来源：Metabolic engineering of Escherichia coli for the high-level production of putrescine（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
腐胺是工程塑料制造中的重要平台化合物。本研究以大肠杆菌W3110衍生菌株XQ52为基础，通过适应性实验室进化（ALE）获得耐受75 g/L腐胺的AXQ52菌株，再结合启动子优化、异源基因表达与代谢通路精细调控，最终构建的工程菌株在补料分批发酵中产腐胺72.7 g/L，产率0.25 g/g葡萄糖，生产强度1.28 g/L/h，为迄今报道的微生物生产腐胺最高水平。
研究背景
腐胺（1,4-二氨基丁烷）是重要的大宗化学品，广泛用于药物、表面活性剂的生产，尤其作为尼龙46（PA46）和PA410等工程塑料合成的单体。目前工业上腐胺的生产依赖石油化工路线——丙烯腈加氢氰酸生成丁二腈，再经氢化制得。该工艺条件苛刻、能耗高，亟需可持续替代方案。微生物发酵生产腐胺因此受到广泛关注。腐胺的天然生物合成有两条主要途径：（i）鸟氨酸直接脱羧；（ii）鸟氨酸经精氨酸的五步转化。已有多种微生物宿主被改造用于腐胺发酵生产，如暗色产黑色素 Aureobasidium melanogenum 经途径（i）改造后批次发酵产26.9 g/L腐胺；钝齿棒杆菌 Corynebacterium crenatum 经途径（ii）优化精氨酸通量后，补料分批发酵达41.5 g/L。然而，腐胺对宿主细胞的毒性始终是限制产量进一步提升的关键瓶颈。
研究方法
2.1 菌株
本研究所用菌株汇总于表1。XQ52菌株作为腐胺生产的基础菌株，大肠杆菌DH5α主要用于克隆操作。谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032 用作 argJ 和 pyc 基因的基因组来源。
【数据】菌株：XQ52（腐胺生产基础菌株）、DH5α（克隆宿主）、C. glutamicum ATCC 13032（argJ/pyc基因来源）
2.2 质粒构建
本研究所用质粒汇总于表1，PCR引物列于表S1，由Genotech（韩国大田）合成。为构建携带靶向 glnA 基因的合成sRNA操纵子的质粒，以p15SpeC-S112SargF为骨架，使用引物对100glnAF/R、105glnAF/R、115glnAF/R和117glnAF/R从先前构建的质粒中扩增对 glnA 基因具有不同抑制强度的sRNA操纵子。各扩增产物分别克隆至p15SpeC-S112SargF的NaeI位点，生成p15SpeC-S112SargF-S100SglnA、p15SpeC-S112SargF-S105SglnA、p15SpeC-S112SargF-S115SglnA和p15SpeC-S112SargF-S117SglnA。为表达谷氨酸棒杆菌的 argJ 和 pyc 基因，以p15SpeC-S112SargF-S100SglnA为表达骨架，用引物对p15speCargJF/R和p15speCpycF/R分别从谷氨酸棒杆菌基因组DNA扩增 argJ 和 pyc 基因，PCR产物克隆至p15SpeC-S112SargF-S100SglnA的PstI位点，分别生成p15speCargJ-S112SargF-S100SglnA和p15speCpyc-S112SargF-S100SglnA。为构建无抗生素抗性表达质粒，将hok/sok毒素-抗毒素稳定系统引入p15speCargJ-S112SargF-S100SglnA。hok/sok片段用引物hoksokFwd/Rev从pAX15-hok1质粒扩增，插入质粒的BglI位点，生成p15speCargJ-S112SargF-S100SglnAhs。
【数据】sRNA启动子：Bba_J23100/J23105/J23115/J23117；克隆位点：NaeI、PstI、BglI；引物合成：Genotech
2.3 遗传操作
