，使用携带50 bp长5′端同源臂的引物PCR扩增缺失cassette，同源臂与目标基因上下游区域同源。所用引物对列于补充表S2。P1噬菌体转导用于转移被抗性cassette替换的敲除基因，方法参照Miller法。转化pCP20质粒后通过flippase反应去除抗性cassette。在进化菌株中鉴定的突变基因通过P1噬菌体介导的共转导恢复为野生型，共转导标记为来自Keio E. coli敲除文库（Baba et al., 2006）的紧密连锁卡那霉素标记。转导DNA片段不抑制目标突变以外的任何突变，考虑突变位点之间的遗传距离。若基因组上距离较近（最多1.5分钟），转导子的序列一致性通过PCR扩增和测序验证。若两个突变距离过近，则应用λ Red介导的缺失cassette重组。在基因icd中引入点突变G101C通过多重自动化基因组工程（MAGE）诱变完成。将转化有温度敏感质粒pORTMAGE-2（Nyerges et al., 2016）（Addgene目录号72677）的菌株G6878单菌落在含氨苄青霉素的LB培养基中于30°C摇床过夜培养。启动MAGE循环时，将培养物以1:10稀释于相同培养基中，于30°C振荡培养至OD₆₀₀nm在0.5至1.0之间。随后将培养物转移至42°C振荡恒温水浴中15分钟，诱导蛋白MutL E32K和lambda-Red重组酶的表达。取2 mL培养物在冰上冷却10分钟，用预冷的10%甘油水溶液洗涤4次制备电转感受态细胞。将40 μL电转感受态细胞与0.5 μL诱变寡核苷酸储备液（500 μM）混合。寡核苷酸序列为5′-C∗AG AGA GCG AAT ACC GCC ACC AAC CGG AGT GGT CAG CGG ACA TTT AAT GGC AAC GCG ATA TTC ACG AAT CAG ATC AAG AGT TTC AGC AG∗G-3′，其中突变靶向的密码子以粗体标示，诱变核苷酸带下划线，星号表示硫代磷酸酯键。使用电转仪MicroPulser™（Bio-Rad）进行电转化，立即重悬于1 mL LB培养基中，于30°C轨道摇床1000 rpm恢复培养。孵育1小时后，细胞或用5 mL含氨苄青霉素的LB培养基稀释并继续孵育进行额外MAGE循环，或涂布LB平板获得单菌落，通过靶向icd位点的PCR扩增和PCR产物的Sanger测序分析基因型。所用PCR引物如下：fwd_icd 5′-CTA AAA GAA GTT TTT TGC ATG G-3′和rev-icd 5′-GTA GCC CCA GTC TTT AAA C-3′。连续进行了六轮MAGE循环，在第4、5和6轮后获得LB平板上的单菌落。第6轮中测试的40个克隆中有1个克隆携带预期的icd基因G101C突变。
【数据】菌株背景：SIJ488（E. coli K12 MG1655衍生物）；缺失方法：λ Red重组；缺失cassette模板：pKD3（氯霉素抗性）或pKD4（卡那霉素抗性）；同源臂长度：50 bp；转导方法：P1噬菌体；抗性cassette去除：pCP20 flippase；MAGE诱变菌株：G6878 + pORTMAGE-2；MAGE培养温度：30°C；诱导温度：42°C、15分钟；电转感受态制备：4次10%甘油洗涤；诱变寡核苷酸浓度：500 μM、0.5 μL；电转后恢复：1 mL LB、30°C、1000 rpm、1小时；MAGE循环数：6轮；icd突变：G101C；克隆筛选：40个克隆中1个阳性
2.4 长期连续培养
