来源：Development of bifunctional biosensors for sensing and dynamic control of glycolysis flux in metabolic engineering（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
糖酵解是生命体最核心的代谢通路，其通量平衡直接决定微生物细胞工厂的生产效率。本研究基于转录因子Cra与果糖-1,6-二磷酸（FBP）的天然识别机制，构建了一系列正响应和负响应糖酵解通量生物传感器，并通过对Cra蛋白的过表达和配体结合域突变实现了响应阈值与动态范围的精细调谐。该传感器不仅能够实时表征胞内FBP浓度，还被成功应用于甲羟戊酸（MVA）和N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）两条合成途径的动态调控，最终在1L发酵罐中实现了111.3 g/L的MVA产量。
研究背景
代谢工程通过对细胞代谢进行定向改造，重新分配碳流、能量和电子，以最大化微生物在产量和生产率方面的表现。代谢通量需要在不破坏细胞稳态的前提下进行精细重编程。为了克服静态永久敲除途径的缺陷，基于代谢物响应型转录调控的动态通量重布线已被引入微生物细胞工厂，用于代谢通量的自主动态控制。此外，多种基因编码生物传感器已被开发用于响应外部环境信号（O₂、温度、pH）和细胞内状态（代谢物、生长期、应激反应、氧化还原状态）。然而，其中仅有少数传感器能够响应中心代谢物，如丙酮酸、D-赤藓糖-4-磷酸和甘油酸-3-磷酸，用于精细调控糖酵解及中心代谢相关化学品的合成。糖酵解是细胞代谢的基础途径，如何提高糖酵解速率和碳得率是代谢工程领域的共同关注点。
研究方法
2.1 菌株与质粒构建
本研究使用的所有菌株和质粒分别汇总于补充表2和补充表3。分子克隆和质粒操作在大肠杆菌DH5α中进行。所有寡核苷酸序列列于补充表4。质粒构建使用高保真DNA聚合酶（TaKaRa，日本），菌落聚合酶链反应（PCR）使用2×Taq MasterMix（CWBIO，中国）。
质粒pL01的构建方法如下：以质粒Ptrc为模板，使用引物p01-backbone-F/p01-backbone-R通过PCR扩增获得pL01的骨架片段；以pDMG1为模板（Zhang等，2020），使用引物P01-gfp-F1/P01-gfp-F2/P01-gfp-R扩增gfp片段、其启动子P_pfkA及gfp片段的同源臂。随后，将gfp片段与pL01骨架进行Gibson组装（Gibson, 2011）。将组装产物转化至DH5α菌株，通过菌落PCR和测序验证质粒的正确性。
pL02-pL10的获得方法为：使用T4 PNK和T4连接酶处理后转化大片段，该片段通过9组修饰启动子引物（P02–F/P02-R1/P02-R2至P10–F/P10-R1/P10-R2）替换pL01的gfp启动子。pL11-pL14通过在pL09和pL10基础上，以P23113和P23102启动子控制cra基因表达获得。pL19-pL30同样经T4 PNK和T4连接酶处理，用另外12个修饰启动子替换pL01的天然gfp启动子。pL31-pL34的构建方法与pL11-pL14相同，区别在于引物不同，其在pL19和pL25基础上以P23113和P23102启动子表达cra基因。
菌株S01–S35通过将质粒pL01-pL35转化至菌株BW-pfkA获得。所有涉及基因组基因敲除和启动子替换的实验均采用同源重组方法。为验证糖酵解通量生物传感器，构建了一系列具有不同糖酵解通量的大肠杆菌菌株，在E. coli BW25113中分别敲除染色体基因pfkA、ptsG和pykF。
对于GlcNAc生物合成的动态调控，使用敲除了nag、ackA、poxB、ldhA和nan的菌株DN5（Pang等，2020）进行GlcNAc生产。通过同源重组将启动子整合至菌株DN5基因组中。使用负响应生物传感器控制的启动子Ppam（pL19）和Ppar（pL25）替换基因pfkA的天然启动子，分别获得菌株DN5-IM和DN5-PM。菌株DN5-IM和DN5-PM转化质粒pBac用于GlcNAc生产。类似地，正响应生物传感器控制的启动子PM23107（pL09）被设计用于从质粒pBac扩增glmS和GNA1基因的引物中。所得片段与pBac骨架组装成质粒pBacm。此外，从pL18克隆正响应生物传感器控制的启动子PR23107-cra（pL18）及带有P23102启动子的cra基因，所得片段组装至pBacm骨架形成pBacar。菌株DN5转化质粒pBacm和pBacar分别获得菌株DN5-GM和DN5-GAR。菌株DN5-IM转化质粒pBacm和pBacar分别获得菌株DN5-IMM和DN5-IMAR。