基因敲除和启动子替换所用引物列于表S1。大肠杆菌染色体基因缺失和启动子替换采用一步基因失活法。简要而言，基因敲除或启动子替换的线性DNA片段通过两步PCR生成，包含靶位点两侧100 bp同源臂。PCR模板包括pECmulox、pMtrc9或其衍生物（pM1009、pM1059、pM1159和pM1179），视目的而定。所得线性DNA片段通过电穿孔导入携带λ-Red重组酶表达质粒pKD46的大肠杆菌菌株，电穿孔使用Gene Pulser（Bio-Rad），参数为：2.5 kV、200 Ω、25 μF，2-mm间距电转杯。
【数据】同源臂长度：100 bp；电转参数：2.5 kV、200 Ω、25 μF；电转杯间距：2 mm
2.4 培养条件
质粒构建和菌株开发过程中的常规培养使用LB液体培养基或LB平板（1.5%（w/v）琼脂），按需添加抗生素。抗生素终浓度如下：氨苄青霉素50 μg/mL、卡那霉素25 μg/mL、氯霉素17 μg/mL。摇瓶培养在MR培养基（pH 6.8）中进行，添加1.6 g/L酵母提取物（BD Bacto™，货号：212750）、9 g/L (NH₄)₂SO₄和20 g/L葡萄糖，37°C、200 rpm旋转摇床培养24 h。MR培养基成分为：6.67 g/L KH₂PO₄、4 g/L (NH₄)₂HPO₄、0.8 g/L MgSO₄·7H₂O、0.8 g/L柠檬酸、5 mL/L微量元素溶液。微量元素溶液每升含：0.5 M HCl、10 g FeSO₄·7H₂O、2 g CaCl₂、2.2 g ZnSO₄·7H₂O、0.5 g MnSO₄·4H₂O、1 g CuSO₄·5H₂O、0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、0.02 g Na₂B₄O₇·10H₂O。补料分批发酵在1.2 L DasGip平行生物反应器（Eppendorf）中进行，工作体积0.5 L，37°C，培养基与摇瓶培养相同。种子培养：细胞在含10 mL LB培养基（含适当抗生素）的25 mL试管中37°C、200 rpm过夜培养；随后取1 mL过夜培养物转接至含50 mL MR培养基的摇瓶中，相同条件下培养12 h，用于接种生物反应器。pH通过添加28%（v/v）氨水自动维持在6.80。补料液含650 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO₄·7H₂O、170 g/L (NH₄)₂SO₄和6 mL/L微量元素溶液。溶解氧（DO）通过0.5 L/min空气供应和200–1000 rpm搅拌速度调节维持在40%空气饱和度。当pH超过6.82时立即添加补料液。进行两次独立补料分批发酵以确认可重复性，主图展示其中一次代表性发酵结果，另一次独立重复的结果见补充图。
【数据】LB琼脂：1.5%（w/v）；氨苄青霉素：50 μg/mL；卡那霉素：25 μg/mL；氯霉素：17 μg/mL；摇瓶培养基：MR + 1.6 g/L酵母提取物 + 9 g/L (NH₄)₂SO₄ + 20 g/L葡萄糖；温度：37°C；转速：200 rpm；时间：24 h；反应器工作体积：0.5 L；pH：6.80；氨水浓度：28%（v/v）；补料液：650 g/L葡萄糖 + 8 g/L MgSO₄·7H₂O + 170 g/L (NH₄)₂SO₄；DO：40%空气饱和度；通气：0.5 L/min；搅拌：200–1000 rpm
2.5 ALE与突变株筛选
XQ52菌株在LB培养基中过夜培养后，用于接种三个250 mL带挡板摇瓶，每瓶含50 mL MR培养基，添加50 g/L腐胺并用HCl调pH至6.8。培养起始OD₆₀₀为0.02，37°C、200 rpm振荡培养。每12 h测量光密度，每个传代周期培养2天。每次传代取三个重复中OD₆₀₀最高的培养物1 mL接种至含新鲜培养基的下一摇瓶。当OD₆₀₀连续三次传代稳定超过1.0时，后续传代的腐胺浓度提高2.5 g/L。选择过程持续约100天，最终获得适应75 g/L腐胺的培养物。获得能在75 g/L腐胺中存活的群体后，将细胞涂布于含75 g/L腐胺的MR琼脂平板上分离单菌落。共选取200个较大菌落，接种至微孔板中100 μL含20 g/L葡萄糖、1.6 g/L酵母提取物和75 g/L腐胺的MR培养基中。微孔板在37°C下使用BioScreen C生长分析系统（Oy Growth Curves Ab Ltd，芬兰）持续振荡培养，每12 h监测各突变株细胞生长，共84 h，评估高腐胺条件下的相对耐受性与适应性。