连续培养进化实验使用自动化GM3流体自清洁培养装置（Mutzel and Marlière, 2000）进行。菌株Δeno和Δpgk的预培养在补充10 mM D-木糖和10 mM琥珀酸的矿物MA培养基中获得，用于接种两个平行独立GM3装置的生长室（每室15 mL培养物）。通过培养容器持续通入无菌空气流保证恒定通气，并通过抵抗细胞沉降维持悬浮生长。培养物在37°C下于相同允许培养基中、恒化器状态下（稀释阈值设为80%透光率，对应OD₆₀₀nm≈0.4）培养至观察到稳定生长。随后细胞群体接受培养基交换方案（Marlière et al., 2011）。该方案使细菌群体逐步适应在初始非允许培养基（即补充10 mM D-木糖作为唯一碳源和能源的矿物MA培养基，称为胁迫培养基）中生长。每10分钟向培养物输送恒定体积的新鲜培养基。稀释率设定为对细胞群体施加表观日世代时间3.5小时。根据培养物浊度相对于设定OD阈值（OD₆₀₀nm≈0.4）的情况，培养物接受允许培养基（矿物MA培养基、10 mM D-木糖和10 mM琥珀酸）或胁迫培养基（矿物MA培养基、10 mM D-木糖）的供给。当OD₆₀₀nm超过阈值时注入胁迫培养基，否则注入允许培养基。培养物的每日记录数据见补充数据1。当细菌群体仅在D-木糖上稳定生长（100%初始非允许培养基）时，进料模式设为恒化器状态持续短时间（2-6天）。将进化细菌群体的样品划线于含D-木糖作为唯一碳源的半固体M9培养基平板上。单菌落再次划线于相同培养基。从单菌落获得克隆菌株并进一步分析。
【数据】培养装置：GM3流体自清洁装置；培养体积：15 mL/室；通气：无菌空气连续流；培养温度：37°C；稀释阈值：80%透光率（OD₆₀₀nm≈0.4）；培养基交换周期：每10分钟；表观日世代时间：3.5小时；OD阈值：OD₆₀₀nm≈0.4；稳定后恒化器时间：2-6天；允许培养基：MA + 10 mM D-木糖 + 10 mM琥珀酸；胁迫培养基：MA + 10 mM D-木糖
2.5 ¹³C同位素标记实验
进行稳态¹³C同位素示踪实验以推断进化菌株中的碳通量，实验设三次重复。如先前所述（Wenk et al., 2018），将2 mL在含10 mM D-葡萄糖-1-¹³C、D-葡萄糖-3-¹³C或D-葡萄糖-6-¹³C（Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴）作为唯一碳源的M9矿物培养基中生长的早期稳定期培养物离心…
【数据】标记底物：D-葡萄糖-1-¹³C、D-葡萄糖-3-¹³C、D-葡萄糖-6-¹³C（10 mM）；培养体积：2 mL；重复数：3次；培养阶段：早期稳定期
研究结果
3.1 适应性进化选择EMP受损菌株在D-木糖上的生长
采用长期连续培养方案研究在敲除菌株Δeno和Δpgk中，哪种可能的EMP糖酵解旁路——甲基乙二醛途径、丝氨酸支路、Entner-Doudoroff途径——会在选择压力下出现。正如预期，两种EMP受损菌株只有在提供两种碳源（分别供给被遗传阻断分隔的碳代谢上半部分和下半部分）时才能在最低培养基中生长。当以D-木糖和琥珀酸为碳源时，未进化菌株Δeno和Δpgk生长不良，表现出延长的迟滞期和低生物量产量（补充图S1）。对菌株Δeno（NGR9、NGR10）和Δpgk（NGR13、NGR14）各进行了两次独立进化实验，使用GM3自动化装置应用培养基交换培养方案（Marlière et al., 2011; Mutzel and Marlière, 2000）。该方案交替供给细菌群体补充10 mM D-木糖和10 mM琥珀酸（允许培养基）或仅10 mM D-木糖（非允许或胁迫培养基）的矿物培养基。培养模式在连续世代中维持最低浓度的琥珀酸，直到细菌不再需要该碳源来供给遗传阻断下游的碳代谢。菌株Δeno的两个平行培养物NGR9和NGR10进化为完全依赖含D-木糖作为唯一碳源的非允许培养基（图2；补充数据1）。培养物NGR9约500代、NGR10约700代后在D-木糖上出现稳定生长。对于菌株Δpgk的培养物，群体NGR13需要超过2000代才能在初始非允许培养基中达到稳定生长（图2；补充数据1）。培养物NGR14在相似时期内未能无需琥珀酸供给而生长，被终止。从在D-木糖上生长的细菌群体样品中获得分离株，并在补充D-木糖作为唯一碳源的M9培养基平板上繁殖。因此，连续培养中的定向进化过程选择了由基因eno或pgk敲除决定的下部糖酵解阻断的抑制，并恢复了在D-木糖上的原养型生长。分离的进化菌株也能在进入Δeno或Δpgk阻断上游中心碳代谢的其他碳源（甘油、D-葡萄糖、D-葡萄糖酸）上生长，表明所选择的代谢适应不限于D-木糖同化的特定途径（补充图S1）。然而，在甘油和D-葡萄糖上反复观察到长迟滞期，不同进化谱系和同一谱系的分离株之间可能存在差异。在琥珀酸上未观察到生长，表明在连续培养数百代期间，Δeno和Δpgk菌株中烯醇化酶或磷酸甘油酸激酶活性均未恢复。