对于EP-bifido菌株中MVA生物合成的动态调控，将zwf的天然启动子替换为更强的启动子P23109，获得菌株BW-P_zwf::P23109。随后，将BW-P_zwf::P23109中的P_pfkA启动子分别替换为两个负响应生物传感器控制的启动子Ppam（pL19）和Ppar（pL25），分别获得菌株BW-PMT和BW-PR。对照菌株BW-P_zwf::P23109、BW25113ΔpfkA以及动态调控菌株BW-PMT、BW-PR转化质粒pFF和pBSA用于MVA生产。
【数据】菌株：E. coli DH5α、BW25113、DN5；质粒：pL01-pL35、pBac、pBacm、pBacar、pFF、pBSA；工具酶：高保真DNA聚合酶（TaKaRa）、2×Taq MasterMix（CWBIO）；基因敲除：pfkA、ptsG、pykF、nag、ackA、poxB、ldhA、nan；启动子替换：P23109、Ppam（pL19）、Ppar（pL25）、PM23107（pL09）、PR23107-cra（pL18）
2.2 培养条件
大肠杆菌DH5α用于克隆，在Luria-Bertani（LB）培养基中37°C通气培养。LB培养基成分：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl。本研究使用M9培养基进行生物传感器表征（g/L）：Na₂HPO₄·12H₂O，15.6；KH₂PO₄，3；NaCl，1；NH₄Cl，1；MgSO₄·7H₂O，0.494；CaCl₂·H₂O，0.0153；FeSO₄·7H₂O，0.01；酵母提取物，2。维生素B1添加至终浓度10 μg/mL。表征生物传感器时，菌株先在LB培养基中培养，然后转接至M9培养基。
GlcNAc发酵：50-mL摇瓶培养以2%接种量从5-mL LB培养物开始，随后在改良terrific broth培养基（12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）中于37°C、220 rpm条件下发酵。必要时添加抗生素（100 μg/mL氨苄青霉素、50 μg/mL卡那霉素、17 μg/mL氯霉素和100 μg/mL壮观霉素）。
MVA生产：50-mL摇瓶培养同样以2%接种量从5-mL LB培养物开始。50-mL培养物含MVA发酵培养基（含0.2%酵母提取物、40 g/L葡萄糖），在30°C旋转摇床（120 rpm）中振荡84小时。MVA发酵培养基成分（g/L，除非另有说明）：Na₂HPO₄·12H₂O，17.1；KH₂PO₄，3.0；NaCl，3.0；NH₄Cl，1.0；酵母提取物，5.0；柠檬酸，0.2；MgSO₄，1.0 mM；CaCl₂，0.1 mM；盐酸硫胺素，0.008；D-(+)-生物素，0.008；烟酸，0.008；吡哆醇，0.032；以及1 mL/L微量元素溶液。微量元素溶液成分（g/L）：NaCl，10；柠檬酸，40；ZnSO₄·7H₂O，1.0；MnSO₄·H₂O，30；CuSO₄·5H₂O，0.1；H₃BO₃，0.1；Na₂MoO₄·2H₂O，0.1；FeSO₄·7H₂O，1.0；CoCl₂·6H₂O，1.0。
生物反应器中MVA生产：携带质粒pFF和pMVA的大肠杆菌菌株BW-PR首先接种至50 mL含100 μg/mL氨苄青霉素和100 μg/mL壮观霉素的LB培养基中，37°C、220 rpm振荡培养12小时。随后收集过夜种子培养物，洗涤并重悬于MVA发酵培养基中。所得种子培养物以初始光密度（OD；600 nm）0.05转接至含MVA发酵培养基的1-L发酵罐。通过自动补加30% NH₄OH和2 M HCl维持pH为7。空气流量设定为1.5 v.v.m.，通过级联搅拌（400–500 rpm）控制溶解氧浓度在30%饱和度以上。培养温度控制在30°C。当残余葡萄糖降至10 g/L以下时补加葡萄糖（40 g/L）。