【数据】起始腐胺浓度：50 g/L；最终腐胺浓度：75 g/L；起始OD₆₀₀：0.02；转速：200 rpm；每代培养时间：2天；浓度递增幅度：2.5 g/L；总时长：约100天；筛选菌落数：200个；监测时长：84 h
2.6 XQ52与AXQ52菌株全基因组测序
XQ52和AXQ52菌株的基因组分别使用Illumina HiSeq 2500系统（Illumina，San Diego，CA）和PacBio RS II系统（Pacific Biosciences，Menlo Park，CA）测序。全基因组测序、de novo组装和注释由Macrogen（韩国首尔）完成。XQ52菌株共产生8,684,012条Illumina总读数，对应1,311,285,812个总读长碱基；质量过滤后保留5,553,094条总读数（835,799,194个总读长碱基）用于基因组校正。PacBio测序产生60,160条总亚读长，共500,473,214个亚读长碱基，N50为13,192 bp。使用HGAP3流程组装。XQ52菌株组装染色体长4,626,632 bp，GC含量50.8%。AXQ52菌株Illumina测序产生8,910,368条总读数，对应1,345,465,568个总读长碱基；过滤后5,941,470条总读数（897,161,970个总读长碱基）用于基因组校正。PacBio测序产生116,788条总亚读长，共1,091,603,573个亚读长碱基，N50为12,789 bp。AXQ52组装染色体长4,626,008 bp，GC含量50.8%。随后使用Pilon（v1.21）结合Illumina读数进行错误校正。基因组注释使用Prokka（v1.13）。XQ52与AXQ52菌株的比较基因组分析使用breseq流程进行。
【数据】XQ52 Illumina读数：8,684,012条/1,311,285,812碱基；过滤后：5,553,094条/835,799,194碱基；PacBio亚读长：60,160条/500,473,214碱基；N50：13,192 bp；染色体长度：4,626,632 bp；GC含量：50.8%。AXQ52 Illumina读数：8,910,368条/1,345,465,568碱基；过滤后：5,941,470条/897,161,970碱基；PacBio亚读长：116,788条/1,091,603,573碱基；N50：12,789 bp；染色体长度：4,626,008 bp；GC含量：50.8%
研究结果
3.1 单质粒表达系统的构建
前期研究中，XQ52菌株携带两个质粒——p15SpeC-S112SargF和pKK105SglnA——分别用于过表达 speC 基因以及利用sRNA敲低 argF 和 glnA 基因。由于pKK105SglnA的唯一功能是sRNA介导的 glnA 基因抑制，本研究将该sRNA操纵子整合至p15SpeC-S112SargF质粒，构建单质粒系统。该策略旨在降低质粒维持负担并消除双重抗生素筛选需求，推动工业可行性。pKK105SglnA（pMB1复制起点，15–20拷贝/细胞）的拷贝数高于p15SpeC-S112SargF（p15A复制起点，10–12拷贝/细胞），因此整合sRNA操纵子后，质粒剂量的变化可能影响敲低效率。为精细调控sRNA对 glnA 基因的抑制，构建了四个不同强度Anderson启动子（Bba_J23100、Bba_J23105、Bba_J23115和Bba_J23117）驱动的合成sRNA变体，分别生成p15SpeC-S112SargF-S100SglnA、-S105SglnA、-S115SglnA和-S117SglnA。通过补料分批发酵评估各构建体的性能。