【数据】进化实验：Δeno（NGR9、NGR10）、Δpgk（NGR13、NGR14）；稳定生长出现世代数：NGR9约500代、NGR10约700代、NGR13超过2000代；NGR14：未能在无琥珀酸条件下生长；碳源测试：D-木糖、甘油、D-葡萄糖、D-葡萄糖酸（可生长）、琥珀酸（不生长）
3.2 ¹³C标记实验表明进化分离株通过Entner-Doudoroff途径同化D-木糖
为了解从三个独立NGR培养物中分离的进化菌株中负责D-木糖同化的糖酵解旁路，使用蛋白质源氨基酸作为中心碳代谢网络中碳通量的探针进行¹³C标记实验。在大肠杆菌中，D-木糖一旦被激活为木酮糖-5-磷酸，主要通过磷酸戊糖途径的非氧化分支转化为代谢中间体果糖-6-磷酸（三分子D-木酮糖-5-磷酸产生两分子果糖-6-磷酸和一分子甘油醛-3-磷酸）。因此，D-木糖分解代谢途径与D-葡萄糖在很大程度上重叠，果糖-6-磷酸是EMP糖酵解上半部分的第一个中间体。为了避免转酮醇酶（Tkt）和转醛醇酶（Tal）活性引起的标记D-木糖分子中碳重排导致的复杂标记模式（图1），决定使用¹³C标记的D-葡萄糖而非¹³C标记的D-木糖进行标记实验，以便更容易解释结果。进化分离株NGR9 iso1、NGR10 iso2、NGR13 iso1（表现出可重复生长）以及野生型菌株SIJ488分别以D-葡萄糖-1-¹³C、D-葡萄糖-3-¹³C或D-葡萄糖-6-¹³C同位素体作为唯一碳源培养。分析了蛋白质源氨基酸丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸和组氨酸的¹³C标记，其代谢前体来源于中心碳代谢的不同部分。丝氨酸来源于糖酵解中间体3-磷酸甘油酸。丙氨酸由丙酮酸转氨形成，缬氨酸来源于两分子丙酮酸的缩合，其中一分子以其羧酸碳原子形式失去CO₂。在组氨酸中，α-氨基丙酰基的碳原子和咪唑环4、5位的碳原子来源于一分子核糖-5-磷酸（磷酸戊糖途径的中间体），而咪唑环2位的碳原子来自一碳供体丝氨酸（Cβ）或甘氨酸（Cα）。野生型菌株SIJ488中观察到的氨基酸¹³C标记与通过EMP糖酵解进行葡萄糖分解代谢的预期标记模式相符（补充图S2）。丝氨酸和丙氨酸的¹³C标记谱非常相似，无论细菌在哪种¹³C-D-葡萄糖同位素体上生长，标记和未标记分子的比例几乎相等（图3）。这与以下事实一致：由于菌株SIJ488中EMP糖酵解功能正常，3-磷酸甘油酸（丝氨酸前体）和丙酮酸无差别地来源于葡萄糖的C1C2C3或C4C5C6部分，这是果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（Fba）和磷酸三糖异构酶（Tpi）作用的结果（图1）。然而，当菌株SIJ488以D-葡萄糖-1-¹³C而非D-葡萄糖-6-¹³C培养时，标记的丙氨酸或丝氨酸分子比例略低。这种差异可以通过磷酸戊糖途径氧化分支的部分碳通量以及葡萄糖酸-6-磷酸脱氢酶（gnd编码）催化的葡萄糖酸-6-磷酸氧化脱羧导致葡萄糖C1碳的丢失来解释（Gonzalez et al., 2017）。虽然丙酮酸预期均匀地未标记或单次标记（如¹³C标记丙氨酸的比例所示），但缬氨酸的代谢标记随葡萄糖分子中¹³C原子的位置而变化（图3）。以D-葡萄糖-1-¹³C和D-葡萄糖-6-¹³C培养EMP功能正常的菌株SIJ488导致未标记、单次标记和双次标记的缬氨酸分子以25/50/25比例混合；以D-葡萄糖-3-¹³C培养导致未标记和单次标记的缬氨酸分子量相等。这与丙酮酸分别在C3原子或羧基C1原子上被标记一致（补充图S2）。因此，缬氨酸的标记谱是丙酮酸分子中¹³C碳原子位置的指标。受损下部EMP糖酵解的两种旁路——甲基乙二醛途径和丝氨酸支路——预期产生相同的标记模式，与EMP功能正常的野生型菌株中观察到的模式无法区分（补充图S3）。相比之下，在Δeno遗传背景中通过Entner-Doudoroff途径同化¹³C标记的葡萄糖应产生丝氨酸的特征性标记谱（补充图S4A），因为3-磷酸甘油酸来源于葡萄糖的C4C5C6部分，通过Eda催化的中间体2-酮-3-脱氧葡萄糖酸-6-磷酸（KDGP）裂解为…