GlcNAc发酵：50-mL摇瓶培养以2%接种量从5-mL LB培养物开始，随后在改良terrific broth培养基（12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）中于37°C、220 rpm条件下发酵。当DN5的残余葡萄糖耗尽时（36小时），补加葡萄糖（20 g/L）。
【数据】LB培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl；M9培养基：Na₂HPO₄·12H₂O 15.6 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L、NaCl 1 g/L、NH₄Cl 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.494 g/L、CaCl₂·H₂O 0.0153 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L、酵母提取物 2 g/L、维生素B1 10 μg/mL；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素、50 μg/mL卡那霉素、17 μg/mL氯霉素、100 μg/mL壮观霉素；MVA发酵：40 g/L葡萄糖、30°C、120 rpm、84 h；发酵罐：1-L、初始OD600 0.05、pH 7、空气流量1.5 v.v.m.、溶解氧>30%、搅拌400–500 rpm、30°C；GlcNAc发酵：37°C、220 rpm、36 h补加20 g/L葡萄糖
2.3 Cra蛋白氨基酸突变以增强效应物亲和力
本研究中涉及的Cra蛋白突变包括正响应生物传感器和负响应生物传感器。生物传感器突变体pL15-pL18以质粒pL11-pL14为模板获得。突变氨基酸设计在引物中，通过PCR使用引物p-Cra-m-F/p-Cra-m-R生成大片段。随后，经T4 PNK和T4连接酶处理后转化E. coli DH5α，从而获得pL15-pL18。为构建质粒pL35，以pL34为基础，使用引物p-Cra-m-F/p-Cra-m-R经PCR生成大片段，经T4 PNK和T4连接酶处理后转化E. coli DH5α。
【数据】突变位点：R57K + A58T + G59Q + R60Q；模板质粒：pL11-pL14（→pL15-pL18）、pL34（→pL35）；工具酶：T4 PNK、T4连接酶
2.4 荧光测量
（原文此节内容未在节选中完整呈现，具体操作步骤原文未详述）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 正响应糖酵解通量生物传感器的设计
在大肠杆菌中，Cra响应FBP激活糖异生相关基因并抑制糖酵解相关基因，FBP的浓度可反映糖酵解通量（Cozzone和El-Mansi, 2005; Ramseier等, 1995; Sarkar等, 2008）。因此，基于FBP、转录因子Cra和Cra调控启动子之间的关系，可以设计和构建糖酵解通量生物传感器（图1A和C）（Chin等, 1989; Frei等, 2016; Ramseier等, 1993; Saier和Ramseier, 1996）。随着糖酵解通量或FBP浓度的变化，FBP分子与Cra结合并使其从DNA上解离，从而激活/抑制下游报告基因（图1B和D）。当Cra作为下游报告基因的阻遏物时，生物传感器的荧光正向反映FBP浓度，因此该生物传感器被称为正响应生物传感器。相反，当Cra作为激活因子时，生物传感器的荧光与FBP浓度呈负相关。在这种情况下，该生物传感器可称为负响应生物传感器，无需使用反转基因电路即可直接用于下调代谢途径。