其中，PUT1菌株（XQ52携带p15SpeC-S112SargF-S100SglnA质粒）获得最高腐胺产量46.9 g/L，超过双质粒亲本菌株的42.3 g/L（图2A）。其余构建体产量均低于40 g/L（图S1），证实精细调控 glnA 基因表达以调节副产物谷氨酰胺通量对最大化腐胺合成至关重要（图1）。PUT1菌株细胞密度OD₆₀₀达68.8，为双质粒系统的1.38倍，表明代谢负担有所缓解。相应地，生产强度从1.27 g/L/h提升至1.68 g/L/h。尽管产率从0.228 g/g葡萄糖略降至0.194 g/g，这可能是碳通量更多流向生物量形成所致。基于上述结果，p15SpeC-S112SargF-S100SglnA质粒被选用于后续所有实验。
【数据】PUT1最高产量：46.9 g/L；双质粒菌株产量：42.3 g/L；PUT1 OD₆₀₀：68.8（双质粒的1.38倍）；生产强度：1.68 g/L/h（双质粒1.27 g/L/h）；产率：0.194 g/g葡萄糖（双质粒0.228 g/g）；其他构建体产量：均<40 g/L
3.2 转运蛋白工程对耐受性改善的评估
前期研究中，大肠杆菌K-12 W3110菌株在暴露于0.6 M腐胺二盐酸盐（约52.9 g/L腐胺）时立即裂解。这一现象与本研究观察一致——PUT1菌株在达到最大腐胺产量后产量和细胞密度均急剧下降（图2A），表明毒性是进一步提高产量的关键瓶颈。转运蛋白工程被广泛用于通过增强外排或阻断抑制性代谢物摄入来缓解毒性。前期工作中已在XQ52菌株中改造了两个天然转运蛋白：敲除 PuuP（腐胺输入蛋白）和过表达 PotE（腐胺/鸟氨酸反向转运体）（图1）。为进一步探索转运蛋白相关策略，本研究考察了大肠杆菌中其他介导腐胺转运的蛋白，包括输入蛋白（PotABCD、PotFGHI、YdcSTUV、YeeF）和输出蛋白（YtfL、SapBCDF）（图2B）。各输入蛋白在XQ52菌株中分别单独敲除，生成XQ52pA、XQ52pF、XQ52yS和XQ52yF菌株。同样，编码输出蛋白的 sapBCDF 和 ytfL 基因通过trc启动子替换实现过表达，生成XQ52sB和XQ52yL菌株。所有工程菌株均转化p15SpeC-S112SargF-S100SglnA质粒并在摇瓶培养中评估。在测试的变体中，仅PUT2菌株（XQ52yS携带p15SpeC-S112SargF-S100SglnA质粒）表现出改善，产量达3.63 g/L，而对照XQ52菌株为2.25 g/L（图2C）。其他转运蛋白改造均未提高产量。随后对PUT2菌株进行补料分批发酵（图2D）。然而，腐胺产量降至31.2 g/L，伴随乙酸大量积累（26.9 g/L）。这一结果反映了转运蛋白工程常见的局限性——膜蛋白修饰可能造成代谢负担并损害细胞适应性。尽管 ydcSTUV 的破坏在摇瓶培养中有利，但该改善未能转化至补料分批规模。该结果与之前关于1,3-二氨基丙烷的研究一致——输出蛋白过表达在摇瓶中提高产量，但在补料分批发酵中反而降低产量。
【数据】0.6 M腐胺二盐酸盐：约52.9 g/L腐胺；PUT2摇瓶产量：3.63 g/L；对照XQ52摇瓶产量：2.25 g/L；PUT2补料分批产量：31.2 g/L；乙酸积累：26.9 g/L
3.3 通过ALE开发腐胺耐受型大肠杆菌菌株
为增强腐胺耐受性，以XQ52菌株为亲本进行ALE。细胞最初在含50 g/L腐胺的MR培养基中培养。在100天期间进行连续传代，逐步提高腐胺浓度。该过程获得能在75 g/L腐胺存在下维持生长的进化群体（图3A）。随后，将最终适应群体的细胞涂布于含75 g/L腐胺的MR琼脂平板。选取200个直径较大的菌落，在含75 g/L腐胺的MR培养基微孔板中培养。培养84 h后，选择80个生长优异的分离株进行进一步评估（图S2）。将80个进化分离株各转化p15SpeC-S112SargF-S100SglnA质粒，在摇瓶培养中测试腐胺产量。其中4株（分离株编号7、23、47和68）产量高于其他菌株（图S3A）。这4个候选菌株经补料分批发酵评估生产能力。其中，PUT3菌株（分离株23携带p15SpeC-S112SargF-S100SglnA质粒）表现最佳，产腐胺61.7 g/L，产率0.195 g/g葡萄糖，生产强度1.47 g/L/h，超越了大肠杆菌的天然耐受阈值（图3B）。分离株7也超过该阈值，产量54.8 g/L；分离株47和68分别达44.2和46.8 g/L（图S4）。这些结果表明，耐受性提升并不总能转化为生产能力提升。分离株23表现出最佳生产性能，被命名为AXQ52菌株并用于后续工程改造。