【数据】标记实验菌株：NGR9 iso1、NGR10 iso2、NGR13 iso1、SIJ488（野生型）；标记底物：D-葡萄糖-1-¹³C、D-葡萄糖-3-¹³C、D-葡萄糖-6-¹³C（10 mM）；分析氨基酸：丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、组氨酸；SIJ488缬氨酸标记比例（1-¹³C和6-¹³C）：25/50/25（未标记/单标记/双标记）；SIJ488缬氨酸标记（3-¹³C）：未标记与单标记等量
3.3 进化菌株的突变鉴定与组学分析
（原文该部分内容在提供的节选中未完整呈现，以下基于可获得的原文内容进行编译）
在三个独立进化培养物（NGR9、NGR10、NGR13）的分离株中鉴定到多个关键代谢酶和转录调控因子的突变。这些突变涉及中心碳代谢的多个代谢分支点，包括磷酸戊糖途径、TCA循环以及糖异生相关基因。对进化分离株的转录组和蛋白质组分析显示，与野生型菌株SIJ488相比，在D-木糖指数生长期中，中心碳代谢相关基因的转录本（T）和蛋白质（P）水平发生了显著变化。热图分析揭示了不同进化谱系之间在基因表达和蛋白质丰度层面的趋同与差异模式。
3.4 反向遗传学验证关键突变的功能
为验证进化菌株中鉴定的突变对D-木糖生长的贡献，将NGR9 iso1菌株中鉴定的关键突变基因逐一恢复为野生型版本，并在含10 mM D-木糖和10 mM琥珀酸（左图）或仅10 mM D-木糖（右图）的最低培养基上测定生长曲线。结果表明，将这些基因恢复为野生型后，菌株在仅含D-木糖的培养基上的生长能力受到不同程度的影响，证实了这些突变对D-木糖同化的重要贡献。
讨论与解读
本研究表明，缺失烯醇化酶或磷酸甘油酸激酶活性的E. coli菌株可通过选择性长期连续培养方案进化出绕过EMP糖酵解的D-木糖同化途径。所需表型——以D-木糖为唯一碳源生长——在数百代后出现，表明需要积累多个突变才能在选择压力下产生D-木糖原养型。三个独立进化谱系和两种遗传背景的分离株在突变谱上表现出显著的趋同性。代谢¹³C标记实验证实，所有测试分离株中Entner-Doudoroff途径被激活，该途径主要驱动遗传阻断下游碳代谢的通量，而甲基乙二醛途径和丝氨酸支路的贡献仅占边缘地位。这一发现与先前结果形成对比（Iacometti et al., 2022），后者曾提出不同观点。
编译者解读
本研究通过长期适应性进化策略，展示了代谢网络在缺失核心糖酵解酶时的惊人可塑性。选择Entner-Doudoroff途径而非理论上更简短的甲基乙二醛途径或丝氨酸支路，提示进化更倾向于选择与现有代谢网络整合度更高、调控更协调的解决方案。从合成生物学应用角度看，这种进化策略可作为一种通用平台，用于挖掘非天然代谢路线——尤其值得关注的是，进化菌株对多种碳源的广谱适应性暗示了中心碳代谢的整体重构，这为设计具有灵活碳源利用能力的工业底盘菌株提供了新思路。然而，数百代的进化时间成本及NGR14培养物的失败也提醒我们，该策略的效率仍有优化空间。
参考来源
Iacometti C. Metabolic adaptation enabling D-xylose assimilation via the entner-doudoroff pathway in glycolysis-impaired Escherichia coli strains. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102504
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102504