我们从Ecocyc数据库中分析了大肠杆菌中全部47个Cra-DNA结合位点（Cra-box）（补充表1）。Cra在其中10个位点作为激活因子，在其他位点作为阻遏因子。为构建正响应糖酵解通量生物传感器，选择pfkA（编码6-磷酸果糖激酶I）和fruB（编码果糖特异性PTS）的启动子，克隆至报告基因gfp上游，获得质粒pL01和pL06（图2A）。同时，将P_pfkA和P_fruB的Cra结合位点（Cra-box）分别置于Ptac和P23107启动子的−35与−10区域之间以及−10区域下游，获得质粒pL02-pL05和pL07-pL10（图2A）。
剂量-响应曲线通过向培养物中添加不同浓度的FBP（0–400 mM）进行表征。为消除胞内过量FBP对检测的影响，细胞在以乙酸盐为唯一碳源的M9培养基中培养。通过表征，携带P23107和O_fruB的生物传感器pL09和pL10表现出正响应和更大的动态范围（1.41和1.46倍）（补充图1），被选作进一步性能提升的候选。基因组上cra的单拷贝表达似乎远不足以抑制质粒所有拷贝数的启动子。此外，凝胶迁移实验表明，Cra与P_fruB的Cra-box的结合亲和力是所有Cra-box中最强的（Shimada等, 2005），因此FBP几乎不能使Cra从DNA上解离。
为扩大生物传感器的动态范围，首先通过在pL09和pL10上过表达Cra来调节Cra的表达水平。通过将cra亚克隆至P23113和P23102启动子控制下构建质粒pL11-pL14（补充图2）。出乎意料的是，所有四种生物传感器均表现出荧光值随FBP浓度增加而下降的趋势。作为双功能全局转录因子，Cra以不确定的分子机制调控转录，我们无法对激活与阻遏之间的转换机制给出非常明确的解释。但我们推测Cra在大多数情况下通常作为激活因子发挥作用。我们假设cra的过表达可能影响Cra与TFBS的结合，也可能影响Cra与RNA聚合酶之间的相互作用模式。
为进一步优化响应方式，通过诱变修饰了Cra的配体结合能力。相关报道证明，Cra的R57K + A58T + G59Q + R60Q突变可以增强Cra的FBP结合能力（Wei等, 2016），因此将该突变引入pL11-pL14以构建质粒pL15-pL18（图2B和补充图3）。四种生物传感器分别表现出左移的响应阈值58、60、140和85 mM（图2C）。该结果表明，修饰转录因子也是优化生物传感器性能的可行策略。
总体而言，获得了一系列具有大动态范围和不同FBP浓度阈值的正响应糖酵解通量生物传感器（图2E）。由于体外FBP浓度可能无法反映通量生物传感器的真实响应阈值，我们使用生物传感器pL18检测了胞内FBP浓度与荧光值之间的剂量-响应关系（图2D和补充图4B）。将数据拟合至Hill方程后，发现pL18的体内FBP响应阈值为36.86 mmol g⁻¹细胞干重。从pL01到pL18的响应曲线证明了基于Cra的生物传感器对FBP的配体响应特异性逐步提高。
【数据】FBP浓度范围：0–400 mM；pL09动态范围：1.41倍；pL10动态范围：1.46倍；pL15-pL18响应阈值：58、60、140、85 mM；pL18体内FBP响应阈值：36.86 mmol g⁻¹细胞干重；Cra突变：R57K + A58T + G59Q + R60Q
3.2 负响应生物传感器的精确调谐
由于Cra在大肠杆菌中许多Cra调控启动子上作为激活因子发挥作用（Shimada等, 2011），因此可以利用这些Cra激活启动子的Cra-box构建负响应糖酵解通量生物传感器。凝胶迁移实验表明，Cra对所有Cra-box序列的结合亲和力各不相同（Shimada等, 2005）。使用不同Cra-box构建的通量生物传感器可能改变基础输出（Mannan等, 2017）。因此，将来自ppsA、icd、pck、aceB、crp和aroP启动子的6个修饰Cra-box序列，即ppsA-m（GGTGAATCGTTCAAGGAA）、icd-m（AGCTGAATCGTTCAACCT）、pck-m（TGGTGAATCGTTCAATTA）、aceb-m（TCGTGAATCGTTCAAGCA）、crp-m（GCTGAATCGTTCAACC）和arop-m（AATTGAATCGTTCAA），分别置于P23107启动子的−35与−10区域之间以及−10区域下游，构建12个人工启动子，形成质粒pL19-pL30。