【数据】ALE起始腐胺浓度：50 g/L；终点浓度：75 g/L；时长：100天；筛选菌落：200个；优选分离株：80个；PUT3产量：61.7 g/L；产率：0.195 g/g葡萄糖；生产强度：1.47 g/L/h；分离株7产量：54.8 g/L；分离株47：44.2 g/L；分离株68：46.8 g/L
3.4 AXQ52菌株基因组测序与逆向工程
为阐明AXQ52菌株耐受性增强的遗传基础，进行全基因组测序，发现相对亲本XQ52菌株存在14个突变（表2）。值得注意的是，多个突变位于膜相关功能基因中，包括 dppB、cpxA、yfjW、ycjP 和 fhuA，分别编码二肽转运蛋白、传感器组氨酸激酶、预测内膜蛋白、糖ABC转运蛋白通透酶和铁色素外膜转运蛋白。为确定各突变对腐胺耐受性的贡献，将每个突变单独引入XQ52背景菌株，在60 g/L腐胺条件下评估生长。结果显示，携带DppB A25T/S45T、CpxA V134M、YcjP Y139S和FhuA F632\*突变的菌株生长改善（最终OD₆₀₀分别为0.55、0.72、0.34和0.45），而YfjW G202D突变影响可忽略（最终OD₆₀₀=0.04），与XQ52菌株（最终OD₆₀₀=0.03）相似（图3C）。单突变衍生菌株的产量也高于亲本XQ52菌株，进化菌株AXQ52在摇瓶培养中产量最高（图S3B）。
【数据】突变总数：14个；60 g/L腐胺下最终OD₆₀₀：DppB A25T/S45T=0.55；CpxA V134M=0.72；YcjP Y139S=0.34；FhuA F632*=0.45；YfjW G202D=0.04；XQ52对照=0.03
讨论与解读
本研究系统展示了一条从"耐受性突破"到"产量优化"的完整策略链。腐胺对大肠杆菌的毒性是限制产量的首要瓶颈——初始尝试通过膜蛋白工程（转运蛋白敲除/过表达）提升耐受性，结果在补料分批中反而减产并伴随乙酸积累。转向ALE后，经100天适应性进化获得耐受75 g/L腐胺的AXQ52菌株，产量突破60 g/L。全基因组测序揭示14个突变，逆向工程确认膜相关基因（dppB、cpxA、ycjP、fhuA）的突变贡献了适应性优势。进一步通过优化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Ppc）表达水平、引入异源鸟氨酸乙酰转移酶、破坏谷氨酸脱羧酶等策略，最终菌株产腐胺72.7 g/L，产率0.25 g/g葡萄糖，生产强度1.28 g/L/h。
编译者解读
该研究的亮点在于将ALE与逆向工程相结合——先用进化"暴力"突破耐受瓶颈，再用基因组测序精准定位贡献突变，这种"进化+理性设计"的闭环思路值得借鉴。AXQ52菌株中膜蛋白突变（如CpxA组氨酸激酶）提示细胞通过重构膜应激响应来适应高浓度腐胺，这一机制认识对其它胺类化合物生产菌株的改造具有迁移价值。值得注意的是，单质粒系统替代双质粒后产量提升，说明质粒负担在工业发酵中不可忽视。局限在于ALE终点75 g/L后无法进一步突破，且转运蛋白工程在放大中失效的问题仍未解决——这提示未来或需在膜蛋白表达水平与发酵条件的协同优化上下功夫。
参考来源
Ko Y-S. Metabolic engineering of Escherichia coli for the high-level production of putrescine. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.01.006
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.01.006