对所有12种生物传感器进行表征后，pL19、pL23、pL24、pL25、pL26和pL28表现出随FBP浓度增加荧光明显下降的趋势，表明构建成功（图3A）。与其它传感器相比，pL19和pL25被验证具有较低的基础泄漏表达（图3A）。结果表明，Cra对6种不同cra-box的结合能力差异显著。DNA与Cra之间的适当亲和力可确保基因表达的严谨性，有利于动态调控。此外，pL19和pL25的低水平基础泄漏表明其具有高动态范围（5051和4353倍）和降低的响应阈值（16.5和39 mM）。我们的结果表明，改变转录因子结合位点（TFBS）的序列特征可以改变其与Cra的结合亲和力，从而改变生物传感器的基础输出。
此外，对Cra的表达数量和配体结合能力进行了修饰。随后在质粒pL19和pL25上分别以P23113和P23102控制过表达Cra，并将gfp的调控启动子P23107替换为更强的启动子Ptac，获得pL31-pL34（补充图5）。进一步地，根据正响应生物传感器的设计，将CraR57K + A58T + G59Q + R60Q突变引入pL34，所得质粒（pL35）与pL34相比表现出降低的响应阈值和增大的动态范围（从1.67增至9.88）（图3B）。最终，获得了一系列具有大动态范围、不同响应阈值和极小基础泄漏的负响应糖酵解通量生物传感器（图3C）。
【数据】修饰Cra-box：ppsA-m、icd-m、pck-m、aceb-m、crp-m、arop-m；pL19动态范围：5051倍，响应阈值16.5 mM；pL25动态范围：4353倍，响应阈值39 mM；pL35动态范围：9.88（vs pL34的1.67）；启动子替换：P23107→Ptac
3.3 构建的糖酵解通量生物传感器的验证
为验证糖酵解通量生物传感器，我们构建了若干具有不同糖酵解通量的大肠杆菌BW25113菌株。具体而言，分别敲除pykF、ptsG和pfkA，获得菌株BW-pykF、BW-ptsG和BW-pfkA。这三个基因是糖酵解中的关键基因，其敲除（原文此部分内容在节选中未完整呈现，后续内容原文未详述）
【数据】菌株：BW-pykF、BW-ptsG、BW-pfkA；敲除基因：pykF、ptsG、pfkA
讨论与解读
动态控制已被应用于途径工程中，以根据传感信号的变化合理分配胞内资源，优化生物合成效率，避免代谢负担、浪费和毒性积累（Brockman和Prather, 2015; Gutteridge等, 2007）。在微生物发酵中，高糖酵解速率导致溢流代谢（Shimizu和Matsuoka, 2019），而低糖酵解速率则导致生长效率低下。因此，理解和控制糖酵解通量对于提高生物合成效率至关重要。以往很少有研究关注能够感知糖酵解代谢物的生物传感器的设计和构建，这是因为中心代谢物缺乏天然的转录调控因子。近期仅有两项研究报道了响应糖酵解代谢物的生物传感器开发：一项研究利用计算机辅助设计创建了响应D-赤藓糖-4-磷酸和甘油酸-3-磷酸的人工转录因子（Ding等, 2020），另一项研究探索了丙酮酸生物传感器PdhR以生成遗传电路，用于重编程枯草芽孢杆菌的中心碳代谢（Xu等, 2020）。在本研究中，设计并构建了一种糖酵解通量生物传感器。该传感器能够感知糖酵解通量，并以及时、精确的方式动态调控糖酵解途径通量。由于FBP的特殊性，它可以同步调控多条代谢途径，这为代谢工程中糖酵解通量的动态控制提供了有力工具。
编译者解读
本研究巧妙利用了天然转录因子Cra的双功能特性——既能作为阻遏物又能作为激活因子——在同一框架下构建了正响应与负响应两类传感器，避免了额外的信号反转电路设计。通过组合启动子工程、转录因子过表达和配体结合域突变三种策略，系统性地调谐了传感器的响应阈值和动态范围，这种多维度的优化思路值得借鉴。尤其值得关注的是，传感器被成功应用于两个不同化学品的生产途径中，展示了其通用性。不过，研究中观察到Cra过表达导致响应方向反转的现象，说明该转录因子的调控机制仍未被完全理解，这可能是未来优化中需要面对的挑战。从合成生物学应用角度看，将代谢物传感与动态调控集成于同一分子模块的策略，为构建更智能的微生物细胞工厂提供了新范式。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2021
DOI: 10.1016/j.ymben.2021.09.011
DOI: 10.1016/j.ymben.2021.09.011